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19.1.14: Peixe-zebra - Biologia

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O peixe-zebra, Danio rerio, tornou-se outro organismo "modelo" popular para estudar questões biológicas fundamentais.

O peixe zebrfish é um pequeno (1–1,5 polegadas) (2,5–3,8 cm) peixe de água doce que cresce facilmente em aquários (está disponível em muitas lojas de animais). Algumas de suas vantagens para biólogos:

  • Ele se reproduz cedo e freqüentemente (diariamente).
  • É um vertebrado, como nós, e, portanto, pode fornecer pistas para a biologia humana que os invertebrados gostam Drosófila e Caenorhabditis elegans não deve.
  • Seus embriões, como os da maioria dos peixes, se desenvolvem fora do corpo, onde podem ser facilmente observados (ao contrário dos ratos).
  • Seus embriões são transparentes, então defeitos de desenvolvimento podem ser vistos facilmente.
  • Células individuais no embrião podem ser marcadas com um corante fluorescente e seu destino seguido.
  • O desenvolvimento embrionário é rápido (eclodem em dois dias).
  • Eles podem absorver pequenas moléculas, como agentes mutagênicos, da água do aquário.
  • Células individuais - ou grupos de células - podem ser transplantadas para outros locais no embrião (como Mangold fez com embriões de salamandra).
  • Eles podem ser forçados a se desenvolver por partenogênese para produzir animais homozigotos à vontade com um genoma derivado de macho ou fêmea.
  • Eles podem ser clonados de células somáticas.
  • Eles podem ser transformados em transgênicos (como camundongos e Drosófila)
  • Seu genoma (1,4 x 109 pares de bases) foi sequenciado revelando 26.606 genes codificadores de proteínas.

Genética direta e reversa

Avançar

Desde a época de Mendel, a maior parte da genética envolveu

  • observando um interessante fenótipo
  • rastrear o gene responsável por isso.

Portanto, essa genética "direta" procede de fenótipo -> genótipo.

Alguns exemplos:

  • Trabalho de Mendel
  • Análise RFLP de grandes famílias
  • O único gene - teoria de uma enzima

Esses métodos foram chamados de genética "direta" para distingui-los de uma abordagem mais recente, que se tornou uma prioridade urgente com o sucesso do sequenciamento do genoma.

Reverter

Métodos rápidos de sequenciamento de DNA geraram uma grande quantidade de dados. Milhares de genes suspeitos foram revelados (por exemplo, encontrando quadros de leitura abertos - ORFs), mas a função de muitos deles ainda é desconhecida.

Mas agora, com o conhecimento da sequência de DNA de um gene de função desconhecida, pode-se usar métodos para suprimir aquele gene específico ("knockdown") e então observar o efeito no fenótipo.

Portanto, essa genética "reversa" procede de genótipo -> fenótipo.

A genética reversa foi aplicada com sucesso a

  • plantas
  • camundongos
  • C. elegans
  • peixe-zebra

Por exemplo, a função de uma sequência misteriosa de genes em Danio pode ser estudado por

  • sintetizando um curto anti-sentido oligonucleotídeo complementar a uma seção do gene.
  • O oligonucleotídeo é quimicamente modificado para torná-lo mais estável do que um fragmento de RNA.
  • A ligação à sua sequência complementar no RNA mensageiro (mRNA) produzido pela transcrição do gene do animal, bloqueia ("derruba") a expressão do gene por
    • impedindo a tradução ou
    • interromper o splicing normal do mRNA.

Porque compartilhamos tantas sequências de genes semelhantes (genes ortólogos) com Danio, se alguém pode descobrir a função do gene em Danio, então temos uma ideia melhor do papel de seu ortólogo em humanos.


Fundo

Os carboidratos são um combustível onipresente na biologia. Eles são usados ​​como fonte de energia na maioria dos organismos, desde bactérias até humanos. Evidências crescentes sugerem que dietas ricas em carboidratos são um fator de risco potencial para síndrome metabólica e diabetes tipo 2 (T2D), independente da ingestão de energia [1,2,3,4,5]. No entanto, a regulação do metabolismo de carboidratos é complicada. Além disso, ao contrário da pesquisa de metabolismo lipídico vigoroso, grandes estudos prospectivos que avaliam a relação entre carboidratos e doenças metabólicas associadas ainda não foram realizados, e uma avaliação sistemática de dietas com alto teor de açúcar ainda não foi realizada. Consequentemente, há uma necessidade urgente de analisar essas áreas de forma abrangente [6].

