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Eficiência de PCR ou rendimento de DNA com primer único

Eficiência de PCR ou rendimento de DNA com primer único


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Como calcular o número de moléculas de DNA sintetizadas após 'n' no. ciclos com primer único (somente primer direto ou primer reverso)? Existe alguma fórmula para calcular o rendimento de DNA após tal PCR?

Supondo que estou configurando uma reação de PCR para 100 moléculas de DNA modelo por 30 ciclos, com apenas um primer - primer direto para o gene alvo. Quantas moléculas de DNA serão geradas ao final de 30 ciclos. Todas as outras condições permanecem as mesmas.

Obrigado.


Tecnicamente, se você usar apenas 1 primer, não será mais PCR.

Mas isso é o que vai acontecer se você tiver 100 moléculas de DNA modelo (feitas da fita A e da fita complementar B) e abundância de primer (digamos, 10x ou 1000 moléculas):

  1. No primeiro ciclo, os primers se ligam ao DNA molde, mas apenas a uma fita (por exemplo, A)
  2. A DNA polimerase irá estender esses primers, criando fitas complementares B '. Algumas fitas B 'serão mais curtas do que o modelo porque o DNA pol não é perfeito
  3. O complexo DNA-primer irá derreter no início do ciclo 2
  4. No início do ciclo 2, as moléculas de iniciador irão novamente se ligar ao molde, novamente às fitas A, e o processo continua

Uma vez que não há nenhuma etapa onde a fita A está sendo copiada, este processo será linear, não uma "reação em cadeia". Em cada ciclo você obterá a mesma quantidade de fios B '.

É difícil dizer quantas moléculas B 'você obterá em cada ciclo, mas ao final de 30 ciclos, será no máximo 30 vezes do primeiro ciclo. Lembre-se, porém, de que a DNA polimerase se degrada e o ciclo 30 será menos eficiente do que o ciclo 1.

Supondo que a polimerase perfeita e que o tempo de extensão seja longo o suficiente, você obterá 100 fios B 'no ciclo 1, 100 fios B' no ciclo 2 e assim por diante. Ao final de 30 ciclos, você terá 30x100 fios B ', e 100 fios A e 100 fios B.


Compreender a eficiência do qPCR e por que ela pode exceder 100%

A reação em cadeia da polimerase quantitativa (ou qPCR) é um ensaio bem estabelecido para quantificação de ácido nucleico e ainda é considerado o método de escolha na maioria das áreas da biologia molecular. Embora existam diferentes tipos de quantificação qPCR (absoluta e relativa), Determinando as eficiência de amplificação deve estar entre os primeiras coisas a fazer ao configurar um ensaio qPCR. Compreender a eficiência e como calculá-la é crucial para uma interpretação precisa dos dados.

Idealmente, o número de moléculas da sequência alvo deve dobrar durante cada ciclo de replicação, correspondendo a uma eficiência de amplificação de 100%. Da mesma forma, se o número de moléculas replicadas for menor que o dobro, isso se deve à baixa eficiência & # 8211 abaixo de 100%. Os motivos mais comuns para eficiências mais baixas são desenho de primer ruim e concentrações de reagentes não ideais ou condições de reação. Estruturas secundárias como dímeros e grampos de cabelo ou temperaturas de fusão inadequadas (Tm) podem afetar o recozimento do modelo de primer, o que resulta em uma amplificação pobre. Uma vez que cada diluição adicional contém quantidades iniciais adequadamente mais baixas de DNA, ocorrem diferenças entre os valores de Ct em amostras diluídas em série (ver abaixo).

As diferenças entre os valores de Ct das etapas de diluição conhecidas são maiores do que o previsto. As diluições de 10 vezes devem ter 3,3 ciclos de intervalo, mas, neste caso, eles estão mais distantes.

Uma forma de calcular a eficiência da amplificação é fazer diluições em série de seu alvo. Depois de obter seus valores Ct, plote-os em uma escala logarítmica junto com as concentrações correspondentes. Em seguida, gere uma curva de regressão linear através dos pontos de dados e calcule a inclinação da linha de tendência. Finalmente, a eficiência é calculada usando a equação: E = -1 + 10 (-1 / declive). Ou use esta calculadora que faz o trabalho para você. Certifique-se de entender o que influencia a inclinação da curva de amplificação, pois, de outra forma, pode ser enganosa.

Tipicamente, as eficiências de amplificação desejadas variam de 90% a 110%. O máximo teórico de 100% indica que a enzima polimerase está trabalhando na capacidade máxima. Como as eficiências acima de 100% são possíveis então? Isso significaria que mais de duas cópias da sequência são geradas em cada ciclo de qPCR, certo?

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Visão geral

A associação complementar específica devido à ligação de hidrogênio de ácidos nucleicos de fita simples é referida como "recozimento": duas sequências complementares formarão ligações de hidrogênio entre suas bases complementares ( G para C, e A para T ou U ) e formar uma molécula de cadeia dupla, antiparalela & quothybrid & quot estável. Pode-se fazer ácido nucleico (NA) de fita simples com a finalidade de recozimento - se já não for de fita simples, como a maioria dos vírus de RNA - aquecendo-o até um ponto acima da "temperatura de fusão" da forma de fita dupla ou parcialmente dupla e, em seguida, resfriando rapidamente: isso garante que os fios "desnaturados" ou separados não recozam novamente. Além disso, se o NA for aquecido em buffers de força iônica menor que 150mM NaCl, a temperatura de fusão é geralmente inferior a 100oC - é por isso que o PCR funciona com temperaturas de desnaturação de 91-97 o C.

Um tratamento mais detalhado de recozimento / hibridação é fornecido em uma página anexa, juntamente com explicações sobre cálculos de complexidade, condições para recozimento / hibridização, etc.

Polimerase Taq é dado como tendo um meia-vida de 30 min em 95 o C, o que é em parte porque não se deve fazer mais do que cerca de 30 ciclos de amplificação: no entanto, é possível reduzir o denaturação temperatura após cerca de 10 rodadas de amplificação, como o comprimento médio do DNA alvo é diminuído : para modelos de 300 bp ou menos, a temperatura de desnaturação pode ser reduzida para tão baixo quanto 88 o C para 50% (G + C) modelos (Yap e McGee, 1991), o que significa que se pode fazer tantos quanto 40 ciclos sem muita diminuição na eficiência da enzima.

& quotTempo na temperatura& quot é a principal razão para a desnaturação / perda de atividade da Taq: assim, se reduzirmos isso, aumentar o número de ciclos possíveis , quer a temperatura seja reduzida ou não. Normalmente, o tempo de desnaturação é 1 min a 94 o C: é possível, para sequências de modelo curtas, reduza para 30 segundos ou menos. Aumento na temperatura de desnaturação e diminuição no tempo também podem funcionar: Innis e Gelfand (1990) recomendam 96 o C por 15 s.

Temperatura de recozimento e design de primer

Comprimento e sequência do primer são de importância crítica no projeto dos parâmetros de uma amplificação bem-sucedida: a temperatura de fusão de um duplex NA aumenta tanto com o seu comprimento quanto com o aumento do conteúdo (G + C): uma fórmula simples para o cálculo do Tm é

Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T) o C.

Assim, a temperatura de recozimento escolhida para um PCR depende diretamente no comprimento e na composição do (s) primer (es). Deve-se ter como objetivo o uso de uma temperatura de recozimento (Ta) sobre 5 o C abaixo do Tm mais baixo do par de primers a ser usado (Innis e Gelfand, 1990). Um tratamento mais rigoroso de Ta é dado por Rychlik et al. (1990): eles sustentam que se o Ta é aumentado em 1 o C a cada dois ciclos, a especificidade da amplificação e o rendimento dos produtos & lt1kb em comprimento são aumentados. Uma consequência de ter um Ta muito baixo é que um ou ambos os primers anelar a sequências diferentes do verdadeiro alvo, como incompatibilidades internas de base única ou recozimento parcial podem ser tolerados: isso é bom se alguém deseja amplificar alvos semelhantes ou relacionados no entanto, pode levar a amplificação "não específica" e conseqüente redução no rendimento do produto desejado, se a base mais 3 & # 39 estiver emparelhada com um alvo.

Uma consequência de um Ta muito alto é que muito pouco produto será feito , como a probabilidade de recozimento do primer é reduzida, outra consideração importante é que um par de primers com Tas muito diferentes pode nunca dar rendimentos apreciáveis ​​de um produto único, e também pode resultar em & quot inadvertidaassimétrico& quot ou amplificação de cadeia simples da cadeia de produto iniciada de forma mais eficiente.

O recozimento não demora muito: a maioria dos primers irá recozer com eficiência em 30 segundos ou menos, a menos que o Ta esteja muito próximo ao Tm, ou a menos que sejam excepcionalmente longos.

Uma ilustração do efeito da temperatura de recozimento na especificidade e no rendimento da amplificação de Vírus do papiloma humano tipo 16 (HPV-16) é dado abaixo (Williamson e Rybicki, 1991: J Med Virol 33: 165-171).

Os modelos de DNA de amostra de plasmídeo e biópsia foram amplificados em diferentes temperaturas de anelamento, conforme mostrado: observe que, enquanto o plasmídeo é amplificado de 37 a 55 o C, o DNA do HPV é apenas especificamente amplificado em 50 o C.

Comprimento do primer

O comprimento ideal de um primer depende de seu conteúdo (A + T), e o Tm de seu parceiro se corre o risco de ter problemas como os descritos acima. Além do Tm, um a consideração principal é que os iniciadores devem ser complexos o suficiente para que a probabilidade de emparelhamento com sequências diferentes do alvo escolhido seja muito baixa. (Ver o documento hybridn).

