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Promotor estável e forte?

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Preciso de um promotor de mamífero que mantenha a expressão estável por meio da diferenciação.

Eu estava planejando originalmente empregar UbC para este projeto específico, no entanto, novas informações de um experimento diferente vieram à tona e agora eu preciso de um promotor que tenha estabilidade extrema e alta resistência (como você sabe, UbC é conhecido por sua expressão muito baixa cotações).

Algum de vocês tem sugestões? Talvez eu deva procurar uma espécie de promotor híbrido ...

Obrigado,

CDB


Parece haver uma grande quantidade de recursos para ajudar o OP.

Addgene tem uma página sobre o tópico com lista e descrição de promotores comuns utilizáveis ​​em vários organismos: Plasmídeos 101: A região do promotor

O livro de biofísica experimental menciona alguns promotores úteis também, ou esta revisão.

Surpreendentemente, houve alguma análise quantitativa da força do promotor: Comparação sistemática de promotores constitutivos e do promotor indutível por doxiciclina, bem como esforço para sintético mais forte (versão de CMV) Projeto sintético de promotores fortes

Minha conclusão é que os promotores virais ou CAG (com base na actina de frango) podem ser candidatos úteis. Mas não se pode esperar expressão ubíqua e uniforme em vários tipos de tecidos / células sem um cassete de expressão de ajuste fino.


Promotor estável e forte? - Biologia

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Resumo gráfico

A lagarta do cartucho, Spodoptera frugiperda, nativa das Américas, está se tornando uma praga mundial, causando danos a várias safras (Jing et al., 2019). S. frugiperda A linha celular Sf9 foi desenvolvida a partir dos ovários e os Sf21 selecionados de Sf9 foram amplamente utilizados para a produção de proteínas recombinantes (Davis et al., 1993 McCall et al., 2005). Transfecção transitória de construtos de plasmídeo nessas células (Chang et al., 2018 Shen et al., 2014), seleção de células estáveis ​​de células transfectadas (Fernandes et al., 2012 Kempf et al., 2002) e sistema de vetor de expressão de baculovírus (BEVS) (Smith et al., 1983) são comumente usados ​​para produzir proteínas recombinantes nessas células. Promotores de genes virais iniciais, OpIE1 (Theilmann e Stewart, 1991), OpIE2 (Theilmann e Stewart, 1992) e hr5 /ie1 (Jarvis et al., 1996) são os promotores mais comumente usados ​​na expressão baseada em plasmídeo em S. frugiperda células. No entanto, níveis de expressão mais baixos de proteínas estranhas são uma limitação no uso desses promotores virais (Chang et al., 2018 Zhao e Eggleston, 1999). Os promotores endógenos demonstraram suportar altos níveis de produção de proteínas em Drosophila melanogaster Células S2 (Angelichio et al., 1991). Portanto, promotores endógenos altamente ativos de S. frugiperda poderia aumentar a expressão de proteínas recombinantes em S. frugiperda linhas de celular. Os promotores de genes virais tardios altamente ativos, p10 e poliedrina suportam altos níveis de expressão de proteínas através do uso de baculovírus em S. frugiperda células portanto, este sistema é amplamente utilizado para a expressão de proteínas recombinantes (Hill-Perkins e Possee, 1990). No entanto, a expressão de proteínas recombinantes ocorre no estágio final da infecção por baculovírus, quando a maquinaria de síntese de proteínas nas células hospedeiras já foi prejudicada (Schultz e Friesen, 2009), e isso resulta em processamento ineficiente e modificação pós-tradução de proteínas recombinantes ( Jarvis et al., 1993 Jarvis e Summers, 1989 Schultz e Friesen, 2009). Os promotores endógenos altamente ativos podem facilitar a expressão de proteínas recombinantes durante os estágios iniciais da infecção por baculovírus, resultando em melhorias no processamento e modificação pós-tradução de proteínas recombinantes.

Promotores derivados de insetos hospedeiros têm sido usados ​​com sucesso na condução da expressão do transgene em insetos modelo, incluindo Tribolium castaneum (Eckermann et al., 2018 Lorenzen et al., 2002 Rylee et al., 2018), Aedes aegypti (Anderson et al., 2010 De Valdez et al., 2011 Li et al., 2017), e Bombyx mori (Sakai et al., 2016 Tamura et al., 2000 Xu et al., 2019), que ajudou na pesquisa básica e aplicada sobre esses insetos. Diversos S. frugiperda promotores foram identificados por transcriptoma e análise de genoma de células Sf21, no entanto, nenhum deles superou o promotor viral inicial OpIE2 em células Sf21 (Bleckmann et al., 2015). Nós identificamos anteriormente vários promotores indutíveis por calor ativos em células Sf9, e dois deles eram mais robustos do que OpIE2 promotor, mas menos ativo do que hr5 /ie1 promotor (Chen et al., 2020). Para identificar S. frugiperda promotores que são mais ativos do que os promotores virais usados ​​comercialmente, analisamos um conjunto de genes altamente expressos a partir dos transcriptomas de dois S. frugiperda linhas celulares e três tecidos. O desempenho de potenciais promotores de genes altamente expressos foi avaliado em células Sf9 e Sf17. Os promotores que mostraram maior atividade do que o promotor comercialmente usado (hr5 /ie1) foram avaliados adicionalmente por transgenes de expressão transiente e estável em células Sf9 e FAW usando sistemas de expressão baseados em plasmídeo e baculovírus, respectivamente. Esses estudos identificaram dois altamente ativos S. frugiperda promotores que seriam úteis para a expressão de proteínas, edição de genoma e produção de insetos transgênicos em FAW e outros insetos lepidópteros.


Resultados e discussão

Seleção de promotores fortes endógenos de P. mendocina NK-01 via análise de RNA-seq e previsão do promotor

Para a análise de RNA-seq, o nível de transcrição de um gene está positivamente correlacionado com o valor RPKM 26. Por meio da análise de RNA-seq de P. mendocina NK-01, os níveis de transcrição de todos os genes foram classificados de alto a baixo com base em seus valores RPKM. Os primeiros 30 genes classificados por valores RPKM foram considerados altamente ativos no nível transcricional (Tabela S1). Assim, as regiões a montante dos 30 genes com altos valores de RPKM foram selecionadas como os alvos de detecção para a predição do promotor. Por meio de triagem adicional usando um software de predição de promotor online, 10 de 30 sequências candidatas foram identificadas como as sequências promotoras putativas (Fig. S1) e selecionadas para clonagem e caracterização subsequentes (Tabela 1).

Clonagem de promotores fortes de P. mendocina NK-01

As regiões promotoras dos 10 genes altamente expressos foram amplificados por PCR a partir do DNA genômico de P. mendocina NK-01. Para obter a sequência promotora intacta de cada um dos 10 genes altamente expressos, neste trabalho, toda a região intergênica entre o gene altamente expresso e seu gene a montante foi selecionada como a região alvo a ser clonada por PCR, exceto para a ligação ribossomal nativa site (RBS). Os resultados do sequenciamento de DNA mostraram que os fragmentos de DNA clonados coincidiram com as regiões intergênicas selecionadas no nível de nucleotídeo (dados não mostrados).

Caracterização dos promotores clonados via qPCR

Para avaliar as forças dos promotores clonados, as sequências de promotores foram fundidas à extremidade 5 'do amplificado gfp gene e, em seguida, inserido em um vetor de clonagem de ampla gama de hospedeiros pBBR1MCS-2 capaz de se replicar em várias bactérias gram-negativas 27 usando recombinação homóloga (Fig. 1). qPCR foi empregado para a análise dos níveis de transcrição de gfp sob diferentes promotores em diferentes fases de crescimento, isto é, fase log inicial (6 h), fase log posterior (12 h) e fase estacionária (15 h) (Fig. S2). Entre os 10 promotores testados, os níveis de transcrição dos cinco promotores P4, P6, P9, P16 e P25 foram muito maiores do que os de laca promotor em diferentes fases de crescimento. Comparado com laca promotor, o promotor mais forte P4 mostrou um aumento de 36 vezes na atividade transcricional na fase estacionária (Fig. 2). Ao detectar com a maioria dos promotores clonados, os níveis de transcrição do gene repórter gfp variou significativamente em diferentes fases de crescimento. Os cinco promotores fortes P4, P6, P9, P16 e P25 tiveram níveis de transcrição mais elevados na fase pós-log do que na fase estacionária ou na fase inicial do log (Fig. S3). Em contraste, diferenças relativamente menores nos níveis de transcrição foram detectadas com os cinco promotores fortes entre a fase estacionária e a fase log inicial (Fig. S3). O promotor P16 teve uma atividade transcricional relativamente estável ao longo do período de crescimento (Fig. S3). Em estudos anteriores, diferentes tipos de promotores, incluindo promotores fortes, promotores dependentes da fase de crescimento e promotores constitutivos, foram bem caracterizados 10,13. Devido à boa compatibilidade do sistema com a célula hospedeira, a seleção de promotores endógenos pode ser mais prática e objetiva para suas aplicações em biologia sintética e engenharia metabólica do próprio hospedeiro.