Os estudos existentes demonstraram que o controle e a regulação da homeostase da glicose variam muito entre os diferentes organismos, levando a flutuações correspondentes nos níveis de glicose no sangue em diferentes classes de vertebrados. Nestes estudos, os pesquisadores chegaram à conclusão de que as concentrações de glicose no sangue entre os grupos de vertebrados são bastante heterogêneas [7,8,9]. Por exemplo, em mamíferos, a concentração de glicose no sangue é de aproximadamente 7 mM. Os pássaros têm uma concentração de glicose no sangue quase 2 vezes maior do que os mamíferos, e as concentrações em peixes e anfíbios são definitivamente mais baixas do que nos mamíferos [10]. Além disso, os níveis de glicose demonstram variabilidade intraespécie em peixes, anfíbios, répteis, aves e mamíferos. Embora o controle e a regulação da homeostase de carboidratos / glicose sejam atualmente bem conhecidos em espécies representativas de mamíferos (especialmente em roedores e humanos), alguns dos dogmas criados em torno dessas espécies podem não parecer se estender a outros vertebrados. A homeostase da glicose em anfíbios e répteis não tem recebido muita atenção. Graças à importância dos peixes na aquicultura [11,12,13], um número significativo de estudos relatou o controle da homeostase da glicose em inúmeras espécies de peixes. Os peixes teleósteos são geralmente considerados intolerantes à glicose. Em peixes, particularmente em espécies carnívoras, a hiperglicemia pós-prandial prolongada é geralmente observada após alimentação com uma dieta rica em carboidratos [8, 10]. A regulação da glicose em peixes foi discutida em vários estudos [12, 14,15,16,17]. Os estudos existentes demonstraram que o peixe-zebra tem mecanismos reguladores de dependência de insulina semelhantes aos dos mamíferos. Os genes e proteínas responsáveis ​​pela regulação do metabolismo da glicose, foram identificados e demonstraram ter padrões de regulação e atividade semelhantes em peixes-zebra e mamíferos [18,19,20]. Existem também semelhanças e diferenças claras na temperatura corporal, regulação fisiológica, hormonal, uso de carboidratos na dieta e assim por diante quando os peixes (pelo menos Oncorhynchus) são comparados com mamíferos. No entanto, explorar fenômenos de divergência pode ser difícil. Atualmente, a base fisiológica e molecular desta aparente intolerância à glicose em peixes não é totalmente compreendida. As razões pelas quais a glicemia basal é diferente entre peixes e mamíferos e uma compreensão das diferenças no metabolismo de carboidratos entre as espécies são territórios desconhecidos.

Na última década, ferramentas moleculares foram usadas para abordar alguns dos componentes a jusante do metabolismo de carboidratos / glicose e seus processos regulatórios, e esses resultados foram usados ​​para entender melhor os papéis desempenhados pelos carboidratos e seus caminhos regulatórios. No entanto, a maioria dos resultados relativos a um único gene ou vários genes relacionados em uma única espécie tendem a mostrar fortes vieses de amostra e não podem extrapolar de uma espécie para outra. Apenas as abordagens comparativas de todo o genoma, que têm a capacidade de capturar esses sinais multidimensionais, podem ajudar a alcançar uma compreensão em nível de sistema das bases moleculares do metabolismo de carboidratos [21, 22]. Hoje em dia, com o desenvolvimento da tecnologia de sequenciamento de alto rendimento e a disponibilidade de genomas múltiplos e completos de diversas formas de vida, a análise comparativa pode ser usada para fornecer uma nova perspectiva qualitativa sobre as relações homólogas entre genes. Esta análise, por sua vez, permitirá uma compreensão mais profunda das tendências gerais na evolução da complexidade genômica e adaptações específicas da linhagem. Portanto, para confirmar a complexidade e heterogeneidade da homeostase de carboidratos / glicose, adotamos uma abordagem genômica comparativa neste estudo para comparar todos os genes possíveis na via metabólica de carboidratos / glicose como um todo, em vez de analisar um único gene, via ou espécie individualmente. Primeiro construímos um banco de dados de cada gene de carboidrato / glicose em Danio rerio (peixe-zebra), Xenopus tropicalis (Sapo), Gallus gallus (frango), Mus musculus (mouse) e Homo sapiens (humano) e ainda anotou as funções desses genes no diabetes tipo 2. Posteriormente, comparamos sistematicamente esses genes no Danio rerio, Xenopus tropicalis, Gallus gallus, Mus musculus e Homo sapiens genomas. Este estudo fornece os primeiros insights genômicos sistemáticos sobre o metabolismo de carboidratos / glicose, que pode fornecer uma referência para a prevenção e terapia do diabetes tipo 2 humano e pode reduzir os custos da indústria de aquicultura devido à intolerância à glicose.