Por exemplo, há uma chance & frac14 (4 -1) de encontrar um A, G, C ou T em qualquer sequência de DNA, há 1/16 de chance (4 -2) de encontrar qualquer sequência de dinucleotídeo (por exemplo, AG) uma chance de 1/256 de encontrar uma determinada sequência de 4 bases. Assim, um a sequência de dezesseis bases estará estatisticamente presente apenas uma vez em cada 4 16 bases (= 4 294 967 296, ou 4 bilhões): trata-se do tamanho do genoma humano ou do milho e 1000x maior do que o tamanho do genoma de E. coli . Assim, a associação de um oligonucleotídeo com mais de 17 bases com sua sequência alvo é um processo extremamente específico para a sequência, muito mais do que a especificidade dos anticorpos monoclonais na ligação a determinantes antigênicos específicos. Consequentemente, Iniciadores de 17-mer ou mais são rotineiramente usados ​​para amplificação de DNA genômico de animais e plantas. Um comprimento de primer muito longo pode significar que mesmo altas temperaturas de recozimento não são suficientes para evitar o emparelhamento incompatível e o priming não específico.

Primers Degenerados

Para amplificação de sequências cognatas de diferentes organismos, ou para & quotevolucionário PCR & quot, pode-se aumentar as chances de obter o produto por projetando primers & quotdegenerate & quot: estes seriam de fato um conjunto de iniciadores que têm uma série de opções em várias posições na sequência de modo a permitir o emparelhamento e amplificação de uma variedade de sequências relacionadas . Por exemplo, Compton (1990) descreve o uso de conjuntos de iniciadores de 14 meros com 4 e 5 degenerescências como iniciadores diretos e reversos, respectivamente, para a amplificação da glicoproteína B (gB) de herpesvírus relacionados. A sequência do primer reverso foi a seguinte:

TCGAATTCNCCYAAYTGNCCNT

onde Y = T + C, e N = A + G + C + T, e a extensão do terminal 5 & # 39 de 8 bases compreende um EcoRI local (sublinhado) e espaçador de flanco para garantir o enzima de restrição pode cortar o produto (o catálogo da New England Biolabs fornece uma boa lista de quais enzimas exigem quanto tempo uma sequência de flanqueamento para cortar pontas de pontas). As degenerescências obviamente reduzem a especificidade do (s) primer (es), o que significa que as oportunidades de incompatibilidade são maiores e o ruído de fundo também aumenta, aumento da degenerescência significa que a concentração dos primers individuais diminui assim, degenerescência superior a 512 vezes deve ser evitada. No entanto, usei primers com degenerescência de até 256 e 1024 vezes para a amplificação bem-sucedida e subsequente sequenciamento direto de uma ampla gama de Mastrevírus contra um fundo de DNA genômico de milho (Rybicki e Hughes, 1990).

As sequências de iniciador foram derivadas de alinhamentos de sequência múltipla, as posições de incompatibilidade foram usadas como degenerescências de 4 bases para os iniciadores (mostrado como estrelas 5 em F e 4 em R), como mostrado acima. Apesar de sua degenerescência, os primers podem ser usados ​​para amplificar uma sequência de 250 bp de vírus que diferem na sequência em até 50% sobre a sequência alvo e 60% no geral. Eles também podem ser usados ​​para detectar com muita sensibilidade a presença de Vírus da estria do milho DNA contra um fundo de DNA genômico de milho, em diluições tão baixo quanto 1/10 9 seiva infectada / seiva saudável (Veja abaixo).

Alguns grupos usam desoxinossina (dI) em posições degeneradas, em vez de usar oligos mistos: este par de bases com qualquer outra base, efetivamente dando uma degenerescência quádrupla em qualquer posição no oligo onde está presente. Isso diminui os problemas relacionados ao esgotamento de oligos únicos específicos em uma mistura altamente degenerada, mas pode resultar em uma degenerescência muito alta onde há 4 ou mais dIs em um oligo.

Temperatura e tempo de alongamento

Normalmente é 70 - 72oC, por 0,5 - 3 min. Taq, na verdade, tem uma atividade específica a 37oC, que é muito próxima daquela do fragmento de Klenow de E coli DNA polimerase I, responsável pelo aparente paradoxo que resulta quando se tenta entender como os primers que recozem em uma temperatura ótima podem ser alongados a uma temperatura consideravelmente mais alta - a resposta é que o alongamento ocorre a partir do momento do recozimento, mesmo que seja transitório, o que resulta em uma estabilidade consideravelmente maior. Por volta de 70oC, a atividade é ótima, e a extensão do primer ocorre em até 100 bases / seg. Cerca de 1 min é suficiente para a amplificação confiável de sequências de 2 kb (Innis e Gelfand, 1990). Produtos mais longos exigem tempos mais longos: 3 min é uma boa aposta para produtos de 3 kb e mais longos. Tempos mais longos também podem ser úteis em ciclos posteriores, quando a concentração do produto excede a concentração da enzima (& gt1nM) e quando a depleção de dNTP e / ou primer pode se tornar limitante.

Tampão de reação

Os buffers recomendados geralmente contêm:

  • Tris-HCl 10-50mM pH 8,3,
  • até 50mM KCl, 1,5mM ou mais MgCl2,
  • primers 0,2-1uM cada primer,
  • 50 - 200 uM cada dNTP,
  • gelatina ou BSA para 100ug / ml,
  • e / ou detergentes não iônicos tal como Tween-20 ou Nonidet P-40 ou Triton X-100 (0,05 - 0,10% v / v)

(Innis e Gelfand, 1990). As formulações modernas podem diferir consideravelmente, entretanto - elas também são geralmente proprietárias.

PCR deve funcionar bem em tampão de transcriptase reversa, e vice-versa, o que significa que protocolos de 1 tubo (com síntese de cDNA e subsequente PCR) são possíveis (Krawetz et al., 19xx Fuqua et al., 1990).

Mais de 50 mM de KCl ou NaCl inibe Taq, mas alguns são necessários para facilitar o recozimento do primer.

[Mg2 +] afeta o recozimento do primer Tm de associações de modelo, produto e primer-modelo, especificidade do produto, atividade enzimática e fidelidade. Taq requer gratuitamente Mg2 +, portanto, devem ser feitas concessões para dNTPs, primers e molde, todos os quais quelam e sequestram o cátion destes, dNTPs são os mais concentrados, então [Mg2 +] deve ser 0,5 - 2,5 mM maior do que [dNTP]. A titulação deve ser realizada com variação de [Mg2 +] com todas as novas combinações de modelo-primer , visto que estes podem diferir marcadamente em seus requisitos, mesmo sob as mesmas condições de concentrações e tempos / temperaturas de ciclo.

Algumas enzimas não precisam de proteína adicionada, outros dependem disso. Algumas enzimas funcionam muito melhor na presença de detergente, provavelmente porque previne a tendência natural da enzima de se agregar.

As concentrações de primer não devem ultrapassar 1uM a menos que haja um alto grau de degenerescência, 0,2 µM é suficiente para iniciadores homólogos.

Concentração de nucleotídeo não precisam estar acima de 50 µM cada: produtos longos podem exigir mais, no entanto.

Número do Ciclo

O número de ciclos de amplificação necessários para produzir uma banda visível em um gel depende muito da concentração inicial do DNA alvo: Innis e Gelfand (1990) recomendam de 40 - 45 ciclos para amplificar 50 moléculas alvo , e 25-30 para amplificar 3x105 moléculas para a mesma concentração. Essa desproporcionalidade se deve a uma chamada efeito platô, que é a atenuação na taxa exponencial de acúmulo de produto nos estágios finais de uma PCR, quando o produto atinge 0,3-1,0 nM. Isso pode ser causado pela degradação dos reagentes (dNTPs, enzimas), depleção do reagente (primers, dNTPs - primeiro um problema com produtos curtos, os últimos para produtos longos) competição de inibição do produto final (formação de pirofosfato) por reagentes por competição de produtos não específicos por ligação do primer por recozimento do produto concentrado (10 nM) (Innis e Gelfand, 1990).

Se o produto desejado não for feito em 30 ciclos , pegue uma pequena amostra (1ul) da mistura amplificada e amplificar novamente 20-30x em uma nova mistura de reação, em vez de estender a execução para mais ciclos: em alguns casos onde a concentração do modelo é limitante, isso pode dar um bom produto onde a extensão do ciclo para 40x ou mais não.

Uma variante disso é PCR de primer aninhado : A amplificação por PCR é realizada com um conjunto de iniciadores e, em seguida, algum produto é obtido - com ou sem remoção de reagentes - para re-amplificação com um conjunto de iniciadores "aninhados" internamente situado. Esse processo adiciona outro nível de especificidade, o que significa que todos os produtos amplificados não especificamente na primeira rodada não serão amplificados na segunda. Isso é ilustrado abaixo:

Esta foto de gel mostra o efeito da amplificação de PCR aninhada na detectabilidade de Vírus da anemia da galinha (CAV) DNA em uma série de diluições: o PCR1 detecta apenas 1000 moléculas de modelo PCR2 amplifica 1 molécula de modelo (Soin & eacute C, Watson SK, Rybicki EP, Lucio B, Nordgren RM, Parrish CR, Schat KA (1993) Avian Dis 37: 467 -476).

Rotulagem de produtos de PCR com digoxigenina-11-dUTP

(DIG Roche) precisa ser feito apenas em 50 uM cada dNTP, com o dTTP substituído a 35% com DIG-11-dUTP. NOTA: que o produto terá um MW maior que o produto nativo! Isso resulta em uma sonda muito bem marcada que pode ser amplamente reutilizada, por períodos de até 3 anos. Veja também aqui.

Desestabilizadores / aditivos Helix

Com NAs de alto conteúdo (G + C), pode ser necessário usar condições de desnaturação mais severas. Por exemplo, pode-se incorporar até 10% (w ou v / v):

  • dimetilsulfóxido (DMSO),
  • dimetilformamida (DMF),
  • ureia
  • ou formamida

na mistura de reação: presume-se que esses aditivos diminuam o Tm do NA alvo , embora DMSO a 10% e superior seja conhecido por diminuir a atividade de Taq em até 50% (Innis e Gelfand, 1990 Gelfand e White, 1990).

Os aditivos também podem ser necessários na amplificação de longas sequências alvo: DMSO frequentemente ajuda a amplificar produtos de & gt1kb. Formamida pode aparentemente melhorar drasticamente a especificidade do PCR (Sarkar et al ., 1990), enquanto glicerol melhora a amplificação de modelos altos (G + C) (Smith et al., 1990).

