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Razão para usar o promotor induzível para expressão heteróloga

Razão para usar o promotor induzível para expressão heteróloga


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Os protocolos muitas vezes parecem usar promotores reguláveis ​​ao expressar um gene heterólogo em um hospedeiro como a levedura, onde eles adicionam algo como IPTG para induzir a expressão (digamos) do promotor lac.

Existe uma razão para fazer isso em vez de usar um promotor constitutivo? isto é, há razão para pensar que os promotores reguláveis ​​(induzíveis) têm níveis de expressão mais elevados do que os promotores constitutivos?

Em outras palavras, qual a utilidade de ter um "switch" externo, ou seja, o IPTG para ativar a expressão sob demanda em vez de apenas aumentar o nível de expressão padrão usando um promotor que não requer indução?

O objetivo aqui é a síntese de pequenas biomoléculas por fermentação industrial de uma levedura transgênica.

Protocolo de exemplo:

Células L21 Star ™ (DE3) E. coli (Invitrogen) foram cotransformadas com os plasmídeos pACYCDuet-4506 e Ct94-pETDuet e as células transformadas foram selecionadas em carbenicilina (50 μg / ml) cloranfenicol (34 μg / ml) LB-agarose pratos. Colônias únicas foram usadas para inocular 5 mL de meio LB com 50 μg / mL de carbenicilina e 34 μg / mL de cloranfenicol. A cultura foi incubada durante a noite a 37 ° C. No dia seguinte, 2 mL de meio TB suplementado com os mesmos antibióticos foram inoculados com 0,2 mL da cultura durante a noite. Após 6 horas de incubação a 37 ° C, a cultura foi resfriada até 28 ° C e 1 mM de IPTG, 2 mg / mL de mevalonato (preparado pela dissolução de mevalonolactona (Sigma) em 0,5N de NaOH a uma concentração de 1 g / mL e incubação da solução por 30 minutos a 37 ° C) e 0,2 mL de decano foram adicionados a cada tubo. As culturas foram incubadas por 48 horas a 28 ° C. As culturas foram então extraídas duas vezes com 2 volumes de acetato de etila, a fase orgânica foi concentrada para 500 μL e analisada por GC-MS como descrito acima no Exemplo 3. Nessas condições, o sesquiterpeno produção acima de 200 mg / L foi rotineiramente alcançada. Beta-santalene foi produzido.


Os promotores heterólogos freqüentemente expressam genes que são tóxicos para o organismo quando expressos em quantidades muito altas. Quando os genes são expressos constitutivamente, o organismo cresce lentamente ou morre antes de atingir uma alta densidade adequada para a produção da proteína.

Como tal, não se trata de expressar os genes o tempo todo, mas de expressar a quantidade máxima de produto gênico no menor período de tempo. Não faz sentido que as células expressem o produto do gene o tempo todo, se não conseguirem atingir densidades suficientes primeiro. Mais produto será feito se as células crescerem até uma densidade relativamente alta, induzindo então a expressão em todas elas. Isso permitiria níveis de produção relativamente grandes em um curto período de tempo.


Assista o vídeo: expressão heteróloga (Dezembro 2022).