Introdução

Comparado à superfície terrestre, o espaço representa um ambiente hostil, caracterizado pela combinação de microgravidade e um ambiente radiativo peculiar, que pode levar a graves problemas de saúde para as tripulações de astronautas engajadas em missões de longo prazo. Entre esses fatores, a exposição à radiação dominada por tiros de partículas e GCR de energia extremamente alta é de preocupação especial [1, 2]. A blindagem eficiente dessa radiação é muito difícil, considerando as restrições de massa que as espaçonaves devem respeitar. Portanto, observou-se que & # x0201A falta de conhecimento sobre os efeitos biológicos e as respostas à radiação espacial é o fator mais importante que limita a previsão do risco de radiação associado à exploração espacial humana & # x0201D [3, 4]. As observações do ExoMars Trace Gas Orbiter indicam que uma missão de 6 meses a Marte implicaria em uma dose de radiação igual a 60% do limite que é comumente recomendado para a carreira completa de um astronauta [5]. Sem grandes saltos tecnológicos nas estratégias de blindagem [6], a resiliência biológica intrínseca ou induzida à exposição crônica à radiação espacial provavelmente estará entre os fatores cruciais para decidir sobre a aceitabilidade do risco. A sensibilidade individual à exposição aguda ou crônica à radiação depende do histórico genético [7]. Seguindo os desenvolvimentos recentes em tecnologias de sequenciamento, a determinação de genomas individuais e aquisição de informações multi-omic em indivíduos & # x00027 amostras biológicas tornou-se uma rotina de custo relativamente baixo. Em teoria, esses recursos poderiam permitir a triagem de muitos candidatos à tripulação, para identificar aqueles que possuem antecedentes biológicos particularmente sensíveis ou resistentes. No entanto, nosso conhecimento das características genéticas e biológicas associadas à sensibilidade à radiação espacial ainda é muito limitado [7]. A NASA destacou quatro riscos que podem implicar em preocupações importantes para a saúde dos astronautas: síndrome da radiação aguda, carcinogênese, alterações degenerativas do tecido e perda de desempenho do sistema nervoso central (SNC) [3]. Entre eles, o último é particularmente difícil de entender e prever. No entanto, relatórios recentes começaram a lançar alguma luz sobre este assunto [8, 9].

Nesta revisão, vamos resumir brevemente as características peculiares da radiação espacial e os problemas colocados por sua simulação. Em seguida, destacaremos estudos estabelecidos e mais recentes sobre o impacto das radiações ionizantes e / ou condições espaciais na estrutura e função do SNC, em humanos e modelos experimentais. Em particular, tentaremos resumir os experimentos que, em nossa opinião, são mais informativos no que diz respeito às alterações funcionais do SNC que podem derivar da exposição do cérebro de mamíferos a doses relevantes de partículas de HZE. Para uma perspectiva mais aprofundada sobre esses tópicos, o leitor pode consultar pesquisas mais extensas [10 & # x0201312]. Posteriormente, revisaremos os estudos sobre fatores genéticos que afetam a sensibilidade geral à radiação. Finalmente, iremos destacar os modelos experimentais que podem fornecer uma visão fundamental sobre os fatores genéticos e biológicos que influenciam a resposta de redes neurais maduras à radiação espacial, com particular atenção a C. elegans.