Polietilenoglicol (PEG) pode ser um aditivo útil quando a concentração do molde de DNA é muito baixa: promove a associação macromolecular por exclusão de solvente, o que significa que o pol pode encontrar o DNA.

PCR de cDNA

Um primer muito útil para a síntese de cDNA e PCR de cDNA vem de uma estratégia de sequenciamento descrita por Thweatt et al. (1990): este utilizou uma mistura de três iniciadores 21-mer consistindo em 20 resíduos T com 3 e # 39 terminais A, G ou C, respectivamente , para sequenciar dentro a região poli (A) de clones de cDNA de mRNA de origem eucariótica. Eu usei-o para amplificar bandas discretas de uma variedade de RNAs de vírus poli (A) +, com apenas um único iniciador degenerado específico a montante: o iniciador T pode recozer em qualquer lugar na região poli (A), mas apenas moléculas que se anelam no início da cauda poli (A), e de quem 3 & # 39-mais base é complementar à base próximo ao início da cauda , será estendido.

por exemplo: 5 & ​​# 39-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT (A, G, C) -3 & # 39

funciona para amplificação de Potyvirus RNA e mRNA eucariótico

Um conjunto simples de regras para o projeto de sequência de primer é o seguinte (adaptado de Innis e Gelfand, 1991):

os primers devem ter 17-28 bases de comprimento

a composição da base deve ser 50-60% (G + C)

os primers devem terminar (3 e # 39) em um G ou C, ou CG ou GC: isso evita a "respiração" das extremidades e aumenta a eficiência do priming

Tms entre 55-80 o C são preferidos

execuções de três ou mais Cs ou Gs nas extremidades 3 e 39 dos primers podem promover mispriming em sequências ricas em G ou C (devido à estabilidade do recozimento) e devem ser evitadas

As extremidades 3 e 39 dos primers não devem ser complementares (ou seja, par de bases), caso contrário, os dímeros de primer serão sintetizados preferencialmente a qualquer outro produto

auto-complementaridade do primer (capacidade de formar 2 o estruturas como grampos de cabelo) devem ser evitadas.

Exemplos de complementaridade inter e intra-primer que resultaria em problemas:

Capturas de tela tiradas de análises feitas usando DNAMAN (Lynnon Biosoft, Quebec, Canadá).

Referências

Compton T (1990). Iniciadores degenerados para amplificação de DNA. pp. 39-45 em: PCR Protocols (Innis, Gelfand, Sninsky e White, eds.) Academic Press, New York.
Fuqua SAW, Fitzgerald SD e McGuire WL (1990). Um método simples de reação em cadeia da polimerase para detecção e clonagem de transcritos de baixa abundância. BioTechniques 9 (2): 206-211.
Gelfand DH e White TJ (1990). Polimerases de DNA termoestáveis. pp. 129-141 em: PCR Protocols (Innis, Gelfand, Sninsky e White, eds.) Academic Press, New York.
Innis MA e Gelfand DH (1990). Otimização de PCRs. pp. 3-12 em: PCR Protocols (Innis, Gelfand, Sninsky e White, eds.) Academic Press, New York.
Krawetz SA, Pon RT e Dixon GH (1989). Aumento da eficiência da reação em cadeia da polimerase catalisada pela polimerase Taq. Nucleic Acids Research 17 (2): 819.
Rybicki EP e Hughes FL (1990). Detecção e tipagem do vírus da estria do milho e outros geminivírus de gramíneas distantemente relacionados por amplificação da reação em cadeia da polimerase de uma sequência viral conservada. Journal of General Virology 71: 2519-2526.
Rychlik W, Spencer WJ e Rhoads RE (1990). Otimização da temperatura de anelamento para amplificação de DNA in vitro. Nucleic Acids Research 18 (21): 6409-6412.
Sarkar G, Kapeiner S e Sommer SS (1990). A formaqmida pode aumentar drasticamente a especificidade da PCR. Nucleic Acids Research 18 (24): 7465.
Smith KT, Long CM, Bowman B e Manos MM (1990). Uso de co-solventes para aumentar a amplificação por PCR. Amplifications 9/90 (5): 16-17.
Thweatt R, Goldstein S e Reis RJS (1990). Uma mistura de primer universal para determinação de sequência nas extremidades 3 e # 39 dos cDNAs. Analytical Biochemistry 190: 314-316.
Wu DY, Ugozzoli L, Pal BK, Qian J, Wallace RB (1991). O efeito da temperatura e do comprimento do iniciador de oligonucleotídeo na especificidade e eficiência da amplificação pela reação em cadeia da polimerase. DNA and Cell Biology 10 (3): 233-238.
Yap EPH e McGee JO & # 39D (1991). Rendimentos de produtos de PCR curtos melhorados por temperaturas de desnaturação mais baixas. Nucleic Acids Research 19 (7): 1713.


Comentário

Informação de Fundo

A base teórica da reação em cadeia da polimerase (PCR, consulte a introdução do capítulo) foi provavelmente descrita pela primeira vez em um artigo de Kleppe et al. (1971). No entanto, essa técnica não despertou o interesse geral até meados da década de 1980, quando Kary Mullis e colegas de trabalho da Cetus desenvolveram a PCR em uma técnica que poderia ser usada para gerar grandes quantidades de genes de cópia única a partir do DNA genômico (Saiki et al. , 1985, 1986 Mullis et al., 1986 Embury et al., 1987).

O procedimento inicial envolveu a adição de uma nova alíquota do fragmento Klenow de E. coli A DNA polimerase I durante cada ciclo porque esta enzima foi inativada durante a etapa de desnaturação subsequente. A introdução do termoestável Taq DNA polimerase de Thermus aquaticus (Saiki et al., 1988) aliviou esse tédio e facilitou a automação da parte do ciclo térmico do procedimento. Taq A DNA polimerase também permitiu o uso de temperaturas mais altas para recozimento e extensão, o que melhorou o rigor da hibridização primer-molde e, portanto, a especificidade dos produtos. Isso também serviu para aumentar o rendimento do produto desejado.

Todas as aplicações de PCR dependem de uma PCR otimizada. O nesta unidade otimiza PCR para várias variáveis, incluindo MgCl2 concentração, aditivos de intensificação - dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol ou Perfect Match Polymerase Enchancer (PMPE) - e prevenção de mispriming pré-PCR. Esses e outros parâmetros podem ser extremamente importantes, pois cada elemento da PCR pode afetar o resultado (consulte 2.2 para a discussão dos parâmetros individuais).

Existem vários kits de otimização de PCR e intensificadores proprietários no mercado (Tabela 3). Os kits de otimização geralmente fornecem um painel de tampões em que o pH, o tampão, os detergentes não iônicos e a adição de (NH4)2TÃO4 são variados, MgCl2 podem ser adicionados em várias concentrações e intensificadores (por exemplo, DMSO, glicerol, formamida, betaína e / ou compostos proprietários) podem ser escolhidos. O protocolo aqui apresentado visa manter os custos baixos e as opções amplas.

Informações técnicas no apêndice do catálogo

Boehringer-Mannheim, Invitrogen, Stratagene, Sigma, Epicenter Technologies, Life Technologies

Vários tampões, Mg 2+ e intensificadores que podem incluir DMSO, glicerol, formamida, (NH4)2TÃO4, e outros agentes não especificados ou proprietários

Amersham Pharmacia Biotech

Grânulos prontos para uso "otimizados para PCR padrão" e grânulos de análise RAPD prontos para uso (tampão, nucleotídeos, Taq Polimerase de DNA)

EasyStart PCR Mix-in-a-Tube - tubos pré-embalados com esferas de cera contendo tampão, MgCl2, nucleotídeos, Taq DNA polimerase

PCR SuperMix — 1,1 × conc. — pré-mistura contendo tampão, MgCl2, nucleotídeos, TaqDNA polimerase

Red Hot DNA Polymerase Advanced Biochemicals - um novo rival para Taq polimerase com recursos de conveniência

Molecular Bio-Products HotStart Armazenamento e Tubos de Reação - conta de cera pré-aderida em cada tubo requer a adição manual de um componente em alta temperatura

Contas HotWax Mg 2+ - contas de cera contêm MgCl pré-formulado2 que é liberado na primeira etapa de temperatura elevada

StrataSphere Magnesium Wax Beads - contas de cera contendo Mg 2+ pré-formulado

Hot Start / polimerase separada

TaqBead Hot Start Polymerase - encapsulamento de esferas de cera Taq DNA polimerase que é liberada na primeira etapa de temperatura elevada

Hot-start / inativação reversível da polimerase por ligação do anticorpo

TaqStart Antibody, TthStart Antibody - reversivelmente inativado Taq e Tth DNA polimerases até a primeira desnaturação a 95 ° C

PlatinumTaq - contém anticorpo PlatinumTaq

JumpStart Taq - contém anticorpo TaqStart

Modificação química de inicialização a quente / reversível

AmpliTaq Gold — ativado em alta temperatura

Modificação química de inicialização a quente / reversível

HotStarTaq DNA Polymerase — ativado em alta temperatura

Boehringer Mannheim, New England Biolabs

Tth pirofosfatase, termoestável

GC-Melt (em kits Advantage-GC) - proprietário

Sistema de amplificação Taq-FORCE e tampão MIGHTY - proprietário

Eppendorf MasterTaq Kit com TaqMaster Enhancer - proprietário

Sistema PCRx Enhancer - proprietário

E.coli Proteína de ligação de cadeia simples (SSB)

Perfect Match Polymerase Enhancer - proprietário

Aditivo de PCR TaqExtender - proprietário

Parâmetros críticos e solução de problemas

MgCl2 Concentração

Determinando o MgCl ideal2 a concentração, que pode variar mesmo para diferentes primers da mesma região de um determinado modelo (Saiki, 1989), pode ter uma enorme influência no sucesso do PCR. Neste protocolo, três concentrações são testadas - 1,5 mM (L), 3,0 mM (M) e 4,5 mM (H) - contra três intensificadores. Intensificadores tendem a alargar o MgCl2 faixa ideal, contribuindo para o sucesso da PCR em uma dessas concentrações. Um tampão 10 × otimizado para uma determinada enzima e um frasco separado de MgCl2 são normalmente fornecidos com a polimerase, de modo que o usuário possa titular o MgCl2 concentração para seu conjunto único de modelo de primer.