Plasmídeos recombinantes para caracterização do promotor com gfp como um gene repórter. (uma) Plasmídeo recombinante com um laca promotor como um controle. (b) Plasmídeos recombinantes para caracterizar as intensidades de 10 promotores endógenos selecionados.

Caracterização dos promotores escolhidos e laca promotor via análise qPCR. Transcrição de gfp gene sob diferentes promotores em P. mendocina O NKU foi quantificado em diferentes fases de crescimento. O gene 16S rDNA foi usado como referência interna. O valor de transcrição relativo de gfp gene sob laca o promotor foi definido como 1. Os dados representam os valores médios ± desvios padrão de medições em triplicado de três experiências independentes. De um aluno t-teste foi realizado entre laca promotor e promotores escolhidos. * e ** indicam P & lt 0,05 e P & lt 0,01, respectivamente.

Os promotores P17, P18 e P29 tiveram altos valores de RPKM na análise de RNA-seq, mas os promotores colocados no plasmídeo exibiram níveis de transcrição mais baixos do que laca promotor em qualquer fase de crescimento (Fig. 2). Os promotores endógenos escolhidos funcionam bem no genoma, o que pode ser atribuído à assistência de sequências regulatórias próximas. Uma vez que os promotores foram clonados separadamente, eles não funcionaram bem.

Uma vez que se esperava que os promotores endógenos selecionados fossem usados ​​para melhorar a produção de PHA, os dados de RNA-seq foram obtidos com P. mendocina cultivado em meio de fermentação PHA. Para a caracterização dos promotores clonados por um ensaio do gene repórter, o meio LB comumente usado para os vários ensaios do gene repórter também foi selecionado para este estudo 11,13. Os promotores bem caracterizados no meio LB também podem ter o potencial de serem aplicados para a síntese de outros produtos em P. mendocina. No entanto, os níveis de transcrição dos 10 promotores candidatos obtidos por análise de RNA-seq podem nem sempre ser consistentes com os níveis de transcrição medidos por qPCR devido às diferentes condições de cultura. Por exemplo, os promotores P17, P18 e P29 tiveram altos valores de RPKM na análise de RNA-seq, mas exibiram níveis transcricionais mais baixos no ensaio do gene repórter do que laca promotor em qualquer fase de crescimento. No futuro, mais dados de RNA-seq com base em diferentes condições de cultura devem ser considerados em geral para selecionar os promotores candidatos. Então, através da caracterização dos promotores putativos por um ensaio de gene repórter em meio LB, os promotores endógenos fortes rastreados podem ter uma aplicação de ampla gama para vários produtos em P. mendocina.

Caracterização dos promotores clonados via medição de fluorescência GFP

Para determinar ainda mais os níveis de expressão dos promotores endógenos selecionados, as intensidades de fluorescência relativas foram medidas em três fases de crescimento diferentes. Como mostrado na Fig. 3, os cinco promotores fortes P4, P6, P9, P16 e P25 caracterizados por qPCR também tiveram intensidades de fluorescência relativa maiores do que laca promotor em qualquer fase de crescimento. P4 teve a intensidade de fluorescência relativa mais forte entre os 10 promotores selecionados, que mostrou um aumento de quase 32 vezes em comparação com laca promotor na fase estacionária. Para cada um dos cinco promotores fortes acima, uma diferença significativa na intensidade da fluorescência de GFP foi observada em diferentes estágios de crescimento, o que estava de acordo com os resultados anteriores sobre os níveis de transcrição instáveis ​​de gfp medido por qPCR (Fig. S3). Todos os resultados sugerem que os níveis de expressão dos cinco promotores fortes podem não ser constantes ao longo de todo o ciclo de crescimento (Fig. 3). As ordens de força do promotor refletidas pelo qPCR em tempo real e pelo repórter GFP foram idênticas ao resultado obtido por RNA-seq (valor RPKM), que demonstrou que os resultados da análise de sequenciamento do transcriptoma e dos experimentos de validação funcional foram altamente consistentes.

Caracterização dos promotores escolhidos e laca promotor via medições de intensidade de fluorescência de GFP. Expressão de gfp gene sob diferentes promotores em P. mendocina O NKU foi quantificado em diferentes fases de crescimento. A expressão de fundo foi subtraída e a intensidade de fluorescência relativa foi calculada por normalização contra por OD600 de células inteiras. Os dados representam os valores médios ± desvios padrão de medições em triplicado de três experiências independentes. De um aluno t-teste foi realizado entre laca promotor e promotores escolhidos. * e ** indicam P & lt 0,05 e P & lt 0,01, respectivamente.

Curiosamente, o nível transcricional relativo de P25 foi superior ao de P6, P9 e P16 (Fig. 2), mas a intensidade de fluorescência relativa de P25 foi inferior à de P6, P9 e P16 (Fig. 3). As intensidades relativas de fluorescência dos promotores restantes P17, P18, P20, P23 e P29 foram menores do que as de laca promotor em qualquer fase de crescimento, embora P20 e P23 mostraram níveis de transcrição mais elevados do que laca promotor. As observações sugerem que o alto nível de transcrição de um gene pode não levar necessariamente à síntese de alto nível dessa proteína codificada pelo gene. Para manter a consistência da eficiência de iniciação da tradução, neste estudo, o mesmo RBS foi introduzido a montante do gene repórter gfp. Entre os vetores do gene repórter, a distância entre as sequências promotoras previstas e RBS foi diferente entre si, o que pode afetar a eficiência da tradução do mRNA, podendo levar à discrepância entre o nível de transcrição e a intensidade de fluorescência. Por exemplo, a distância entre as sequências promotoras previstas e RBS para P25 eram maiores do que para P6, P9 e P16. Esse pode ser o motivo pelo qual P25 apresentou maior nível de transcrição, mas menor intensidade de fluorescência do que P6, P9 e P16. Além disso, as diferenças nas sequências espaçadoras entre o promotor e o RBS podem ser a segunda razão para as diferentes tendências entre o nível de transcrição e a intensidade de fluorescência.

Quando observado por microscopia confocal, as células expressando gfp sob o controle de P4, P6, P9, P16 e P25 produziram fluorescência verde mais brilhante do que as células de controle com gfp expressão sob o controle de laca. As células produziram fluorescência verde fraca quando gfp a expressão foi conduzida por P23 e P20. No entanto, a fluorescência verde não foi observada nas células quando a expressão de gfp estava sob o controle de P17, P18 e P29 (Fig. 4). Os resultados do microscópio confocal combinaram bem com os da medição da intensidade de fluorescência GFP.

Caracterização dos promotores escolhidos e laca promotor via microscópio confocal. (UMA) Fluorescência verde dentro da célula. (B) Contorno da membrana celular por coloração com FM4-64 / L. (C) A e B fundidos. Todas as imagens foram tiradas na mesma condição de exposição.