Discussão

Aqui, discutimos como as combinações multi-hit identificadas acima podem ser usadas para identificar mutações cancerígenas (condutor) e não cancerígenas (passageiro) dentro dos genes. Também ilustramos como essas combinações podem ser usadas para projetar uma terapia de combinação visando as mutações genéticas específicas responsáveis ​​por casos individuais de câncer.

Distinguir entre mutações do motorista e do passageiro

O método usado para identificar combinações multi-hit usa uma abordagem baseada em frequência de mutação para selecionar preferencialmente genes condutores em vez de genes passageiros, ou seja, os genes selecionados têm uma frequência de mutação significativamente maior em amostras de tumor em comparação com amostras normais. Para cada gene, a frequência de mutação em amostras normais é considerada aproximadamente representativa da frequência de mutação de fundo para o gene. No entanto, dentro desses genes, nem todas as mutações são cancerígenas.

As combinações encontradas acima fornecem um ponto de partida para examinar um subconjunto menor de genes mais de perto para identificar mutações carcinogênicas específicas dentro desses genes. Na identificação das combinações multi-hit, não levamos em consideração a localização das mutações dentro dos genes. Claramente, existem locais dentro de um gene onde certas mutações provavelmente não afetarão a função do produto do gene. Essas mutações podem resultar em falsos positivos e contribuir para o grande número (65%) de amostras de tumor contendo múltiplas combinações (Fig. 4). Considere, por exemplo, a combinação 2-hit de mutações em IDH1 e MUC6 em amostras de tumor de glioma de baixo grau (LGG) do cérebro. Das 479 amostras de tumor LGG, 134 (28%) contêm mutações em ambos IDH1 e MUC6, enquanto 5 (1,5%) das 333 amostras de tecido normal contêm uma mutação em ambos os genes (Fig. 6). Comparar as mutações dentro desses genes para amostras normais e tumorais pode revelar quais são cancerígenas e quais não são. Neste exemplo, cada uma das amostras de tumor contém uma mutação missense em R132 em IDH1 e nenhuma outra mutação, enquanto as amostras normais não contêm nenhuma mutação nesta posição (Fig. 6). Mutações em R132 em IDH1 foram previamente implicadas no câncer 33. Por outro lado, é improvável que as mutações IDH1 vistas nas amostras normais sejam cancerígenas. Da mesma forma, as mutações em F1989 de MUC6, que ocorrem com mais frequência em amostras tumorais e normais, provavelmente não são cancerígenas (Fig. 6). A exclusão de tais mutações não cancerígenas pode reduzir o número de falsos positivos e aumentar ainda mais a precisão do nosso algoritmo. Em nosso trabalho futuro, desenvolveremos um método automatizado para comparar e contrastar os loci de genes individuais, de modo que todas essas mutações dentro dos genes possam ser identificadas. Para melhorar ainda mais a precisão do nosso algoritmo, as variantes com probabilidade de serem cancerígenas podem ter um peso maior do que aquelas que provavelmente não são cancerígenas.

Mutações em amostras de tumor de glioma de grau normal e inferior (LGG) com mutações em IDH1 e MUC6. A diferença nas mutações entre as amostras normais e tumorais para a mesma combinação de 2 acertos pode ser usada para refinar ainda mais o algoritmo de pesquisa. Nos exemplos acima, uma mutação missense em R132 em IDH1 é provavelmente carcinogênica, enquanto mutações em F1989 em MUC6 são improváveis ​​de serem carcinogênicas. Barras coloridas representam domínios de proteínas funcionais conhecidos. Barras cinza representam regiões de função desconhecida. Os pontos verdes representam mutações missense, os pontos pretos representam mutações truncadas e os pontos roxos representam outras mutações que alteram as proteínas. Figura gerada usando cBioPortal (Cerami et al. e Gao et al.) 44,45 .