Pureza do Reagente

Para aplicações que amplificam modelos raros, a pureza do reagente é o parâmetro mais importante e evitar a contaminação em cada etapa é fundamental.

Para manter a pureza, armazene vários pequenos volumes de cada reagente em tubos com tampa de rosca.

Para muitas aplicações, simplesmente usar reagentes de alta qualidade e evitar a contaminação por nuclease é suficiente, no entanto, evite um reagente comum usado para inativar nucleases, dietilpirocarbonato (DEPC). Mesmo pequenas quantidades de produtos químicos deixados após o tratamento da água por autoclavagem são suficientes para arruinar um PCR.

Seleção de primer

Este é o fator menos previsível e mais difícil de solucionar. Simplificando, alguns primers simplesmente não funcionam. Para maximizar a probabilidade de que um determinado par de primer funcione, preste atenção aos seguintes parâmetros.

Considerações gerais. Um conjunto de primer ideal deve hibridizar de forma eficiente para a sequência de interesse com hibridização insignificante para outras sequências presentes na amostra. Se houver quantidades razoáveis ​​de modelo disponível, a especificidade da hibridização pode ser testada realizando a hibridização de oligonucleotídeo, conforme descrito em UNIDADE Indisponível. A distância entre os primers é bastante flexível, variando até 10 kb. Pode haver, no entanto, uma queda considerável na eficiência de síntese com distâncias & gt3 kb (Jeffreys et al., 1988). Pequenas distâncias entre os primers, no entanto, diminuem a capacidade de obter muitas informações de sequência ou de reamplificar com oligonucleotídeos internos aninhados, caso seja necessário.

Projete primers para permitir a demonstração da especificidade do produto de PCR. Certifique-se de que há locais de endonuclease de restrição de diagnóstico entre os iniciadores ou que um oligonucleotídeo pode detectar o produto de PCR especificamente por hibridização.

Vários programas de computador podem ajudar no design do primer (consulte Recursos da Internet no final da unidade). Estes são mais úteis para evitar conjuntos de primers com complementaridade intra e intermolecular, o que pode aumentar drasticamente a eficácia Tm. Dada a abundância de primers em relação ao modelo, isso pode impedir o priming do modelo. O projeto do primer para computador não é à prova de falhas. Se possível, comece com um primer ou conjunto de primer conhecido por preparar extensões de maneira eficiente. Além disso, os sites dos fabricantes oferecem ajuda técnica com o design do primer.

Complementaridade ao modelo. Para muitas aplicações, os primers são projetados para serem exatamente complementares ao modelo. Para outros, no entanto, como engenharia de mutações ou novos locais de endonuclease de restrição, ou para esforços para clonar ou detectar homólogos de genes onde a informação de sequência está faltando, pares de bases incompatíveis serão intencionalmente ou inevitavelmente criados. É melhor ter incompatibilidades (por exemplo, em um ligante de endonuclease de restrição) na extremidade 5 'do primer. Quanto mais próxima a incompatibilidade estiver da extremidade 3 ′ do primer, mais provável é que ela evite a extensão.

O uso de primers oligonucleotídicos degenerados para clonar genes onde apenas a sequência de proteína está disponível, ou para pescar homólogos de genes em outras espécies, às vezes tem sido bem-sucedido, mas também falhou um número incontável (e não publicado) de vezes. Quando a reação funciona, ela pode ser extremamente valiosa, mas também pode gerar produtos aparentemente específicos que exigem muito trabalho para identificar e não produzem nenhuma informação útil. Quanto menos degenerados forem os oligonucleotídeos, especialmente na extremidade 3 ', melhor. Caveat emptor.

Comprimento do primer. Um primer deve ter 20 a 30 bases de comprimento. É improvável que primers mais longos ajudem a aumentar significativamente a especificidade.

Sequência de primer. Projete primers com um conteúdo GC semelhante ao do modelo. Evite primers com distribuições de sequência incomuns, como trechos de polipurinas ou polipirimidinas, pois sua estrutura secundária pode ser desastrosa. Vale a pena verificar a potencial estrutura secundária usando um dos programas de computador apropriados que estão disponíveis.

"Primer-dímeros." Dímeros de primer são um artefato comum mais freqüentemente observado quando pequenas quantidades de molde são retiradas através de muitos ciclos de amplificação. Eles se formam quando a extremidade 3 'de um primer se emparelha com a extremidade 3' do outro primer, e a polimerase então estende cada primer até a extremidade do outro. O produto resultante pode competir de forma muito eficaz contra o produto de PCR de interesse. Dímeros de primer podem ser evitados usando primers sem complementaridade, especialmente em suas extremidades 3 '. Caso ocorram, otimizando o MgCl2 a concentração pode minimizar sua abundância em relação ao produto de interesse.

Modelo

Além dos métodos padrão para a preparação de DNA ( UNIDADE Indisponível - Indisponível), vários procedimentos simples e rápidos foram desenvolvidos para tecidos específicos (Higuchi, 1989). Mesmo preparações de DNA relativamente degradadas podem servir como modelos úteis para a geração de produtos de PCR de tamanho moderado. As duas principais preocupações em relação ao modelo são pureza e quantidade.

Vários contaminantes encontrados nas preparações de DNA podem diminuir a eficiência da PCR. Estes incluem ureia, o detergente SDS (cuja ação inibitória pode ser revertida por detergentes não iônicos), acetato de sódio e, às vezes, componentes transportados na purificação de DNA de géis de agarose (Gelfand, 1989 Gyllensten, 1989 K. Hicks e D. Coen, unpub. observ.). Extrações orgânicas adicionais, precipitação de etanol de acetato de amônio 2,5 M e / ou purificação de gel em poliacrilamida em vez de agarose, podem ser benéficas para minimizar essa contaminação se o método mais simples (precipitar a amostra com etanol e lavar repetidamente o pellet com etanol 70% ) não é suficiente.

É evidente que a quantidade de molde deve ser suficiente para ser capaz de visualizar os produtos de PCR usando brometo de etídio. Normalmente, 100 ng de DNA genômico é suficiente para detectar um produto de PCR de um gene de mamífero de uma única cópia. Usar muito modelo não é aconselhável ao otimizar para MgCl2 ou outros parâmetros, pois podem obscurecer as diferenças na eficiência da amplificação. Além disso, o excesso de molde pode diminuir a eficiência devido a contaminantes na preparação do DNA.

A quantidade de molde, especialmente em termos da quantidade de sequência alvo versus sequências não específicas, pode ter um efeito importante no rendimento de produtos não específicos. Com menos sequência alvo, é mais provável que produtos não específicos sejam vistos. Para algumas aplicações, como certos protocolos de sequenciamento de DNA em que é importante ter um único produto, a purificação em gel do produto de PCR específico e a reamplificação são recomendados.

Taq e outras polimerases de DNA termoestáveis

Entre as vantagens conferidas pela termoestabilidade do Taq A DNA polimerase é sua capacidade de resistir ao aquecimento e resfriamento repetidos inerentes à PCR e de sintetizar DNA em altas temperaturas que derretem primers e regiões incompatíveis da estrutura secundária local. A enzima, no entanto, não é infinitamente resistente ao calor e, para maior eficiência, não deve ser submetida a etapas de desnaturação desnecessárias. Na verdade, alguns protocolos (por exemplo, UNIDADE Indisponível e o método de “inicialização a quente” descrito aqui) recomendam adicioná-lo após a primeira etapa de desnaturação.

Aumentando a quantidade de Taq A DNA polimerase além de 2,5 U / reação às vezes pode aumentar a eficiência da PCR, mas apenas até certo ponto. Adicionar mais enzima às vezes pode aumentar o rendimento de produtos de PCR não específicos em detrimento do produto de interesse. Além disso, Taq A DNA polimerase não é barata.

Uma propriedade muito importante de Taq A DNA polimerase é sua taxa de erro, que foi inicialmente estimada em 2 × 10 −4 nucleotídeos / ciclo (Saiki et al., 1988). A enzima purificada fornecida pelos fabricantes carece de uma atividade de exonuclease 3′⇒5 ′ de revisão, o que reduz as taxas de erro de outras polimerases, como o fragmento Klenow de E. coli DNA polimerase I. Para muitas aplicações, isso não apresenta nenhuma dificuldade. No entanto, para clones de sequenciação derivados de PCR, ou quando se inicia com muito poucos modelos, isso pode levar a grandes problemas. Sequenciamento direto de produtos de PCR ( UNIDADE Indisponíveis), o sequenciamento de vários clones gerados por PCR e / ou o uso de controles negativos apropriados podem ajudar a superar esses problemas. Alternativamente, mudando as condições de reação (Eckert e Kunkel, 1990) ou mudando para um nãoTaq A DNA polimerase (com maior fidelidade) pode ser útil.

Outra propriedade importante de Taq A DNA polimerase é sua propensão para adicionar nucleotídeos não contemplados às extremidades 3 'das cadeias de DNA. Isso pode ser especialmente problemático na clonagem de produtos de PCR. Freqüentemente, é necessário “polir” os produtos de PCR com enzimas, como outras polimerases de DNA, antes de adicionar ligantes ou prosseguir para a clonagem de extremidade cega. Por outro lado, a adição de um A não contemplado por Taq A DNA polimerase pode ser vantajosa na clonagem ( UNIDADE Indisponível).