Em um estudo anterior, um conjunto de promotores sintéticos, que é capaz de expressão estável e constitutiva de genes a jusante, foi aplicado para a expressão de genes heterólogos calibrados em P. putida KT2440 usando um vetor de transposon de entrega mini-Tn7 que insere os promotores no genoma de P. putida 28 Em outro estudo, diferentes promotores indutíveis foram caracterizados pela construção de vetores ProUSER-repórter para uso em P. putida KT2440, e a produção de p-ácido cumárico em P. putida O KT2440 foi aprimorado pelo uso de promotores indutíveis selecionados para a otimização da expressão da via 29. Neste trabalho, os cinco promotores endógenos fortes P4, P6, P9, P16 e P25 foram identificados a partir de P. mendocina NK-01 usando um pipeline que consiste em análise de RNA-seq e nível de transcrição e medições de intensidade de fluorescência de um gene repórter gfp. Até o momento, muito pouco se sabe sobre a seleção de promotores fortes do gênero Pseudomonas usando uma estratégia baseada em RNA-seq.

Produção aprimorada de PHA por superexpressão phaC usando os fortes promotores em P. mendocina NKU

O operon sintético mcl-PHA de P. mendocina O NK-01 foi exposto na pesquisa anterior. Nosso estudo mostrou que PhaC1 é o principal contribuinte para a síntese de mcl-PHA em P. mendocina NK-01 23. Consequentemente, a superexpressão de genes de PHA sintase, especialmente o phaC1 gene, pode ter uma influência positiva no acúmulo de mcl-PHA. O Standard European Vector Architecture Database (SEVA) desenvolveu uma série de vetores de plasmídeo para engenharia metabólica e biologia sintética em Pseudomonas e outras bactérias gram-negativas 30,31. No entanto, os sistemas de expressão de plasmídeo tendem a ser um fardo para as bactérias, especialmente quando vários genes são necessários para serem coexpressos em uma bactéria. Neste trabalho, os 3 promotores endógenos fortes P4, P6 e P16 foram selecionados para a superexpressão de genes de PHA sintase por inserção não marcada de promotores a montante do phaC1 gene no genoma de P. mendocina NKU. Este processo não deixou nenhuma sequência redundante no genoma, exceto as sequências promotoras inseridas (Fig. 5). Esta estratégia de edição de genoma sem cicatrizes pode conferir algumas vantagens sobre a superexpressão de plasmídeo phaC genes.

O diagrama esquemático de construção para inserir os promotores a montante de phaC1 gene e para nocaute de phaZ no genoma de P. mendocina NKU.

Através da inserção cromossômica dos 3 promotores fortes endógenos P4, P6 e P16, os níveis de transcrição de phaC1 e phaC2 nas cepas recombinantes NKU-4C1, NKU-6C1 e NKU-16C1 foram todas melhoradas em comparação com a cepa NKU. Em particular, phaC1 mostrou uma melhoria mais óbvia do que phaC2 (Fig. 6). Isso pode ser devido ao fato de que phaC1 está mais perto dos promotores inseridos do que phaC2.

Análise de qPCR e resultados de fermentação de PHA para as cepas NKU-4C1, NKU-6C1, NKU-16C1 e NKU. Níveis transcricionais de phaC1 (uma), phaC2 (b) e phaZ (c) para as diferentes cepas. (d) Peso seco celular (CDW) e produção de PHA para as cepas. Amostras para qPCR foram coletadas em 36 h de fermentação de PHA. O nível de transcrição para a cepa NKU foi definido como 1.% em peso foi definido como a proporção de PHA para CDW. Os dados representam os valores médios ± desvios padrão de medições em triplicado de três experiências independentes. De um aluno t-teste foi realizado entre NKU e os mutantes. * e ** indicam P & lt 0,05 e P & lt 0,01, respectivamente.

Além disso, o phaZ localizado entre phaC1 e phaC2 apresentaram altos níveis de transcrição nas cepas recombinantes. Especialmente para NKU-6C1 e NKU-16C1, os níveis de transcrição de phaZ foram melhorados ainda mais do que phaC1, Apesar de phaZ estava longe do promotor no agrupamento de genes quando comparado com phaC1. Isto pode ser devido ao forte acoplamento regulador entre a atividade da polimerase PHA e a atividade da despolimerase pode existir nesta cepa. Foi relatado que a superexpressão única de PhaC pode levar a um aumento na expressão de PhaZ 32. Então phaZ mostrou um nível de transcrição mais alto do que phaC1, quando PhaC e PhaZ foram superexpressos simultaneamente em um agrupamento de genes. Os resultados da fermentação de PHA mostraram que os títulos de PHA de NKU-4C1, NKU-6C1 e NKU-16C1 foram todos reduzidos, especialmente em NKU-6C1 (Fig. 6). Essas observações sugerem que a superexpressão de phaZ pode levar a uma síntese excessiva de PHA despolimerase, e que o PHA acumulado intracelularmente pode ser degradado pela despolimerase. As funções regulatórias da PHA despolimerase na síntese de PHA foram investigadas anteriormente por outros pesquisadores. Por exemplo, a superexpressão de PhaC2 sozinho em P. putida A cepa U foi incapaz de acumular maiores quantidades de PHA do que na cepa de tipo selvagem, como resultado da despolimerização de PHA elevada no estágio final da síntese de PHA. UMA phaZ-mutante inativo de P. putida cepa U, no entanto, acumulou níveis mais elevados de PHA do que a cepa parental 32. O conteúdo mcl-PHA de um phaZ mutante nocaute de P. putida KT2442 (86% em peso, a razão de PHA para CDW) foi maior do que a cepa de tipo selvagem (66% em peso) quando se usou octanoato de sódio como fonte de carbono 33. No entanto, a eliminação da atividade da despolimerase de PHA em P. putida KT2440 teve pouco impacto no rendimento geral de PHA 34. Ambos a phaZ-mutante deficiente de P. oleovorans GPo1 35 e dois transposon interrompido phaZ mutantes de P. resinovorans 36 não mostrou nenhum aumento substancial no título de PHA sob várias condições de síntese de PHA.

Neste trabalho, tentamos melhorar o rendimento de PHA pela construção de phaZ mutantes nocaute. No entanto, o título de PHA da cepa NKU-phaZ foi diminuído em 4% em peso em comparação com a cepa NKU de 21 para 17% em peso (Fig. 7), indicando que o nocaute de phaZ não pode melhorar o rendimento e o peso molecular de mcl-PHA em P. mendocina NK-01. Surpreendentemente, PHA sintetizado por todos phaZ mutantes nocaute tinham pesos moleculares mais baixos do que PHA sintetizado pela cepa parental NKU, com exceção de NKU-phaZ-6C1 (Tabela S2). mcl-PHAs sintetizados por P. mendocina NKU e suas cepas mutantes eram compostas principalmente por três monômeros diferentes, isto é, 3-hidroxioctanoato, 3-hidroxidecanoato e 3-hidroxidodecanoato, como mostrado por análise de GC-MS (Figs S4, S5). As razões de composição de monômero dos mcl-PHAs não tiveram mudanças óbvias para os mutantes em comparação com NKU (Tabela S3).

Análise qPCR e resultados de fermentação PHA para as cepas NKU-∆phaZ-4C1, NKU-∆phaZ-6C1, NKU-∆phaZ-16C1 e NKU-∆phaZ. Níveis transcricionais de phaC1 (uma), phaC2 (b) e phaZ (c) para as diferentes cepas. (d) Produção de CDW e PHA para as cepas. Amostras para qPCR foram coletadas em 36 h de fermentação de PHA. O nível de transcrição para a cepa NKU-∆phaZ foi definido como 1. Os dados representam os valores médios ± desvios padrão de medições em triplicado de três experiências independentes. De um aluno t-teste foi realizado entre NKU-∆phaZ e outros mutantes. * e ** indicam P & lt 0,05 e P & lt 0,01, respectivamente.