Alguns dos genes identificados por nossa abordagem podem não ser causadores (mutações de passageiros), embora possam estar relacionados à incidência de câncer. A análise funcional pode ser usada para identificar genes no conjunto de combinações acima que são improváveis ​​de serem genes condutores, embora possam ser frequentemente mutados em tumores 11,34,35. Por exemplo, o efeito de mutações específicas nos níveis de expressão gênica pode ser analisado para determinar se a mutação provavelmente terá um efeito funcional. Além disso, podemos analisar as vias afetadas pelas combinações de genes (Tabelas S19 – S22). Estudos mostram que combinações de mutações no gene driver geralmente afetam vias mutuamente exclusivas 36. Portanto, um dos genes em uma combinação multi-hit que afeta a mesma via pode incluir mutações passageiras. Embora na maioria dos casos várias vias diferentes sejam afetadas pelas combinações de genes, as Tabelas S19-S22 mostram que em alguns casos (por exemplo, MUC6 e MUC12 em BRCA) a mesma via é afetada por ambos os genes na combinação. Uma análise posterior seria necessária para determinar se as mutações dentro de um desses genes são mutações passageiras.

O algoritmo de pesquisa pode ser executado iterativamente para refinar incrementalmente a lista de combinações de multi-hit, excluindo essas mutações de passageiros. A entrada para nosso algoritmo é uma lista de genes com mutações para cada amostra. Genes com apenas mutações de passageiro podem ser excluídos desta lista para minimizar a inclusão de mutações de passageiro nas combinações multi-hit resultantes.

Uma base racional para a terapia combinada

As combinações identificadas acima, com mais refinamento e validação clínica, podem representar uma base mais racional para a terapia combinada direcionada, em vez dos atuais "casamentos de conveniência" 27 com justificativa biológica limitada 26. Uma estratégia mais racional também pode reduzir o risco de falhas dispendiosas, como o estudo de fase III de imfinzi mais tremelimumabe. A combinação de terapias para um determinado paciente pode ser projetada para atingir combinações carcinogênicas específicas de mutações genéticas encontradas no paciente. Embora apenas 30 dos 256 genes nas combinações identificadas acima tenham sido formalmente identificados como "genes do câncer" no catálogo de mutações somáticas no câncer (COSMIC), muitos dos outros genes foram previamente implicados no câncer (Tabela 2). As terapias que têm como alvo muitos dos genes em ambas as categorias podem estar disponíveis ou em desenvolvimento. Por exemplo, a combinação de mutações em TP53 e IGHG1 ocorre em 41% das amostras de tumor HNSC em TCGA. Vários medicamentos que podem restaurar a função do TP53, esgotar o TP53 mutante ou afetar alvos a jusante estão atualmente em desenvolvimento pré-clínico 37. O silenciamento direcionado por siRNA de IGHG1 demonstrou inibir a viabilidade celular e promover a apoptose, que pode, portanto, atuar como um alvo potencial na terapia gênica do câncer 38,39. Para pacientes com esta combinação de mutações, uma terapia de combinação direcionada a ambos os genes pode ser mais eficaz em combinação do que separadamente.


Materiais e métodos

Declaração de ética

O manejo e a manipulação dos animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética Animal da Universidade de Otago sob o protocolo 48-11.

Preparação de amostra

As cepas AB de peixe-zebra adulto usadas para este estudo foram mantidas no Otago Zebrafish Facility, Departamento de Patologia, Universidade de Otago. Os cérebros foram dissecados de 12 homens e 12 mulheres e, em seguida, cada cérebro foi dividido pela metade no plano sagital. Seis cérebros masculinos divididos pela metade foram combinados em uma amostra agrupada denominada Male1. Da mesma forma, Masculino2, Feminino1 e Feminino2 eram compostos por um conjunto de seis cérebros divididos pela metade. Fígados (n = 10) foram colhidos por dissecção de peixes machos e fêmeas de tipo selvagem e agrupados. O DNA genômico foi extraído de cada amostra usando o Mini Kit PureLink Genomic DNA (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.