Certos protocolos de PCR podem funcionar melhor com uma polimerase termoestável em vez de outra. A Tabela 4 lista as polimerases de DNA termoestáveis ​​atualmente disponíveis por nomes genéricos e comerciais, a fonte original de enzimas nativas e recombinantes, o fornecedor, a extremidade gerada (adição de 3′A versus contundente) e as atividades de exonuclease associadas. Uma atividade de exonuclease de 3 ′ a 5 ′ está sendo revisada. Remoção da atividade de exonuclease 5 ′ a 3 ′ de Taq A DNA polimerase (deleção N-terminal) é relatada como produzindo um rendimento mais alto. Uma atividade de exonuclease de 5 'a 3' pode degradar um pouco os primers. Enzimas de revisão sintetizam DNA com maior fidelidade e podem gerar produtos mais longos do que Taq, mas tendem a gerar baixos rendimentos. As misturas de enzimas (Tabela 5) foram otimizadas para aumentar a fidelidade e o comprimento, juntamente com a sensibilidade e o rendimento.

Taq (nativo e / ou recombinante)

Ambion, Amersham Pharmacia Biotech, Boehringer Mannheim, Clontech, Fisher, Life Technologies, Marsh Biomedical, Perkin Elmer, Promega, Qiagen, Sigma, Stratagene

Taq, Deleção N-terminal

- uma uma Nenhuma informação neste momento.

Promega, Epicenter Technologies

- uma uma Nenhuma informação neste momento.

Thermococcus litoralis

New England Biolabs (Vent), Promega

Thermococcus litoralis

Amersham Pharmacia Biotech, Boehringer Mannheim, Epicenter Technologies, Perkin Elmer, Promega

DNA polimerases termoestáveis ​​e outros componentes

Expanda Alta Fidelidade, Expanda Modelo Longo e Expanda Sistemas de PCR de 20kb

KlenTaq LA Polymerase Mix

KlenTaq-1 (deficiente em 5′-exonuclease Taq) + polimerase de revisão não especificada

KlenTaq-1 + polimerase de revisão não especificada + anticorpo TaqStart

Misturas e kits de polimerase de cDNA Advantage-cDNA e Advantage-GC

KlenTaq-1 + polimerase de revisão não especificada + TaqStart Antibody GC Kit contém GC Melt

Combinações e kits de polimerase genômica Advantage Genomic e Advantage-GC

Tth + polimerase de revisão não especificada + TthStart Antibody GC Kit contém GC Melt

Taq +Psp + polimerase (s) de revisão não especificada (s) + Tampão eLONGase

Platinum Taq DNA Polymerase

Taq + Psp + Platinum Taq Anticorpo

Polimerase de DNA de alta fidelidade de platina

Taq + Psp + Taq Anticorpo

Tbr com potenciador não especificado

GeneAmp XL PCR e kits de PCR XL RNA

Mistura de enzimas de sequenciamento OmniBase

Polimerase (s) de revisão não especificada (s) com pirofosfatase termoestável

Mix de polimerase de DNA AccuTaq LA

Taq + polimerase de revisão não especificada

Sistemas TaqPlus Long e TaqPlus Precision PCR

Pfu+Taq TaqPlus Precision Reaction Buffer (proprietário)

Accurase Fidelity PCR Mistura enzimática Calypso High Fidelity Sistema RT-PCR de tubo único

Thermus sp. + Thermococcus sp. Calypso também contém AMV-RT

Hot Start

O que acontece antes do ciclo térmico é crítico para o sucesso do PCR. Taq A DNA polimerase retém alguma atividade mesmo à temperatura ambiente. Portanto, em condições de emparelhamento não stringent, como à temperatura ambiente, os produtos podem ser gerados a partir do emparelhamento de iniciadores para direcionar o DNA em locais de baixa complementaridade ou tendo complementaridade de apenas alguns nucleotídeos nas extremidades 3 '. O último criaria com efeito novos modelos “marcados” com as sequências de primer. Os ciclos subsequentes amplificam essas sequências marcadas em abundância, gerando produtos não específicos e, possivelmente, reduzindo a eficiência de amplificação de produtos específicos por competição por substratos ou polimerase. Assim, são desejáveis ​​condições que evitem a polimerização antes das primeiras etapas de temperatura controlada. Neste protocolo, três métodos de inibir a polimerização antes da etapa de temperatura controlada são comparados. Estes incluem a separação física de um componente essencial da reação antes da primeira etapa de desnaturação, resfriamento de reagentes a 0 ° C e bloqueio reversível da atividade enzimática com um anticorpo.

Desnaturação do modelo antes Taq polimerase ou MgCl2 é adicionado à reação fornece uma melhora dramática na especificidade e sensibilidade em muitos casos (Chou et al., 1992). A principal desvantagem deste método é que ele requer a abertura dos tubos de reação uma segunda vez para adicionar o componente essencial ausente. Isso cria um inconveniente e um aumento no risco de contaminação, uma consideração importante ao testar a presença de uma determinada sequência em amostras experimentais ou clínicas.

Resfriar todos os componentes da mistura de reação a 0 ° C antes da mistura é mais conveniente e o método menos caro, mas também é o menos confiável. Transferir os tubos de reação de PCR da pasta de gelo para um bloco termociclador pré-aquecido a 95 ° C pode aumentar a chance de sucesso.

Inibição reversível de Taq A DNA polimerase pelo anticorpo TaqStart (Clontech) é o método mais conveniente e muito eficaz (Kellogg et al., 1994). Reações completas podem ser configuradas, sobrepostas com óleo e armazenadas a 4 ° C por até várias horas antes da ciclagem térmica, sem perda de sensibilidade ou especificidade em comparação com os outros métodos de inicialização a quente (MF Kramer e DM Coen, não publicado. Observ. .). A ciclagem é iniciada imediatamente após 5 min de desnaturação do anticorpo a 94 ° C. O DMSO inibe a ligação do anticorpo e não deve ser usado com TaqStart.

Vários produtos de inicialização a quente estão agora disponíveis comercialmente (Tabela 3). O sucesso de cada um pode depender do cumprimento estrito dos protocolos do fabricante, mesmo de um termociclador específico. Os métodos de barreira de cera e de ligação reversível de anticorpos são mais tolerantes, enquanto as modificações químicas têm requisitos de temperatura de ativação mais rigorosos.

Trifosfatos desoxirribonucleosídeos

Em um esforço para aumentar a eficiência da PCR, pode ser tentador aumentar a concentração de dNTPs. Não! Quando cada dNTP é 200 mM, há o suficiente para sintetizar 12,5 mg de DNA quando metade dos dNTPs são incorporados. Os dNTPs quelam o magnésio e, assim, alteram a concentração ótima de magnésio efetiva. Além disso, as concentrações de dNTP & gt200 mM cada aumentam a taxa de erro da polimerase. Concentrações milimolares de dNTPs realmente inibem Taq DNA polimerase (Gelfand, 1989).

O protocolo nesta unidade exige a preparação de 4dNTPs em Tris⋅Cl 10 mM / EDTA 1 mM (tampão TE), pH 7,4 a 7,5. Isso é mais fácil e menos sujeito a desastres do que a neutralização com hidróxido de sódio. No entanto, o EDTA também quela o magnésio, e isso deve ser levado em consideração se os estoques de dNTPs forem alterados. Alternativamente, para reduzir o risco de contaminação, uma mistura de 4dNTP pode ser feita combinando volumes iguais de estoques comercialmente preparados.

Enhancers

Os aprimoradores são usados ​​para aumentar o rendimento e a especificidade e para superar as dificuldades encontradas com alto conteúdo de GC ou modelos longos. Os detergentes não iônicos (Triton X-100, Tween 20 ou Nonidet P-40) neutralizam as cargas de detergentes iônicos frequentemente usados ​​na preparação do molde e devem ser usados ​​na mistura de reação básica, ao invés de intensificadores opcionais. Rendimentos mais altos podem ser alcançados estabilizando / aumentando a atividade da polimerase com proteínas estabilizadoras de enzima (BSA ou gelatina), solutos estabilizadores de enzima, como betaína ou betaína⋅HCl (TMAC), solventes estabilizadores de enzima (glicerol), solventes para aumento de solubilidade (DMSO ou acetamida), solventes de aglomeração molecular (PEG) e preferências de sal de polimerase [(NH4)TÃO4 é recomendado para polimerases diferentes Taq] Maior especificidade pode ser alcançada diminuindo o TM de dsDNA (usando formamida), desestabilizando o recozimento de primer incompatível (usando PMPE ou estratégias de inicialização a quente) e estabilizando ssDNA (usando E. coli SSB ou proteína T4 do gene 32). A amplificação de modelos de alto teor de GC pode ser melhorada diminuindo a dependência da composição do par de base do TM de dsDNA (com betaína Rees et al., 1993). A betaína é um osmólito amplamente distribuído em plantas e animais e não é tóxico, um recurso que o recomenda por sua conveniência no manuseio, armazenamento e descarte. A betaína pode ser o ingrediente patenteado em várias formulações comerciais. Para modelos longos, um pH mais alto é recomendado (pH 9,0). O pH do tampão Tris diminui em altas temperaturas, a PCR de modelo longo requer mais tempo em altas temperaturas e o tempo aumentado em pH mais baixo pode causar alguma despurinação do modelo, resultando em rendimento reduzido do produto específico. O fosfato inorgânico (PPi), um produto da síntese de DNA, pode se acumular com a amplificação de produtos longos a níveis que podem favorecer a reversão da polimerização. O acúmulo de PPi pode ser evitado pela adição de PPase termoestável. Quando um grande número de amostras está sendo analisado, a conveniência de adicionar produtos de PCR diretamente a um gel representa uma economia de tempo significativa. Algumas empresas combinam sua polimerase termoestável com um corante vermelho e um componente de alta densidade para facilitar o carregamento de produtos de reação em géis sem adição adicional de tampão de carregamento.

Parâmetros do Ciclo Térmico

Cada etapa do ciclo requer uma quantidade mínima de tempo para ser eficaz, enquanto muito tempo pode ser um desperdício e prejudicial para a DNA polimerase. Se a quantidade de tempo em cada etapa puder ser reduzida, tanto melhor.