Os valores transcricionais relativos de phaC1 e phaC2 na cepa NKU-phaZ-4C1, NKU-phaZ-6C1 e NKU-phaZ-16C1 foram todos melhorados em comparação com NKU-phaZ, (Fig. 7). Curiosamente, os valores transcricionais relativos de phaC1 e phaC2 na cepa NKU-phaZ-16C1 foram os mais baixos entre as três cepas acima, enquanto o título de PHA da cepa NKU-phaZ-16C1 foi o mais alto entre as três cepas acima. O título de PHA da cepa NKU-phaZ-4C1 foi semelhante ao da cepa NKU-phaZ. Comparado com a cepa NKU-phaZ, o título de PHA da cepa NKU-phaZ-6C1 foi reduzido em 7%, e o título de PHA para a cepa NKU-phaZ-16C1 foram melhorados em 6% a 23% em peso (Fig. 7). Esses resultados indicaram que o nível de expressão de phaC não foi positivamente relacionado com o título de PHA na cepa NK-01. Em estudos futuros, a expressão ideal de phaC pode ser necessário para obter o maior rendimento de PHA na cepa NK-01. Deve-se notar que a sequência nativa de RBS do phaC gene permaneceu inalterado quando os fortes promotores endógenos foram inseridos a montante do phaC operon no genoma de P. mendocina. No P. mendocina, a sequência de RBS nativa pode ser ideal para o início da tradução do phaC operon. O RBS pode servir como um importante elemento regulador para a iniciação da tradução e, portanto, obviamente afetar o nível de expressão gênica 37,38. Usar apenas promotores fortes pode não obter os níveis de expressão ideais. Para este estudo, a otimização da sequência RBS juntamente com a triagem de promotores fortes endógenos pode ser necessária para a expressão ótima do gene da PHA sintase.

Os valores transcricionais relativos de phaC1 e phaC2 para as diferentes cepas mutantes em 12 he 24 h de fermentação mcl-PHA também foram medidos, respectivamente. Como esperado, as cepas NKU-phaZ-4C1, NKU-phaZ-6C1 e NKU-phaZ-16C1 mostrou níveis de transcrição mais elevados para phaC1 e phaC2 do que NKU-phaZ às 12 h, no entanto, nenhuma diferença significativa foi observada entre as três cepas acima (Fig. S6). Às 24 h, os valores transcricionais relativos de phaC1 para as três cepas acima também foram melhoradas em comparação com NKU-phaZ, e NKU-phaZ-4C1 teve o nível de transcrição mais alto entre as três cepas (Fig. S6). Surpreendentemente, os níveis de transcrição para phaC2 às 24 h não teve aumento óbvio para NKU-phaZ-4C1, NKU-phaZ-6C1 e NKU-phaZ-16C1 em comparação com NKU-phaZ (Fig. S6). A cepa NKU-phaZ-16C1 mostrou os níveis de transcrição mais baixos para phaC1 e phaC2 em quaisquer pontos de tempo (Fig. 7 e Fig. S6). Esses resultados indicaram que os níveis transcricionais de phaC1 e phaC2 para as cepas mutantes não foram constantes durante a fermentação de PHA. As mudanças nos níveis de transcrição dos genes da PHA sintase durante o período de fermentação do PHA podem contribuir para diminuir o aumento no rendimento do PHA.

Uma vez que uma via metabólica complexa está envolvida na síntese de PHA a partir da glicose, existem muitos fatores importantes para influenciar a eficiência da síntese de PHA, incluindo a via de Entner-Doudoroff, o fluxo de acetil-CoA, o ácido graxo de novo via de síntese, e a disponibilidade da síntese de PHA 39,40,41. A modificação de alguns fatores pode não ter uma influência óbvia para a melhoria da síntese de PHA.

Neste trabalho, todos phaZ mutantes nocaute mostraram uma diminuição nos níveis transcricionais relativos de phaC1 e phaC2 em comparação com suas cepas correspondentes, sem exclusão de phaZ. Comparado com a cepa NKU-phaZ, a redução no título de PHA foi observada com a cepa NKU-phaZ-4C1 e NKU-phaZ-6C1, enquanto o título de PHA foi melhorado para a cepa NKU-phaZ-16C1 (Fig. 7). Estes resultados sugerem que PhaZ não está apenas envolvido na degradação de PHA, mas também atua como um papel importante na síntese de PHA em P. mendocina NK-01. Um estudo anterior mostrou que PhaZ pode desempenhar um papel crucial no volume de negócios de mcl-PHA em condições de fome em P. putida KT2442 42. O ajuste racional da atividade transcricional de PHA sintase e despolimerase seria uma abordagem viável para a otimização da produção de PHA na cepa NK-01. Portanto, acreditamos que os promotores fortes endógenos selecionados têm o potencial de serem aplicados para a superexpressão de genes da via de síntese de PHA para melhorar a produção de PHA em P. mendocina NK-01.

A engenharia do promotor, como a triagem de promotores fortes, tem sido amplamente aplicada na engenharia da via metabólica para melhorar o rendimento de muitos produtos industriais. No entanto, em muitos casos, os promotores exógenos podem não ser compatíveis com os sistemas de expressão de genes nativos em P. mendocina NK-01. Um estudo anterior em nosso laboratório mostrou que o rendimento de PHA teve uma diminuição óbvia após a superexpressão de genes de PHA sintetase usando um promotor forte exógeno J23119 em P. putida KT2440 (dados não publicados). Isso também mostrou que, quanto mais expressão de PhaC, maior o rendimento de mcl-PHA poderia ser obtido. Neste estudo, não selecionamos um promotor exógeno muito forte como a referência e o comumente usado laca o promotor 43,44 tem sido usado como o controle nos ensaios de atividade transcricional para rastrear promotores fortes endógenos apropriados. Comparado com o promotor lac, os promotores endógenos selecionados P4, P6 e P16 apresentaram maior atividade transcricional e intensidade de fluorescência. Portanto, testamos a capacidade dos promotores endógenos selecionados para melhorar a produção de mcl-PHA por superexpressão de PHA sintase em P. mendocina NK-01. Trabalhos futuros são necessários para rastrear promotores mais adequados e otimizar a via biossintética de PHA para melhorar ainda mais a produção de mcl-PHA, não apenas por meio da superexpressão de genes de PHA sintase. E os promotores endógenos selecionados também podem ser aplicados para aumentar a biossíntese de AO, que é outro produto sintetizado por NK-01 a partir da glicose. O uso de promotores endógenos pode ser um método viável para a otimização da expressão dos genes da via sintética, e esta estratégia pode ser potencialmente utilizada para a produção aprimorada de outros produtos biológicos valiosos.


Conteúdo

Os dois sistemas de expressão induzível mais comumente usados ​​para a pesquisa da biologia de células eucariotas são denominados Tet-Off e Tet-On. [3] O sistema Tet-Off para controlar a expressão de genes de interesse em células de mamíferos foi desenvolvido pelos professores Hermann Bujard e Manfred Gossen na Universidade de Heidelberg e publicado pela primeira vez em 1992. [4]

O sistema Tet-Off faz uso do transativador de tetraciclina (tTA) proteína, que é criada pela fusão de uma proteína, TetR (repressor de tetraciclina), encontrada em Escherichia coli bactéria, com o domínio de ativação de outra proteína, VP16, encontrada no vírus Herpes Simplex. [5]

A proteína tTA resultante é capaz de se ligar ao DNA em TetO sequências de operadores. Na maioria dos sistemas Tet-Off, várias repetições de tais sequências TetO são colocadas a montante de um promotor mínimo, como o promotor CMV. A totalidade de várias sequências TetO com um promotor mínimo é chamada de elemento de resposta de tetraciclina (TRE), porque responde à ligação da proteína transativadora de tetraciclina tTA por aumento da expressão do gene ou genes a jusante de seu promotor.

Em um sistema Tet-Off, a expressão de genes controlados por TRE pode ser reprimida pela tetraciclina e seus derivados. Eles se ligam a tTA e tornam-no incapaz de se ligar a sequências de TRE, evitando assim a transativação de genes controlados por TRE.

Um sistema Tet-On funciona de maneira semelhante, mas de maneira oposta. Enquanto em um sistema Tet-Off, tTA é capaz de vincular o operador só se não ligada à tetraciclina ou a um de seus derivados, como a doxiciclina, em um sistema Tet-On, a proteína rtTA é capaz de se ligar ao operador somente se ligado por uma tetraciclina. Assim, a introdução da doxiciclina no sistema inicia a transcrição do produto genético. O sistema Tet-On às vezes é preferível ao Tet-Off por sua capacidade de resposta mais rápida.