Preparação e sequenciamento da biblioteca RRBS

Bibliotecas de DNA genômico convertido por bissulfito foram preparadas de acordo com os métodos descritos anteriormente. 37, 61 Resumidamente, o DNA genômico foi digerido durante a noite com MspI (New England Biolabs), seguido de reparo final e adição de saliências 3 ′ A. Adaptadores metilados (Illumina) com uma saliência 3 ′ T foram ligados aos fragmentos de DNA de cauda A. Para representação reduzida, fragmentos de 40 a 220 bp (tamanho de pré-adaptador-ligação) foram excisados ​​de géis de agarose Nusieve a 3% (Lonza) e bissulfito convertidos com o kit EZ DNA metilação Gold (Zymo Research). Bibliotecas convertidas em bissulfito foram amplificadas por PCR e sequenciadas em um sequenciador Illumina HiSeq2000 com uma execução de 49 bp de extremidade única (Beijing Genomics Institute). Os arquivos de sequência FASTQ foram obtidos contendo leituras sequenciadas para cada amostra (Fig. S1). Para fígado de peixe-zebra, 9 milhões de leituras de terminação única e 100 bp foram sequenciadas (New Zealand Genomics Limited).

Verificação da qualidade da sequência e alinhamento

Para leituras sequenciadas obtidas para cada amostra individual, as verificações de qualidade das leituras, processamento e alinhamentos foram realizadas de acordo com nosso pipeline publicado anteriormente. 37 A qualidade das leituras sequenciadas em todas as bibliotecas de peixe-zebra foi alta com uma pontuação de Phred mediana de & gt 30 até o final do último ciclo de sequenciamento (consulte o gráfico de qualidade FastQC representativo na Figura S2 O pacote de software FastQC é distribuído do Babraham Institute). Como resultado, o corte da extremidade 3 ′ das leituras não foi necessário para essas bibliotecas. No entanto, para a biblioteca RRBS de fígado de peixe-zebra, cortamos as leituras sequenciadas de 100 bp a 65 bp, pois os valores de pontuação de Phred caíram significativamente após o ciclo de sequenciamento de 65. As sequências do adaptador foram removidas das leituras usando nosso interno programa cleanadaptors. 37 Para as leituras sequenciadas de 49 bp, os traços das sequências do adaptador nas leituras foram mínimos, conforme confirmado por cleanadaptors e FastQC (de leituras sequenciadas da Illumina, pesquisas FastQC para sequências de adaptadores conhecidas da Illumina). As leituras sequenciadas foram alinhadas contra o genoma de referência do peixe-zebra Zv9 usando o programa de alinhamento de bissulfito Bismark v0.6.4. 62 Os alinhamentos foram executados em um Mac Pro com processadores Intel Xeon dual quad core de 64 bits e 22 Gb de RAM executando MacOS 10.6.

Análise de dados RRBS

A partir da montagem do genoma inteiro do peixe-zebra (Zv9), um em sílico O genoma de representação reduzida (RR) com base em locais de clivagem MspI (C ^ CGG) e tamanhos de fragmento de 40–220 bp foi gerado pelo programa mkrrgenome. 37 Scripts e comandos personalizados do UNIX e awk (uma linguagem de programação interpretada) foram usados ​​para descrever a distribuição de fragmentos no genoma. A análise de metilação foi realizada usando o pacote R do methylKit. 63 Resumidamente, após o alinhamento pelo Bismark, os arquivos SAM contendo leituras alinhadas exclusivamente foram classificados numericamente e, em seguida, processados ​​no R studio (versão 0.97.312) usando o pacote methylKit. Sites CpG cobertos por pelo menos 10 leituras sequenciadas (denominadas como CpG10) foram retidos para gerar o metiloma de referência. Cada local CpG sequenciado e filtrado foi atribuído a uma pontuação percentual de metilação. Os gráficos de cobertura e correlação foram gerados pelo methylKit usando o arquivo SAM classificado para as amostras. Dados de sequenciamento de bissulfito do genoma total do cérebro humano e de camundongo para amostras de controle foram baixados do MethylomeDB 64 e processados ​​com scripts UNIX e awk (ver Tabela S1).

Para investigar CpG10 posições, em relação ao gene e características CpG, a informação da tabela de características SeqMonk para Zv9 foi usada. O SeqMonk (distribuído gratuitamente pelo Babraham Institute) fornece arquivos .DAT contendo informações sobre ilhas CpG e genes no peixe-zebra. Esses arquivos foram analisados ​​por um programa específico (identgeneloc), que então identificou genes proximais e ilhas CpG para o CpG10 sites. A informação resultante foi posteriormente processada com scripts awk para gerar a distribuição de CpG10 posições.