Desnaturação. É fundamental que a separação completa dos fios ocorra durante a etapa de desnaturação. Esta é uma reação unimolecular que, por si só, é muito rápida. A desnaturação sugerida de 30 segundos usada no protocolo garante que o conteúdo do tubo atinja 94 ° C. Se o PCR não funcionar, vale a pena verificar a temperatura dentro de um tubo de controle contendo 100 µl de água. Se o conteúdo de GC for extremamente alto, temperaturas de desnaturação mais altas podem ser necessárias, no entanto, Taq A atividade da DNA polimerase cai rapidamente em altas temperaturas (Gelfand, 1989). Para amplificar uma sequência longa (& gt3 kb), minimize o tempo de desnaturação para proteger o DNA alvo de possíveis efeitos, como a depurinação, de pH reduzido do tampão Tris em temperaturas elevadas.

anelamento. É fundamental que os primers recozam de forma estável ao molde. Os primers com conteúdo relativamente baixo de GC (& lt50%) podem exigir temperaturas inferiores a 55 ° C para o recozimento completo. Por outro lado, também pode aumentar a quantidade de produtos inespecíficos. Para primers com alto teor de GC, podem ser necessárias temperaturas de recozimento mais altas. Pode valer a pena, embora demorado, experimentar este parâmetro. Alguns fabricantes têm termocicladores no mercado que são capazes de formar um gradiente de temperatura através das unidades de aquecimento, permitindo assim a otimização da temperatura de recozimento em uma operação. Tal como acontece com a desnaturação, o tempo para esta etapa é baseado principalmente no tempo que leva para atingir a temperatura adequada, porque os primers estão em tal excesso que a reação de recozimento ocorre muito rapidamente.

Extensão. A temperatura de extensão de 72 ° C está próxima da temperatura ideal para Taq DNA polimerase (∼75 ° C), mas impede que os primers caiam. Na verdade, a extensão do primer começa durante o recozimento, porque Taq A DNA polimerase é parcialmente ativa a 55 ° C e em temperaturas ainda mais baixas (Gelfand, 1989).

A duração da extensão depende principalmente do comprimento da sequência a ser amplificada. Uma duração de 1 minuto por kb de comprimento do produto é geralmente suficiente.

Certos protocolos, incluindo outros neste capítulo, encerram o PCR com um longo tempo de extensão final na tentativa de tornar os produtos o mais completos possível.

Tempo de rampa. O tempo de rampa refere-se ao tempo que leva para mudar de uma temperatura para outra. Usar banhos de água e mover amostras manualmente de temperatura para temperatura provavelmente proporciona os tempos de rampa mais curtos, que são principalmente o tempo necessário para que o conteúdo do tubo mude de temperatura. Basicamente, diferentes termocicladores têm tempos de rampa diferentes. Quanto mais curto, melhor.

O Robociclador Stratagene usa um braço robótico para mover amostras de um bloco de temperatura constante para outro, virtualmente eliminando o tempo de rampa do bloco, mas um tempo de rampa para o conteúdo do tubo deve ser calculado (∼1 seg / ° C) e adicionado à desnaturação, recozimento, e tempos de extensão. Cicladores rápidos que utilizam pontas de pipeta de deslocamento positivo ou tubos capilares para as reações de PCR reduzem drasticamente os tempos de rampa.

Geralmente, os termocicladores de “alto desempenho” com tempos de rampa curtos são proporcionalmente mais caros. Existem muitos termocicladores novos no mercado com preços abaixo de US $ 5.000, que funcionam muito bem (Beck, 1998).

Resultados Antecipados

Começando com ≥100 ng de DNA de mamífero (≥10 4 moléculas), o pode ser usado para determinar qual MgCl2 a concentração, o aditivo de aumento e as condições iniciais produzirão um produto de PCR predominante a partir de uma sequência de cópia única que é prontamente visível em um gel corado com brometo de etídio. É possível que outros produtos secundários também sejam visíveis.

Considerações de tempo

O pode ser concluído em um único dia. A montagem das misturas de reação deve levar ~ 1 hora. O ciclismo deve durar menos de 3 horas. A preparação, execução e coloração do gel devem levar mais algumas horas. Verificações adicionais sobre a especificidade do produto, como digestão com endonuclease de restrição ou hibridização Southern blot, levarão mais algumas horas ou dias, respectivamente.


Mecanismo de ação:

A longa cadeia da sonda de fita simples contém o fluorocromo ou um composto radiomarcado em sua extremidade.

Uma vez que encontra sua sequência complementar no DNA molde que se liga a ele, o fluorocromo é liberado e emite fluorescência que é medida pelo detector.

Assim, a quantidade de fluorescência emitida é diretamente proporcional à hibridização da sonda.

Sob a temperatura de recozimento exata, o primer se liga à sua sequência complementar. Uma vez que o anelamento acontece, a Taq DNA polimerase começa a inserir os dNTPs próximo à extremidade 3 'dele até atingir o final da fita.

Ao final da reação, uma nova molécula de DNA é gerada.


Conteúdo

O PCR amplifica uma região específica de uma fita de DNA (o DNA alvo). A maioria dos métodos de PCR amplifica fragmentos de DNA com comprimento entre 0,1 e 10 quilo pares de bases (kbp), embora algumas técnicas permitam a amplificação de fragmentos de até 40 kbp. [5] A quantidade de produto amplificado é determinada pelos substratos disponíveis na reação, que se tornam limitantes à medida que a reação progride. [6]

Uma configuração de PCR básica requer vários componentes e reagentes, [7] incluindo:

  • uma Molde de DNA que contém a região alvo do DNA para amplificar
  • uma DNA polimerase uma enzima que polimeriza novos filamentos de DNA resistentes ao calor Taq a polimerase é especialmente comum, [8] pois é mais provável que permaneça intacta durante o processo de desnaturação do DNA em alta temperatura
  • dois DNA primers que são complementares às extremidades 3 ′ (três primers) de cada uma das fitas sense e anti-sense do DNA alvo (a DNA polimerase só pode se ligar e se alongar a partir de uma região de fita dupla de DNA sem primers, não há dupla local de iniciação em cadeia no qual a polimerase pode se ligar) [9] primers específicos que são complementares à região alvo do DNA são selecionados de antemão, e muitas vezes são feitos sob medida em um laboratório ou adquiridos de fornecedores bioquímicos comerciais
  • trifosfatos de desoxinucleosídeo, ou dNTPs (às vezes chamados de nucleotídeos "desoxinucleotídeos trifosfatos" contendo grupos trifosfato), os blocos de construção a partir dos quais a DNA polimerase sintetiza uma nova fita de DNA
  • uma solução de buffer fornecer um ambiente químico adequado para a atividade e estabilidade ideais da DNA polimerase
  • bivalentcations, tipicamente íons de magnésio (Mg) ou manganês (Mn) Mg 2+ é o mais comum, mas Mn 2+ pode ser usado para mutagênese de DNA mediada por PCR, pois uma concentração mais alta de Mn 2+ aumenta a taxa de erro durante a síntese de DNA [10 ] e cátions monovalentes, normalmente íons de potássio (K) [melhor fonte necessária]

A reação é comumente realizada em um volume de 10–200 μL em pequenos tubos de reação (volumes de 0,2–0,5 mL) em um termociclador. O termociclador aquece e resfria os tubos de reação para atingir as temperaturas necessárias em cada etapa da reação (veja abaixo). Muitos termocicladores modernos usam o efeito Peltier, que permite tanto o aquecimento quanto o resfriamento do bloco que contém os tubos PCR simplesmente invertendo a corrente elétrica. Tubos de reação de paredes finas permitem uma condutividade térmica favorável para permitir um equilíbrio térmico rápido. A maioria dos termocicladores tem tampas aquecidas para evitar a condensação na parte superior do tubo de reação. Os termocicladores mais antigos sem tampa aquecida requerem uma camada de óleo no topo da mistura de reação ou uma bola de cera dentro do tubo.

Edição de Procedimento

Normalmente, o PCR consiste em uma série de 20–40 mudanças de temperatura repetidas, chamadas de ciclos térmicos, com cada ciclo geralmente consistindo em duas ou três etapas distintas de temperatura (veja a figura abaixo). A ciclagem é freqüentemente precedida por uma única etapa de temperatura em uma temperatura muito alta (& gt90 ° C (194 ° F)), e seguida por uma espera no final para extensão do produto final ou armazenamento breve. As temperaturas usadas e a duração de tempo em que são aplicadas em cada ciclo dependem de uma variedade de parâmetros, incluindo a enzima usada para a síntese de DNA, a concentração de íons bivalentes e dNTPs na reação e a temperatura de fusão (Tm) dos primers. [11] As etapas individuais comuns à maioria dos métodos de PCR são as seguintes:

  • Inicialização: Esta etapa é necessária apenas para DNA polimerases que requerem ativação por calor por PCR de inicialização a quente. [12] Consiste em aquecer a câmara de reação a uma temperatura de 94–96 ° C (201–205 ° F), ou 98 ° C (208 ° F) se polimerases extremamente termoestáveis ​​forem usadas, que é então mantida por 1– 10 minutos.
  • Desnaturação: Esta etapa é o primeiro evento de ciclo regular e consiste em aquecer a câmara de reação a 94–98 ° C (201–208 ° F) por 20–30 segundos. Isso causa a fusão ou desnaturação do DNA do molde de fita dupla, quebrando as ligações de hidrogênio entre as bases complementares, resultando em duas moléculas de DNA de fita simples.
  • anelamento: Na próxima etapa, a temperatura da reação é reduzida para 50–65 ° C (122–149 ° F) por 20–40 segundos, permitindo o anelamento dos primers a cada um dos modelos de DNA de fita simples. Dois primers diferentes são tipicamente incluídos na mistura de reação: um para cada um dos dois complementos de fita simples contendo a região alvo. Os iniciadores são sequências de fita simples, mas são muito mais curtos do que o comprimento da região alvo, complementando apenas sequências muito curtas na extremidade 3 'de cada fita.
  • Extensão / alongamento: A temperatura nesta etapa depende da DNA polimerase usada, a temperatura de atividade ideal para a DNA polimerase termoestável de Taq a polimerase é de aproximadamente 75-80 ° C (167-176 ° F), [13] [14] embora uma temperatura de 72 ° C (162 ° F) seja comumente usada com esta enzima. Nesta etapa, a DNA polimerase sintetiza uma nova fita de DNA complementar à fita molde de DNA, adicionando dNTPs livres da mistura de reação que é complementar ao molde na direção 5′-para-3′, condensando o grupo 5′-fosfato dos dNTPs com o grupo 3'-hidroxi no final da fita de DNA nascente (alongamento). O tempo preciso necessário para o alongamento depende da DNA polimerase usada e do comprimento da região alvo do DNA a ser amplificada. Como regra geral, em sua temperatura ideal, a maioria das polimerases de DNA polimerizam mil bases por minuto. Em condições ideais (ou seja, se não houver limitações devido a substratos ou reagentes limitantes), em cada etapa de extensão / alongamento, o número de sequências alvo de DNA é duplicado. Com cada ciclo sucessivo, as fitas do molde original mais todas as fitas recém-geradas tornam-se as fitas do molde para a próxima rodada de alongamento, levando à amplificação exponencial (geométrica) da região alvo específica do DNA.
  • Alongamento final: Esta única etapa é opcional, mas é realizada a uma temperatura de 70–74 ° C (158–165 ° F) (a faixa de temperatura necessária para a atividade ideal da maioria das polimerases usadas em PCR) por 5–15 minutos após a última PCR ciclo para garantir que qualquer DNA de fita única remanescente é totalmente alongado.
  • Retenção final: A etapa final resfria a câmara de reação a 4–15 ° C (39–59 ° F) por um tempo indefinido e pode ser utilizada para armazenamento de curto prazo dos produtos de PCR.

