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QPCR: Contabilizando diferentes massas de amostra ao interpretar e comparar Ct

QPCR: Contabilizando diferentes massas de amostra ao interpretar e comparar Ct


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Estou tentando usar qPCR para quantificar a quantidade de uma espécie de bactéria específica no escarro do paciente, mas realmente não tenho a opção de usar quantidades consistentes de escarro para eluir o DNA. O qPCR funciona bem, mas depois de obter os resultados do Ct, qual é a melhor maneira de explicar o fato de estar usando diferentes massas de escarro?


Se você estiver sempre usando uma quantidade relativa de seu rendimento de entrada para cada amostra, precisará corrigir seus valores de Ct para o rendimento absoluto de DNA de cada amostra. Se você não puder medir o rendimento de DNA de cada amostra, terá apenas que assumir que depende diretamente da massa de entrada de escarro. Essa suposição é bastante falha, pois as medições diretas de DNA são muito mais exatas e não são afetadas por vieses de diferenças de eficiência de extração de DNA ou efeitos de lote.

Uma vez que os valores de Ct representam um único ciclo de qPCR na fase linear em que o DNA alvo é duplicado, você precisa ajustar os valores de CT em +1 para amostras com meia entrada de DNA e em -1 para amostras com entrada dupla (ou geralmente $ Ct_ {ajustado} = Ct - log_2 (fator de entrada) $ ) É claro que este método de normalização assume que o conteúdo relativo de seu DNA alvo na amostra é independente do rendimento total da amostra (o que pode ou não ser verdade; se sua espécie específica de bactéria está proliferando bastante mais em um paciente em comparação com o outro, isso pode afetar as quantidades relativas e absolutas de DNA).


Assista o vídeo: Interpretando resultado de qPCR (Dezembro 2022).