Os sistemas de expressão Tet-Off também são usados ​​na geração de camundongos transgênicos que expressam condicionalmente o gene de interesse.

O transativador Tet-On Advanced (também conhecido como rtTA2 S -M2) é uma versão alternativa do Tet-On que mostra expressão basal reduzida e funciona em uma concentração de Dox 10 vezes menor do que o Tet-Off. Além disso, sua expressão é considerada mais estável em células eucarióticas devido ao codon humano ser otimizado e utilizar 3 domínios de ativação transcricional mínimos. Foi descoberto em 2000 como um dos dois mutantes melhorados por H. Bujard e seus colegas após a mutagênese aleatória da parte do Repressor Tet do gene transativador. [6] Tet-On 3G (também conhecido como rtTA-V10 [7]) é semelhante ao Tet-On Advanced, mas foi derivado de rtTA2 S -S2 em vez de rtTA2 S -M2. É também otimizado para códons humanos e composto por 3 domínios de ativação VP16 mínimos. No entanto, a proteína Tet-On 3G tem 5 diferenças de aminoácidos em comparação com o Tet-On Advanced, que parecem aumentar sua sensibilidade ao Dox ainda mais. O Tet-On 3G é sensível a Dox 100 vezes menos e é 7 vezes mais ativo do que o Tet-On original. [8]

Outros sistemas, como o sistema T-REx da Life Technologies, funcionam de maneira diferente. [9] O gene de interesse é flanqueado por um promotor CMV a montante e dois sítios TetO2. A expressão do gene de interesse é reprimida pela ligação de alta afinidade de homodímeros TetR a cada sequência de TetO2 na ausência de tetraciclina. A introdução de tetraciclina resulta na ligação de uma tetraciclina em cada homodímero TetR seguida pela liberação de TetO2 pelos homodímeros TetR. A desvinculação de homodímeros TetR e TetO2 resulta na desrepressão do gene de interesse.

Uma versão modificada do T-REx é o circuito biológico sintético Linearizer, otimizado para sintonia de expressão gênica em células eucarióticas (levedura de brotamento, humana, etc.). By incorporating TetO2 sites into the promoter driving TetR expression, it creates negative feedback, which ensures homogeneous expression (low noise) and a linear dose-response to tetracycline analogs. [10]

In the most commonly used plasmids, the tetracycline response element consists of 7 repeats of the 19bp bacterial TetO sequence ( TCCCTATCAGTGATAGAGA ) separated by spacer sequences (for example: ACGATGTCGAGTTTAC ). It is the TetO that is recognized and bound by the TetR portion of Tet-On or Tet-Off. The TRE is usually placed upstream of a minimal promoter that has very low basal expression in the absence of bound Tet-Off (or Tet-On).

The Tet system has advantages over Cre, FRT, and ER (estrogen receptor) conditional gene expression systems. In the Cre and FRT systems, activation or knockout of the gene is irreversible once recombination is accomplished, whereas, in Tet and ER systems, it is reversible. The Tet system has very tight control on expression, whereas ER system is somewhat leaky. [11] However, the Tet system, which depends on transcription and subsequent translation of a target gene, is not as fast-acting as the ER system, which stabilizes the already-expressed target protein upon hormone administration. Also, since the 19bp tet-o sequence is naturally absent from mammalian cells, pleiotropy is thought to be minimized compared to hormonal methods of control. When using the Tet system in cell culture, it is important to confirm that each batch of fetal bovine serum is tested to confirm that contaminating tetracyclines are absent or are too low to interfere with inducibility.

The mechanism of action for the antibacterial effect of tetracyclines relies on disrupting protein translation in bacteria, thereby damaging the ability of microbes to grow and repair however protein translation is also disrupted in eukaryotic mitochondria leading to effects that may confound experimental results. [12] [13]


Métodos

Chick embryos

Fertilized chick eggs from a commercial source (JA57 strain, Dangers, France) were incubated at 38.5 °C. Embryos were staged according to days in ovo. For early stages, the following day numbers and HH (Hamburger and Hamilton) stages [56] are equivalent: E2/HH13, E2.5/HH15 and correspond to 20 and 25 somite stages, respectively.

Establishment of recombinant vectors

The pT2AL-MLC-Tomato-T2A-GFP plasmid was obtained as following: The Myr-TdTomato-T2A sequence was amplified by PCR from the plasmid pCS2-TdTomato-2A-GFP [52]. To facilitate subsequent cloning, one XhoI site was added to the forward primer and one BstBI site was added to the reverse primer. The purified PCR product was then inserted into pCRII-TOPO (Invitrogen) and a clone with Tomato downstream of SP6 promoter was selected, giving rise to a plasmid named TOPO/Tomato. H2B-GFP was amplified by PCR from the plasmid pCS2-TdTomato-2A-GFP [52]. A BstbI site was added to the forward primer and one PmlI site and one ClaI site were added to the reverse primer. The purified PCR product was then inserted into pCRII-TOPO (Invitrogen) and a clone with GFP downstream of SP6 promoter was selected, resulting in a plasmid called TOPO/GFP. Next, both TOPO/Tomato and TOPO/GFP were digested with BstbI and NotI. The T2A sequence was then inserted into TOPO/Tomato using the T4 DNA ligase (New England Biolabs) to generate a plasmid named TOPO/Tomato-T2A-GFP. The Tomato-T2A-GFP cassette was then excised from TOPO Tomato-T2A-GFP using EcoRV and XhoI and cloned into the pT2AL200R150G [57] previously digested with ClaI (blunt-ended using Fermentas T4 DNA polymerase) and XhoI. The resulting plasmid was named pT2AL-Tomato-T2A-GFP. The Myosin Light Chain (MLC) mouse promoter was removed from the pT2K-MLC-Fgf4 plasmid (previously described in [44]) using NcoI and XhoI. Both extremities were then blunt-ended using T4 DNA polymerase (Fermentas). The MLC promoter was next blunt ligated to TOPO GFP previously digested with XbaI made blunt. A clone with the MLC promoter inserted with ApaI in 5’ and XhoI in 3’ was selected resulting in a plasmid called TOPO/GFP/MLC. Both TOPO/GFP/MLC and pT2AL-Tomato-T2A-GFP were digested with ApaI and XhoI. MLC was inserted into pT2AL-Tomato-T2A-GFP to obtain pT2AL-MLC-Tomato-T2A-GFP.

The pT2AL-CMV/βactin-Tomato-T2A-GFP plasmid was obtained as followed: The pT2AL-MLC-Tomato-T2A-GFP plasmid was digested with ApaI (blunt-ended using Fermentas T4 DNA polymerase) and SphI to remove the MLC promoter. The MLC promoter was then replaced by the CMV-βactin promoter (the chick βactin promoter downstream of a CMV enhancer), which was excised from the CMV-βactin-EGFP [35] using SalI (blunt-ended) and SphI to generate the pT2AL-CMV-Tomato-T2A-GFP plasmid.

The pT2AL-p57/βactin -Tomato-T2A-GFP plasmid was obtained as followed: The p57MRE regulatory sequence was excised from pSK-p57MRE plasmid [11] by digestion with Spe1 and SacII. The CMV enhancer of the pT2AL-CMV/βactin-Tomato-T2A-GFP plasmid was excised by Acc1 and SnaBI and replaced with the p57MRE using blunt ligation with the Rapid DNA Ligation Kit (Roche). The generated plasmid was named the pT2AL-p57/βactin-Tomato-T2A-GFP.

Eletroporação

Limb somite electroporation was performed as previously described [35]. The DNA solution was systematically composed of the Tol2 stable vectors and the transient transposase vector CMV/βactin-T2TP, which allows the stable integration into the chick genome. The concentration of the different vectors was between 1.5 and 2 μg/μL and of 1/3 for the CMV/βactin-T2TP. DNA was prepared in solution containing carboxymethyl cellulose 0,17 %, fast green 1 %, MgCl2 1 mM and PBS 1X in water.