Para verificar se a PCR gerou com sucesso a região alvo de DNA antecipada (também algumas vezes referida como amplímero ou amplicon), a eletroforese em gel de agarose pode ser empregada para a separação de tamanhos dos produtos de PCR. O tamanho dos produtos de PCR é determinado por comparação com uma escada de DNA, um marcador de peso molecular que contém fragmentos de DNA de tamanhos conhecidos, que corre no gel junto com os produtos de PCR.

Edição de fases

Tal como acontece com outras reações químicas, a taxa de reação e a eficiência da PCR são afetadas por fatores limitantes. Assim, todo o processo de PCR pode ser dividido em três estágios com base no progresso da reação:

  • Amplificação exponencial: A cada ciclo, a quantidade de produto é dobrada (assumindo 100% de eficiência de reação). Após 30 ciclos, uma única cópia do DNA pode ser aumentada para até 1.000.000.000 (um bilhão) de cópias. Em certo sentido, então, a replicação de uma fita discreta de DNA está sendo manipulada em um tubo sob condições controladas. [15] A reação é muito sensível: apenas pequenas quantidades de DNA devem estar presentes.
  • Nivelamento do palco: A reação fica mais lenta à medida que a DNA polimerase perde atividade e o consumo de reagentes, como dNTPs e primers, torna-os mais limitados.
  • Platô: Não há mais acúmulo de produto devido ao esgotamento dos reagentes e da enzima.

Na prática, a PCR pode falhar por vários motivos, em parte devido à sua sensibilidade à contaminação, causando amplificação de produtos de DNA espúrios. Por causa disso, uma série de técnicas e procedimentos foram desenvolvidos para otimizar as condições de PCR. [16] [17] A contaminação com DNA estranho é tratada com protocolos e procedimentos de laboratório que separam as misturas pré-PCR de potenciais contaminantes de DNA. [7] Isso geralmente envolve a separação espacial das áreas de configuração de PCR das áreas para análise ou purificação de produtos de PCR, uso de plástico descartável e limpeza completa da superfície de trabalho entre as configurações de reação. As técnicas de design de primer são importantes para melhorar o rendimento do produto de PCR e evitar a formação de produtos espúrios, e o uso de componentes tampão alternativos ou enzimas polimerase pode ajudar na amplificação de regiões longas ou problemáticas de DNA. A adição de reagentes, como formamida, em sistemas tampão pode aumentar a especificidade e o rendimento da PCR. [18] Simulações de computador de resultados de PCR teóricos (PCR eletrônico) podem ser realizadas para auxiliar no projeto de primer. [19]

Isolamento seletivo de DNA Editar

A PCR permite o isolamento de fragmentos de DNA do DNA genômico por amplificação seletiva de uma região específica do DNA. Este uso de PCR aumenta muitas maneiras, como a geração de sondas de hibridização para hibridização Southern ou Northern e clonagem de DNA, que requerem maiores quantidades de DNA, representando uma região específica do DNA. O PCR fornece a essas técnicas grandes quantidades de DNA puro, permitindo a análise de amostras de DNA, mesmo de quantidades muito pequenas do material inicial.

Outras aplicações de PCR incluem sequenciamento de DNA para determinar sequências amplificadas por PCR desconhecidas em que um dos iniciadores de amplificação pode ser usado no sequenciamento Sanger, isolamento de uma sequência de DNA para agilizar tecnologias de DNA recombinante envolvendo a inserção de uma sequência de DNA em um plasmídeo, fago , ou cosmídeo (dependendo do tamanho) ou o material genético de outro organismo. Colônias bacterianas (como E. coli) pode ser rapidamente rastreado por PCR para construções de vetor de DNA corretas. [20] A PCR também pode ser usada para impressões digitais genéticas, uma técnica forense usada para identificar uma pessoa ou organismo comparando DNAs experimentais por meio de diferentes métodos baseados em PCR.

Alguns métodos de impressão digital de PCR têm alto poder discriminativo e podem ser usados ​​para identificar relações genéticas entre indivíduos, como pais-filhos ou entre irmãos, e são usados ​​em testes de paternidade (Fig. 4). Esta técnica também pode ser usada para determinar as relações evolutivas entre os organismos quando certos relógios moleculares são usados ​​(ou seja, os genes 16S rRNA e recA de microrganismos). [21]

Amplificação e quantificação de DNA Editar

Como o PCR amplifica as regiões de DNA que tem como alvo, o PCR pode ser usado para analisar quantidades extremamente pequenas de amostra. Isso geralmente é crítico para análises forenses, quando apenas uma pequena quantidade de DNA está disponível como evidência. O PCR também pode ser usado na análise de DNA antigo com dezenas de milhares de anos. Essas técnicas baseadas em PCR foram usadas com sucesso em animais, como um mamute de quarenta mil anos, e também em DNA humano, em aplicações que vão desde a análise de múmias egípcias até a identificação de um czar russo e do corpo de Rei inglês Ricardo III. [22]

Os métodos de PCR quantitativo ou PCR em tempo real (qPCR, [23] não devem ser confundidos com RT-PCR) permitem a estimativa da quantidade de uma determinada sequência presente em uma amostra - uma técnica frequentemente aplicada para determinar quantitativamente os níveis de expressão gênica. A PCR quantitativa é uma ferramenta estabelecida para a quantificação de DNA que mede o acúmulo de produto de DNA após cada rodada de amplificação de PCR.

qPCR permite a quantificação e detecção de uma sequência de DNA específica em tempo real, uma vez que mede a concentração enquanto o processo de síntese está ocorrendo. Existem dois métodos de detecção e quantificação simultâneas. O primeiro método consiste em usar corantes fluorescentes que são retidos inespecificamente entre as fitas duplas. O segundo método envolve sondas que codificam sequências específicas e são marcadas por fluorescência. A detecção de DNA usando esses métodos só pode ser vista após a hibridização das sondas com seu DNA complementar. Uma combinação de técnica interessante é a PCR em tempo real e a transcrição reversa. Essa sofisticada técnica, denominada RT-qPCR, permite a quantificação de uma pequena quantidade de RNA. Através desta técnica combinada, o mRNA é convertido em cDNA, que é posteriormente quantificado usando qPCR. Essa técnica diminui a possibilidade de erro no ponto final da PCR, [24] aumentando as chances de detecção de genes associados a doenças genéticas, como o câncer. [4] Laboratórios usam RT-qPCR com o propósito de medir com sensibilidade a regulação gênica. Os fundamentos matemáticos para a quantificação confiável do PCR [25] e RT-qPCR [26] facilitam a implementação de procedimentos de ajuste preciso de dados experimentais em aplicações de pesquisa, medicina, diagnóstico e doenças infecciosas. [27] [28] [29] [30]

Aplicações médicas e diagnósticas Editar

Os futuros pais podem ser testados para serem portadores genéticos, ou seus filhos podem ser testados para ver se realmente foram afetados por uma doença. [1] Amostras de DNA para teste pré-natal podem ser obtidas por amniocentese, biópsia de vilosidade coriônica ou até mesmo pela análise de células fetais raras que circulam na corrente sanguínea da mãe. A análise de PCR também é essencial para o diagnóstico genético pré-implantação, onde células individuais de um embrião em desenvolvimento são testadas para mutações.