* No intervalo de tamanho de 40–220 bp. † cálculo in silico do genoma RR total. ‡ Dados RRBS baseados em leituras de 100 bp, de Smith et al. 65 § Baseado na última compilação do Zv9. 45

* Conforme indicado por Bismark, esta porcentagem é a soma de dois fatores: a metilação não-CpG real no genoma + possível conversão de bissulfito incompleta. No entanto, a análise do methylKit mostrou conversão consistente do bissulfito (99%) para todas as amostras. Masculino1–2, Fêmea1–2 são de cérebro de peixe-zebra.

* CpG10 refere-se ao dinucleotídeo, que é coberto por pelo menos 10 leituras após o sequenciamento e alinhamento.

* As porcentagens de metilação para cérebro de peixe-zebra (macho 1-2 e fêmea 1-2) e amostras de RRBS de fígado foram calculadas em CpG10 como parte do estudo atual. As porcentagens de espermatozoide, ovo, músculo e esfera do peixe-zebra foram derivadas do sequenciamento de bissulfito do genoma inteiro publicado recentemente. 20 † Quatro horas pós-fertilização.

* Esses dados são gerados a partir da amostra Male1, outras amostras mostraram tendência semelhante.


Direções futuras

O campo da biomecânica atualmente se beneficia de uma abordagem integrativa que incorpora conceitos de biologia, física e engenharia. Da mesma forma, a aplicação de uma abordagem integrativa que une os campos da biomecânica, comportamento e evolução tem o potencial de contribuir com insights de forma-função na evolução do desempenho biomecânico ao longo do tempo. As interações predador-presa, em particular, podem servir como um sistema modelo para investigação integrativa devido ao seu forte efeito na aptidão e sua dependência no desempenho locomotor.

Unir diversos estudos de interações predador-presa de campos distintos é possível quando classificado pelas estratégias de predadores e presas. Cada uma das estratégias apresentadas acima tem padrões comportamentais e sensório-motores característicos que favorecem formas distintas de locomoção tanto para predação quanto para fuga. A identificação de mecanismos subjacentes que medeiam tais interações permite a comparação até mesmo de animais taxonomicamente distantes que compartilham uma estratégia comum para revelar padrões coevolucionários comuns entre predador e presa. Assim, as interações predador-presa representam um sistema de estudo experimental modelo para incorporar a ecologia locomotora à investigação biomecânica, o que aumenta a aplicabilidade dos resultados biomecânicos às hipóteses evolutivas.

Na verdade, ao adotar essa abordagem integrativa, pode ser possível determinar se as estratégias de predação favorecem certos padrões evolutivos. Por exemplo, a fuga da predação é freqüentemente citada como um potencial impulsionador da expansão ou contração de nichos (Colwell e Fuentes 1975 Sexton et al. 2009). As transições evolutivas da água para a água, como as radiações adaptativas após a invasão de uma nova matriz locomotora.


Introdução

A transição de uma sociedade das dietas tradicionais para as baseadas no mercado (denominada transição nutricional) tem sido associada a profundas mudanças na cultura e na saúde (1–4). Muitas populações circumpolares indígenas estão passando por essa transição (5–7), que está associada ao aumento das taxas de doenças crônicas (6, 8). A mudança dietética pode ser difícil de monitorar devido em parte à falta de dados de referência e em parte às limitações dos métodos existentes para avaliação dietética. Métodos de autorrelato que são viáveis ​​de coletar de grandes populações (por exemplo, FFQ) estão sujeitos a grande erro e viés (9, 10), enquanto métodos mais confiáveis ​​(por exemplo, recordação repetida de 24 horas) podem ser proibitivamente caros (11, 12). Os biomarcadores dietéticos fornecem uma alternativa promissora aos métodos de autorrelato, porque são imparciais, são mais confiáveis ​​e podem ser medidos a partir de amostras arquivadas (13– 16). Estamos desenvolvendo biomarcadores de ingestão tradicional e de mercado para a população Yup'ik Eskimo do sudoeste do Alasca com base na abundância relativa de isótopos estáveis ​​de carbono e nitrogênio de ocorrência natural (17, 18). Os marcadores isotópicos têm sido amplamente utilizados como marcadores da dieta em estudos ecológicos e antropológicos (19–22). Além disso, eles são baratos para medir, precisos e podem ser medidos em vários tipos de tecido, incluindo soro, hemácias e cabelo (16–18, 23, 24).