Lateral plate electroporation was performed as followed: Stage HH13–15 (E2) chick embryos were windowed following standard techniques in preparation for electroporation [58]. PBS without Ca 2+ /Mg 2+ was applied to the embryo. A capillary was backfilled with DNA solution, which was injected under 200 Pa pressure (injection duration 0.1–0.5 s and compensatory pressure 15–25 Pa) (Femtojet, Eppendorf) into the embryonic coelom, to fill completely the anterior to posterior extent of the forelimb territory. The negative electrode (0.8 mm diameter tungsten rod with a 4-mm length and 2-mm exposed surface) was inserted into the yolk and positioned beneath the forelimb field, approximately 2 mm below the embryo. A 0.8 mm diameter platinum rod with a 1-mm exposed tip served as the positive electrode and was positioned above the forelimb field with an approximate distance of 3 mm. A wave pulse train consisting of 50 V, five pulses, 20 ms duration with a 200 ms interpulse interval was delivered via TSS20 electroporator and EP21 current amplifier (Intracel). Embryos were returned to 37.5 °C for the remaining incubation period. DNA solution was composed of pT2AL-CMV/βactin-Tomato-T2A-GFP (1-3 μg/μL) and CMV/βactin-T2TP at a molar ratio of 1:5–1:10, diluted in a mix containing PBS without Ca 2+ /Mg 2+ and Fast Green 0.005 %. This ratio resulted in persistent gene expression in the embryonic limbs during foetal development.

Imunohistoquímica

Experimental forelimbs were fixed in paraformaldehyde 4 % overnight at 4 °C and processed for cryostat sections (12 μm). Immunohistochemistry was performed as previously described [59]. The monoclonal antibodies MF20 that recognizes sarcomeric myosin heavy chains and Pax7 that recognizes muscle progenitors, developed by D.A. Fischman and A. Kawakami, respectively, were obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank developed under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biology Iowa City, IA 52242. After overnight incubation with the primary antibody at 4 °C, biotinylated secondary antibodies (Anti-Mouse IgG2b from Southern Biotech Anti-Mouse IgG1 from Jackson ImmunoResearch laboratories) were applied for 1 h at room temperature, followed by a 45 min incubation with Cy5-Streptavidin (Invitrogen). Hoechst (Molecular Probes) staining was performed with a dilution of 1/20000 in PBS 1X for 10 min at room temperature.

Hibridização in situ

In situ hybridization experiments were performed for GFP e Scx probes, as previously described [35].

Image capturing

Images of the wholemount electroporated limbs were acquired with a Leica stereo-macroscope equipped with a Leica DFC300 camera. After immunohistochemistry, sectioned samples images were captured using a Nikon epifluorescence microscope, a Leica DMI600B inverted microscope or a Leica SP5 confocal system.


MATERIAIS E MÉTODOS

ASC Isolation and Clonal Culture

Stromal vascular cells with a CD34 + CD105 + CD45 − CD31 − phenotype (ASCs) were isolated from human adipose tissue (Boquest et al., 2005). In short, tissue was obtained by liposuction from the hip and thigh regions of healthy women. After washing in Hank’s balanced salt solution (HBSS), the tissue was digested for 2 h at 37°C in HBSS with collagenase and DNase I. Adipocytes were separated from stromal vascular cells after sedimentation at 400 × g for 10 min and removed by aspiration. Erythrocytes were removed by resuspending stromal vascular cell pellets in lysis buffer (2.06 mg/ml Tris base, pH 7.2, and 7.49 mg/ml NH4Cl) for 10 min. After centrifugation, pellets were resuspended in HBSS containing 2% fetal bovine serum (FBS) (Sigma-Aldrich. St. Louis, MO) and passed through a 100-μm sieve and a 40-μm sieve. CD45 + cells were removed with paramagnetic beads conjugated to mouse anti-human CD45 monoclonal antibodies (Miltenyi Biotech, Bergish Gladbach, Germany) using a superMACS magnet (Miltenyi Biotech). Remaining CD45 − cells were incubated with fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD31 antibodies (Serotec, Oxford, United Kingdom) at a concentration of 10 μl of antibody per 10 6 cells for 15 min at 4°C. Cells were washed and incubated with anti-FITC microbeads (Miltenyi Biotech) for 15 min at 4°C. CD31 − and CD31 + cells were separated using an LS column (Miltenyi Biotech). CD31 − cells were reexposed to a new LS column to eliminate any leftover contaminating CD31 + cells. Flow cytometry analysis of each cell subset from each donor indicated that purity was >98% (our unpublished data) (Boquest et al., 2005). Aliquots of each cell subset were immediately snap-frozen in liquid nitrogen for DNA and RNA isolations, or they were cultured.

CD31 − clonal cell lines were generated by culturing single CD31 − cells in each well of 48-well plates in DMEM/F-12 medium containing 50% FBS and antibiotics. After ∼16 h, the medium was replaced by DMEM/F-12 with 20% FBS. After ∼1 wk, colonies containing >10 cells were passaged by trypsinization and expanded. Only clonal lines that could be easily expanded were used in this study. Clones A1 and A2, and clones B1, B2, and B3 examined in this study were from two different female donors (age 27 and 39, respectively).

Adipogenic Differentiation

Clonal ASC lines generated from individual CD31 − cells at passage 4 were cultured to confluence before differentiation. For adipogenic differentiation (Zuk et al., 2001), cells cultured in DMEM/F-12 with 10% FBS were stimulated for 3 wk with 0.5 mM 1-methyl-3 isobutylxanthine, 1 μM dexamethasone, 10 μg/ml insulin (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), and 200 μM indomethacin (Dumex-Alpharma, Copenhagen, Denmark). To visualize lipid droplets, formalin-fixed cells were washed in 50% isopropanol and stained with Oil Red-O.

Gene Loci and Regions Analyzed by Bisulfite Sequencing

Supplemental Figure S1 illustrates the promoter regions of the genes analyzed by bisulfite sequencing in this study. We examined four adipogenic genes, including leptin (LEP) (Mason et al., 1998 Reseland et al., 2001), peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2 (PPARG2) (Fajas et al., 1997), fatty acid-binding protein 4 (FABP4) (Ross et al., 1990 Graves et al., 1992), and lipoprotein lipase (LPL) (Bey et al., 1998 Merkel et al., 2002). We also examined genes unrelated to adipogenesis, such as myogenin (MYOG), a basic helix-loop-helix transcription factor required for myocyte differentiation (Massari and Murre, 2000) the endothelial marker gene CD31/PCAM-1 (Cao et al., 2002 Chi et al., 2003) and the constitutively expressed housekeeping gene GAPDH. o LEP promoter region analyzed was from nucleotides 2719–2937 (GenBank accession no. U43589) and spanned 27 potentially methylated cytosines in CpG dinucleotides starting 42 base pairs upstream of the ATG translational start site. o LEP proximal promoter activity is known to be regulated by DNA methylation (Melzner et al., 2002). o PPARG2 promoter region (Fajas et al., 1997) spanned nucleotides 108–587 (GenBank accession no. AB005520) and included 6 CpGs starting 264 base pairs upstream of the ATG. o FABP4 (GenBank accession no. NM_001442) promoter region examined was identified using ENSEMBL and encompassed four CpGs starting 130 base pairs upstream of the ATG. o LPL promoter region spanned bases 1321–1777 (GenBank accession no. X68111) and included 11 CpGs starting 134 base pairs upstream of the ATG. o MYOG region analyzed spanned nucleotides 1268–1484 (GenBank accession no. X62155) and included 16 CpGs starting 87 base pairs downstream of the ATG. o CD31 promoter region examined included nucleotides 1095–1480 (GenBank accession no. X96848) and included 18 CpGs ranging from nucleotide −352 to +34 relative to the ATG. o GAPDH promoter region spanned bases 1121–1337 (GenBank accession no. J04038) and encompassed 28 CpGs 116 base pairs upstream of the ATG.