Biomarcadores de isótopos estáveis ​​são informativos na população Yup'ik, porque muitos alimentos tradicionais e de mercado comumente consumidos são isotopicamente distintos (25–29). A proporção de isótopos estáveis ​​com nitrogênio (δ 15 N) indica o consumo de mamíferos marinhos e peixes (25, 28), que são um grande componente da dieta Yup'ik tradicional (30-32). Este biomarcador foi recentemente validado para Yup'ik Eskimos com base em comparações com os ácidos graxos marinhos EPA e DHA (17, 18). Assim, propomos que δ 15 N indicará o consumo de alimentos marinhos tradicionais nesta população. A razão de isótopos de carbono (δ 13 C) é elevada em plantas usando o C4 (Hatch-Slack) via fotossintética em relação àquelas que usam o C mais comum3 (Calvin) via fotossintética (33). Os representantes mais comuns dessas plantas no sistema agrícola dos Estados Unidos são o milho e a cana-de-açúcar, que estão amplamente presentes na dieta do mercado como adoçantes (29), como ingredientes de alimentos processados ​​e, indiretamente, por meio de animais domésticos criados com milho (34, 35 ) A razão de isótopos de carbono mostrou associações moderadas com C relatado4Adoçante à base de adoçante e ingestão de bebidas adoçadas na população dos EUA (23, 24, 36). Aqui, propomos que δ 13 C fornecerá um biomarcador independente da ingestão alimentar de mercado para a população esquimó Yup'ik.

O objetivo geral deste estudo foi avaliar biomarcadores isotópicos de mercado e ingestão de alimentos tradicionais em uma população de estudo Yup'ik Eskimo. O desenvolvimento de marcadores confiáveis ​​e precisos de mudança alimentar para essa população pode ajudar a prever aumentos na incidência da doença e desenvolver intervenções dietéticas adequadas. Os objetivos específicos deste estudo foram três vezes. Primeiro, determinamos as relações esperadas entre a ingestão dietética e as razões de isótopos de RBC, completando uma análise abrangente dos valores de δ 15 N e δ 13 C em alimentos tradicionais e de mercado importantes para a população Yup'ik. Em segundo lugar, avaliamos a associação entre RBC δ 15 N e ingestão relatada de peixes e mamíferos marinhos, e RBC δ 13 C e ingestão de alimentos de mercado relatada com base em 4 dias de registros de dieta de 230 esquimós Yup'ik. Finalmente, avaliamos se as variações na ingestão alimentar por idade, localização na comunidade e identidade cultural que foram previamente relatadas para esta população com base em autorrelato também foram observadas usando biomarcadores isotópicos (30, 37-39). A natureza extensa da avaliação dietética anterior nesta população fornece uma estrutura ideal para avaliar a eficácia desses biomarcadores propostos.


Conclusão

O constante desenvolvimento das novas tecnologias pode ajudar a elucidar os mecanismos dessa doença complexa e intrigante. As tecnologias de sequenciamento de próxima geração nos fornecerão grandes quantidades de dados e, em breve, seremos capazes de sequenciar todo o genoma do paciente, o que poderia ajudar a entender como uma mutação entre os genes modificadores para estabelecer o fenótipo. Essa tecnologia também pode ser aplicada ao sequenciamento de RNA e poderemos ter todo o perfil do transcriptoma do paciente, ajudando-nos a visualizar o impacto da mutação na cascata de sinalização.

Uma rede de expressão comparativa de genes relacionados com cardiomiopatias pode nos dar uma ideia de como esses genes interagem uns com os outros. Por enquanto, podemos dizer que ainda há muito trabalho a fazer até que tenhamos respostas definitivas sobre CMH, mas uma triagem genética dos pacientes traz vários benefícios, para o paciente e para os médicos, e deve ser usada na prática médica.


Assista o vídeo: Peixe-zebra #3 Lab Day (Fevereiro 2023).