Bisulfite Sequencing

DNA was purified either using the GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep kit (Sigma-Aldrich), or for most samples, by phenol-chloroform-isoamyl alcohol extraction. In the latter case, cells were first lysed for 10 min in lysis buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8, 100 mM EDTA, and 0.5% SDS) and digested with 0.1 mg/ml proteinase K overnight. Bisulfite conversion (Warnecke et al., 2002) was performed using the MethylEasy DNA bisulfite modification kit (Human Genetic Signatures, Sydney, Australia). Converted DNA was used fresh or stored at −20°C. Converted DNA was amplified by PCR using primer sets purchased from Human Genetic Signatures for the LEP, MYOG, CD31 e GAPDH genes. These primers sets are commercially available (www.geneticsignatures.com). We also designed primers using the Methprimer software (www.urogene.org/methprimer/index1.html) for the PPARG2, FABP4, e LPL genes (Table 1). Para PPARG2, FABP4, e LPL, PCR conditions were 95°C for 7 min and 40 cycles of 95°C 1 min, 54°C 2 min and 72°C 2 min, followed by 10 min at 72°C. Para LEP, MYOG, CD31, e GAPDH, nested PCRs were performed, each as follows: 95°C for 3 min and 30 cycles of 95°C for 1 min, 50°C for 2 min, and 72°C for 2 min, followed by 10 min at 72°C. PCR products were directly sequenced or cloned into bacteria using the TOPO TA cloning kit (Invitrogen, Oslo, Norway). Clones were sequenced using commercial services from MWG Biotech (Ebersberg, Germany).

Table 1. Bisulfite sequencing primers used in this study

a Purchased from Human Genetic Signatures.

Real-Time Reverse Transcription (RT)-PCR

RT-PCR was carried from 500 ng of total RNA using the Iscript cDNA synthesis kit (Bio-Rad, Hercules, CA). Quantitative (Q)RT-PCR reactions were performed in triplicates on a MyiQ real-time PCR Detection System using IQ SYBR Green (Bio-Rad). Most samples were analyzed in duplicates from two separate cDNA preparations. Primers used are listed in Table 2. SYBR Green PCR conditions were 95°C for 4.5 min and 40 cycles of 95°C for 30 s, 60°C for 30 s, and 72°C for 30 s, using GAPDH as a normalization control. mRNA levels were calculated as described previously (Pfaffl, 2001).

Table 2. Real-time RT-PCR primers used in this study


Expression Vectors: Types & Characteristics

The expression vectors are vectors which act as vehicles for DNA insert and also allow the DNA insert to be expressed efficiently. These may be plasmids or viruses. The expression vectors are also known as expression constructs.

The expression vectors are genetically engineered for the introduction of genes into the target cells. In addition to the gene of interest, these expression constructs also contain regulatory elements like enhancers and promoters so that efficient transcription of the gene of interest occurs.

The simplest expression constructs are also known as transcription vectors only because they allow transcription of the cloned foreign gene and not its translation. The vectors which facilitate both transcription and translation of the cloned foreign gene are known as protein expression vectors. These protein expression constructs also lead to the production of recombinant protein.

Now, for transcription and translation, a promoter and a termination sequence are a must. Transcription initiates at the promoter and ends at the termination site. The promoters of expression vectors must have on/off switches. These switches help in the regulation of production of the gene product. Excessive amounts of product of the gene of interest can be toxic for the cell. A common promoter utilized in the expression constructs is the mutant version of the lac promoter, lacUV. The lacUV promoter initiates a high level of transcription under induced conditions. Moreover, in some expression vectors, a ribosomal binding site is present upstream to the start codon. The ribosomal binding site facilitates the efficient translation of the cloned foreign gene.

Expression vectors are used extensively in molecular biology in techniques like site-directed mutagenesis.

How do Expression Vectors work?

  • Once the expression construct is inside the host cell, the protein encoded by the gene of interest is produced by the transcription. Thereafter, it utilizes the translation machinery and ribosomal complexes of the host organism.
  • Frequently, the plasmid is genetically engineered to harbor regulatory elements like enhancers and promoters. These regulator sequences aid in efficient transcription of the gene of interest.
  • Expression vectors are extensively used as tools which help in the production of mRNAs and, in turn, stable proteins. They are of much interest in biotechnology and molecular biology for the production of proteins like insulin. Insulin is the chief ingredient in the treatment of the complex disease, Diabetes.
  • When the protein product is expressed, it is to be then purified. The purification of a protein poses a challenge since the protein of interest, whose gene is carried on the expression vector, is to be purified independently of the proteins of the host organism. To make the process of purification simpler, the gene of interest carried on the expression vector should always have a ‘tag’. This tag can be any marker peptide or histidine (His tag).
  • Expression vectors are considerably exploited in techniques like site-directed mutagenesis. Cloning vectors introduce the gene of interest into a plasmid which in turn replicates in bacteria. These cloning vectors need not necessarily result in the expression of a protein.

Therefore, expression vectors must have the following expression signals:

  • Strong promoter,
  • Strong termination codon,
  • Adjustment of distance between the promoter and cloned gene,
  • Inserted transcription termination sequence, and
  • Portable translation initiation sequence.

Promotor

  • A promoter ensures a reliable transcription of the gene of interest. Also, strong promoters are also necessary for an efficient mRNA synthesis with RNA polymerase.
  • Regulation of the promoter is another critical aspect which should always be kept in mind while constructing an expression vector.
  • The strongest promoters are those found in bacteriophages T5 and T7.

No E. coli, the promoter is regulated in two ways:

Induction : the addition of chemical switches on the transcription of the gene.

Repression : addition of chemical switches off the transcription of the gene.

The most commonly used promoters in E. coli expression system are:

  • It regulates the transcription of the lac Z gene. The lac Z gene is responsible for the production of β- galactosidase.
  • The lac Z gene can be induced by IPTG, isopropylthiogalactosidase.
  • The lac promoter sequences can be fused to the target gene. It will, then, result in lactose- dependent expression of the target gene.
  • Nevertheless, the lac promoter has its drawbacks. It is quite weak and cannot be utilized for the high levels of production of the desired protein. In addition to this, the lac genes carry out the basal level of transcription even in the absence of induction (inducer molecule).
  • It is responsible for the regulation of a cluster of genes which are involved in tryptophan biosynthesis.
  • Tryptophan acts as its repressor molecule, and it is induced by 3-β-indoleacrylic acid.
  • It is formed by hybridization of the lac and trp promoter. However, it is stronger than either of them.
  • The tac promoter is induced by IPTG, isopropylthiogalactosidase.
  • It is a strong promoter and is responsible for transcription of λDNA in E. coli
  • The product of λcI gene acts as its repressor. It is called λ repressor.
  • The expression construct with the λPeu promoter is used in combination with the E. coli mutant host. It is responsible for the production of a temperature sensitive form of λ repressor.
  • At low temperatures, the repressor protein represses the transcription whereas the transcription of the cloned gene occurs at high temperatures because the repressor is inactivated at high temperature.
  • For the expression of proteins in mammalian cells, the promoter must be located upstream of the cloned cDNA for its efficient transcription.
  • In most of the cases, viral promoters are employed only because they are reliable for a strong constitutive expression.
  • The widely used promoters are CMV promoter (derived from cytomegalovirus) and the SV40 promoter (derived from simian virus 40).

The promoters in the commercially available yeast expression vectors may be active constitutively or inducible ones.

A constitutive promoter is a kind of promoter which is unregulated and allows continual transcription of its associated gene.

Example of a constitutive promoter: GAP promoter of the gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

An inducible promoter is the one which works in a regulated manner and the expression of genes associated with them can be switched on or off at a particular stage of development or at a certain point of time.

Examples of inducible promoters: AOX1, GAL1, GAL10, nmt1, nmt42, and nmt81.

o AOX1 promoter of the gene encoding alcohol oxidase. It is induced by methanol and is best-suited for expression of the protein in Pichia pastoris.

o GAL1 e GAL10 promoters are other examples. They are induced by galactose and are suitable for protein expression in Saccharomyces cerevisiae.

o nmt1, nmt42, e nmt81 promoters which are induced by thiamine for protein expression in Schizosaccharomyces pombe.

Reporter Gene

  • The reporter gene is responsible for the production of the protein which can be detected and quantified with the help of a simple assay.
  • They serve as a tool to measure the efficiency of the gene expression and also to detect the intracellular localization of the protein.
  • The rate of expression of the structural gene is dependent upon the regulatory sequences which are located upstream to it.
  • The rate of expression of the gene can be measured by replacement of its protein-encoding portion. Also, it can be fused to another gene which expresses another protein. The presence of this another protein can be easily identified.
  • Reporter genes are useful in the identification of promoters, enhancers, and other proteins or regulatory elements which bind to them.

The most commonly utilized reporter genes are:

  • It acts as a reporter in the presence of X- gal.
  • Its levels are easily detected by the intensity of colour which is produced. The intensity of the blue colour produced is quantified.

2. CAT (chloramphenicol acetyltransferase) encoding gene of E. coli

  • The CAT gene encodes chloramphenicol acetyltransferase.
  • The transferase enzyme is responsible for the transfer of acetyl groups from acetyl CoA to the recipient antibiotic, chloramphenicol

3. Luciferase encoding gene of firefly, Photinus pyralis

  • Luciferase is accountable for the oxidation of luciferin.
  • The oxidation of luciferin results in the emission of yellow-green light. The emission of light is easily detected irrespective of the low levels.

4. Green fluorescent protein (GFP) encoding gene of jellyfish, Aequorea victoria

  • GFP was discovered by Shimomura.
  • It is an autofluorescent protein with 238 amino acid residues produced by the bioluminescent jellyfish Aequorea victoria.
  • In GFP, β-barrel is formed by eleven β strands. An α- helix runs through the center. The chromophore is located in the middle of the barrel. The amino acid residues from 65 to 67 with sequence Ser-Tyr-Gly form the chromophore, p- hydroxybenzylideneimidazolinone, which is fluorescent. The chromophore fluoresces at a peak wavelength of 508 nm (green light) when it is irradiated with UV or blue light (400 nm).
  • GFP serves as a tool for determining protein localization.
  • It serves as a tag whereby it is fused with a protein whose expression is to be monitored. Basically, the subcellular localization of the protein is investigated.
  • Genetic engineering techniques help in the production of vectors which contain the coding sequence of the unidentified protein, X, cloned in the coding sequence of the GFP.
  • This fusion product of GFP-X can now be transfected into target cells and the expression, as well as the subcellular location of the X protein, can easily be monitored and detected.

Ribosome Binding Site and Translation Initiation Site

  • The ribosomal binding site (RBS) follows the promoter. It is responsible for the efficient translation of the cloned gene.
  • The translation initiation site in case of prokaryotes is known as the Shine Dalgarno sequence. This sequence is enclosed within the RBS only.
  • The consensus sequence of the translation initiation site includes a set of 8 base pairs present upstream the AUG start codon.
  • The translation in eukaryotes is initiated at a particular sequence called Kozak sequence.
  • The ribosomal machinery for the translation of mRNA is assembled on this site.

Polylinkers

  • Each vector contains particular recognition sites for restriction enzymes. It is at the restriction site that the vector is excised to clone the foreign gene of interest.
  • These sites often lie close together and, hence, are called polylinkers or multiple cloning sites (MCS).
  • These regions are 50 to 100 base pair in length and may have a cluster of up to 25 restriction sites.

Poly-A (polyadenylation) Tail

  • The poly-A tail present, at the end of the mRNA formed, protects the mRNA from degradation by the exonucleases or endonucleases.
  • It is extremely critical for the stability of the mRNA.
  • It is also responsible for the termination of transcription and translation and stabilizes the mRNA production.
  • A nucleolytic enzyme complex and a poly-A-polymerase are prerequisites for the addition of poly-A tail at the end of the mRNA.

Expression System

The production of a protein requires an expression system. There are two types of expression systems, prokaryotic and eukaryotic expression system. Each of them has its own advantages and drawbacks which can be taken into consideration while constructing an expression system. However, there is no such expression system which can be considered universal for the heterologous protein production.

Prokaryotic Expression System

  • The specificity of the promoter of an RNA polymerase, in the case of prokaryotes, is mediated by sigma factor.
  • E. coli is the widely used prokaryotic expression system.
  • It expresses high levels of the protein.
  • o E. coli strains are manipulated genetically for the production of recombinant protein so that they are rendered safe for large-scale experiments and fermentation.
  • The purification of the protein has become easier since recombinant-fusion proteins can be purified by affinity chromatography, say for example glutathione-S-transferase and maltose-binding fusion proteins.

Regardless of the advancements and improvements occurring,in the prokaryotic expression system, there are still many difficulties associated and challenges posed by the production of protein from the cloned foreign genes. These kinds of challenges can be grouped together into 2 categories:


Resilience

Reducing the effects of significant adversity on children’s healthy development is essential to the progress and prosperity of any society. Science tells us that some children develop resiliência, or the ability to overcome serious hardship, while others do not. Understanding why some children do well despite adverse early experiences is crucial, because it can inform more effective policies and programs that help more children reach their full potential.

One way to understand the development of resilience is to visualize a balance scale or seesaw. Protective experiences and coping skills on one side counterbalance significant adversity on the other. Resilience is evident when a child’s health and development tips toward positive outcomes — even when a heavy load of factors is stacked on the negative outcome side.

Over time, the cumulative impact of positive life experiences and coping skills can shift the fulcrum’s position, making it easier to achieve positive outcomes. Play Tipping the Scales: The Resilience Game to learn more.

The single most common factor for children who develop resilience is at least one stable and committed relationship with a supportive parent, caregiver, or other adult. These relationships provide the personalized responsiveness, scaffolding, and protection that buffer children from developmental disruption. They also build key capacities—such as the ability to plan, monitor, and regulate behavior—that enable children to respond adaptively to adversity and thrive. This combination of supportive relationships, adaptive skill-building, and positive experiences is the foundation of resilience.

Children who do well in the face of serious hardship typically have a biological resistance to adversity e strong relationships with the important adults in their family and community. Resilience is the result of a combination of protective factors. Neither individual characteristics nor social environments alone are likely to ensure positive outcomes for children who experience prolonged periods of toxic stress. It is the interaction between biology and environment that builds a child’s ability to cope with adversity and overcome threats to healthy development.

Research has identified a common set of factors that predispose children to positive outcomes in the face of significant adversity. Individuals who demonstrate resilience in response to one form of adversity may not necessarily do so in response to another. Yet when these positive influences are operating effectively, they “stack the scale” with positive weight and optimize resilience across multiple contexts. These counterbalancing factors include

  1. facilitating supportive adult-child relationships
  2. building a sense of self-efficacy and perceived control
  3. providing opportunities to strengthen adaptive skills and self-regulatory capacities and
  4. mobilizing sources of faith, hope, and cultural traditions.

Learning to cope with manageable threats is critical for the development of resilience. Not all stress is harmful. There are numerous opportunities in every child’s life to experience manageable stress—and with the help of supportive adults, this “positive stress” can be growth-promoting. Over time, we become better able to cope with life’s obstacles and hardships, both physically and mentally.

The capabilities that underlie resilience can be strengthened at any age. The brain and other biological systems are most adaptable early in life. Yet while their development lays the foundation for a wide range of resilient behaviors, it is never too late to build resilience. Age-appropriate, health-promoting activities can significantly improve the odds that an individual will recover from stress-inducing experiences. For example, regular physical exercise, stress-reduction practices, and programs that actively build executive function and self-regulation skills can improve the abilities of children and adults to cope with, adapt to, and even prevent adversity in their lives. Adults who strengthen these skills in themselves can better model healthy behaviors for their children, thereby improving the resilience of the next generation.


Informação sobre o autor

Present address: Federal Environment Agency, Section IV 2.2 Pharmaceuticals, Washing and Cleansing Agents, and Nanotechnology, Wörlitzer Platz 1, 06844, Dessau, Germany

Afiliações

Department of Biochemistry, University of Bayreuth, Universitätsstr. 30, 95447, Bayreuth, Germany

Molecular Biology of Archaea, Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, Karl-von-Frisch Strasse, 35043, Marburg, Germany

Alexander Wlodkowski & Sonja-Verena Albers

Institute of Chemistry and Bioanalytics, School of Life Sciences, University of Applied Sciences of Northwestern Switzerland (FHNW), Gründenstrasse 40, 4132, Muttenz, Switzerland


Assista o vídeo: Hora da Verdade Promotor MP SC - Direito Civil (Dezembro 2022).