  • O PCR também pode ser usado como parte de um teste sensível para tipagem de tecido, vital para o transplante de órgãos. A partir de 2008, [atualização] há até mesmo uma proposta para substituir os testes tradicionais baseados em anticorpos para o tipo de sangue por testes baseados em PCR. [31]
  • Muitas formas de câncer envolvem alterações para oncogenes. Ao usar testes baseados em PCR para estudar essas mutações, os regimes de terapia às vezes podem ser personalizados individualmente para um paciente. A PCR permite o diagnóstico precoce de doenças malignas, como leucemia e linfomas, que atualmente é o mais desenvolvido na pesquisa do câncer e já está sendo usado rotineiramente. Os ensaios de PCR podem ser realizados diretamente em amostras de DNA genômico para detectar células malignas específicas de translocação com uma sensibilidade que é pelo menos 10.000 vezes maior do que a de outros métodos. [32] A PCR é muito útil na área médica, pois permite o isolamento e a amplificação de supressores de tumor. A PCR quantitativa, por exemplo, pode ser usada para quantificar e analisar células individuais, bem como reconhecer confirmações e combinações de DNA, mRNA e proteínas. [24]

Aplicativos para doenças infecciosas Editar

A PCR permite um diagnóstico rápido e altamente específico de doenças infecciosas, incluindo aquelas causadas por bactérias ou vírus. [33] A PCR também permite a identificação de microrganismos não cultiváveis ​​ou de crescimento lento, como micobactérias, bactérias anaeróbias ou vírus de ensaios de cultura de tecidos e modelos animais. A base para aplicações de diagnóstico de PCR em microbiologia é a detecção de agentes infecciosos e a discriminação de cepas não patogênicas de patogênicas em virtude de genes específicos. [33] [34]

A caracterização e detecção de organismos causadores de doenças infecciosas foram revolucionadas por PCR das seguintes maneiras:

  • o vírus da imunodeficiência humana (ou HIV), é um alvo difícil de encontrar e erradicar. Os primeiros testes de infecção baseavam-se na presença de anticorpos contra o vírus circulando na corrente sanguínea. No entanto, os anticorpos não aparecem até muitas semanas após a infecção, os anticorpos maternos mascaram a infecção de um recém-nascido e os agentes terapêuticos para combater a infecção não afetam os anticorpos. Foram desenvolvidos testes de PCR que podem detectar apenas um genoma viral entre o DNA de mais de 50.000 células hospedeiras. [35] As infecções podem ser detectadas mais cedo, o sangue doado pode ser rastreado diretamente para o vírus, os recém-nascidos podem ser imediatamente testados para infecção e os efeitos dos tratamentos antivirais podem ser quantificados.
  • Alguns organismos causadores de doenças, como o de tuberculose, são difíceis de coletar nos pacientes e demoram para crescer em laboratório. Os testes baseados em PCR permitiram a detecção de um pequeno número de organismos causadores de doenças (vivos ou mortos), em amostras convenientes. A análise genética detalhada também pode ser usada para detectar a resistência aos antibióticos, permitindo uma terapia imediata e eficaz. Os efeitos da terapia também podem ser avaliados imediatamente.
  • A propagação de um organismo da doença através de populações de animais domésticos ou selvagens podem ser monitorados por testes de PCR. Em muitos casos, o aparecimento de novos subtipos virulentos pode ser detectado e monitorado. Os subtipos de um organismo que foram responsáveis ​​por epidemias anteriores também podem ser determinados por análise de PCR.
  • O DNA viral pode ser detectado por PCR. Os primers usados ​​devem ser específicos para as sequências-alvo no DNA de um vírus, e a PCR pode ser usada para análises diagnósticas ou sequenciamento de DNA do genoma viral. A alta sensibilidade da PCR permite a detecção do vírus logo após a infecção e mesmo antes do início da doença. [33] Essa detecção precoce pode dar aos médicos um tempo significativo no tratamento. A quantidade de vírus ("carga viral") em um paciente também pode ser quantificada por técnicas de quantificação de DNA baseadas em PCR (ver abaixo). Uma variante de PCR (RT-PCR) é usada para detectar RNA viral em vez de DNA: neste teste, a enzima transcriptase reversa é usada para gerar uma sequência de DNA que corresponde ao RNA viral, este DNA é então amplificado de acordo com o método de PCR usual. O RT-PCR é amplamente utilizado para detectar o genoma viral do SARS-CoV-2. [36]
  • Doenças como coqueluche (ou tosse convulsa) são causadas pela bactéria Bordetella pertussis. Esta bactéria é marcada por uma infecção respiratória aguda grave que afeta vários animais e humanos e causou a morte de muitas crianças. A toxina da coqueluche é uma exotoxina proteica que se liga aos receptores celulares por dois dímeros e reage com diferentes tipos de células, como os linfócitos T, que desempenham um papel na imunidade celular. [37] A PCR é uma importante ferramenta de teste que pode detectar sequências dentro do gene para a toxina pertussis. Como a PCR tem alta sensibilidade à toxina e tempo de resposta rápido, é muito eficiente para o diagnóstico de coqueluche quando comparada à cultura. [38]

Aplicativos forenses Editar

O desenvolvimento de protocolos de impressão digital genéticos (ou DNA) baseados em PCR tem sido amplamente aplicada na área forense:

  • Em sua forma mais discriminatória, impressão digital genética pode discriminar de forma única qualquer pessoa de toda a população do mundo. Amostras minúsculas de DNA podem ser isoladas da cena do crime e comparadas às dos suspeitos ou de um banco de dados de DNA de evidências anteriores ou condenados. Versões mais simples desses testes costumam ser usadas para descartar rapidamente suspeitos durante uma investigação criminal. As evidências de crimes com décadas de idade podem ser testadas, confirmando ou exonerando as pessoas originalmente condenadas.
  • A tipagem forense de DNA tem sido uma forma eficaz de identificar ou exonerar suspeitos de crimes devido à análise de evidências descobertas na cena do crime. O genoma humano possui muitas regiões repetitivas que podem ser encontradas em sequências de genes ou em regiões não codificantes do genoma. Especificamente, até 40% do DNA humano é repetitivo. [4] Existem duas categorias distintas para essas regiões repetitivas e não codificantes no genoma. A primeira categoria é chamada de repetições em tandem de número variável (VNTR), que têm de 10 a 100 pares de bases e a segunda categoria é chamada de repetições em tandem curtas (STR) e consistem em seções de pares de bases repetidas de 2 a 10. O PCR é usado para amplificar vários VNTRs e STRs bem conhecidos usando primers que flanqueiam cada uma das regiões repetitivas. Os tamanhos dos fragmentos obtidos de qualquer indivíduo para cada um dos STRs indicarão quais alelos estão presentes. Ao analisar vários STRs para um indivíduo, será encontrado um conjunto de alelos para cada pessoa que, estatisticamente, provavelmente será único. [4] Os pesquisadores identificaram a sequência completa do genoma humano. Essa sequência pode ser facilmente acessada através do site do NCBI e é usada em muitos aplicativos da vida real. Por exemplo, o FBI compilou um conjunto de locais de marcadores de DNA usados ​​para identificação e são chamados de banco de dados de DNA do Sistema de Índice de DNA Combinado (CODIS). [4] O uso desse banco de dados permite que a análise estatística seja usada para determinar a probabilidade de uma amostra de DNA corresponder. O PCR é uma ferramenta analítica muito poderosa e significativa a ser usada para tipagem forense de DNA, porque os pesquisadores precisam apenas de uma pequena quantidade do DNA alvo a ser usado para análise. Por exemplo, um único cabelo humano com folículo piloso anexado tem DNA suficiente para conduzir a análise. Da mesma forma, alguns espermatozóides, amostras de pele sob as unhas ou uma pequena quantidade de sangue podem fornecer DNA suficiente para uma análise conclusiva. [4]
  • Formas menos discriminatórias de impressão digital de DNA podem ajudar em Teste de paternidade de DNA, onde um indivíduo é casado com seus parentes próximos. O DNA de restos mortais não identificados pode ser testado e comparado com o de possíveis pais, irmãos ou filhos. Testes semelhantes podem ser usados ​​para confirmar os pais biológicos de uma criança adotada (ou sequestrada). O verdadeiro pai biológico de um recém-nascido também pode ser confirmado (ou descartado).
  • O design PCR AMGX / AMGY foi mostrado para não apenas [esclarecimento necessário] facilitam a amplificação de sequências de DNA a partir de uma quantidade minúscula do genoma. No entanto, também pode ser usado para determinação de sexo em tempo real a partir de amostras de ossos forenses. Isso fornece uma maneira poderosa e eficaz de determinar o sexo em casos forenses e espécimes antigos. [39]

Aplicações de pesquisa Editar

O PCR tem sido aplicado a muitas áreas de pesquisa em genética molecular:

  • A PCR permite a produção rápida de pequenos pedaços de DNA, mesmo quando não mais do que a sequência dos dois primers é conhecida. Esta capacidade de PCR aumenta muitos métodos, como gerar hibridização sondas para hibridização Southern ou Northern blot. O PCR fornece a essas técnicas grandes quantidades de DNA puro, às vezes como uma única fita, permitindo a análise mesmo de quantidades muito pequenas do material inicial.
  • A tarefa de Sequenciamento de DNA também pode ser assistido por PCR. Segmentos conhecidos de DNA podem ser facilmente produzidos a partir de um paciente com uma mutação de doença genética. As modificações na técnica de amplificação podem extrair segmentos de um genoma completamente desconhecido ou podem gerar apenas uma única fita de uma área de interesse.
  • PCR tem inúmeras aplicações para o processo mais tradicional de Clonagem de DNA. Ele pode extrair segmentos para inserção em um vetor de um genoma maior, que pode estar disponível apenas em pequenas quantidades. Usando um único conjunto de 'primers de vetor', ele também pode analisar ou extrair fragmentos que já foram inseridos em vetores. Algumas alterações no protocolo de PCR podem gerar mutações (geral ou direcionado ao local) de um fragmento inserido.
  • Sites com tag de sequência é um processo em que o PCR é usado como um indicador de que um determinado segmento de um genoma está presente em um determinado clone. O Projeto Genoma Humano considerou esta aplicação vital para mapear os clones de cosmídeos que eles estavam sequenciando e para coordenar os resultados de diferentes laboratórios.
  • Uma aplicação de PCR é a análise filogênica de DNA de fontes antigas, como a encontrada em ossos recuperados de neandertais, em tecidos congelados de mamutes ou no cérebro de múmias egípcias. [15] Em alguns casos, o DNA altamente degradado dessas fontes pode ser remontado durante os estágios iniciais de amplificação.
  • Uma aplicação comum de PCR é o estudo de padrões de expressão genetica. Tecidos (ou mesmo células individuais) podem ser analisados ​​em diferentes estágios para ver quais genes se tornaram ativos ou quais foram desligados. Este aplicativo também pode usar PCR quantitativo para quantificar os níveis reais de expressão
  • A capacidade da PCR de amplificar simultaneamente vários loci de espermatozoides individuais [40] aumentou muito a tarefa mais tradicional de mapeamento genético estudando cruzamentos cromossômicos após a meiose. Eventos de cruzamento raros entre loci muito próximos foram observados diretamente por meio da análise de milhares de espermatozoides individuais. Da mesma forma, exclusões, inserções, translocações ou inversões incomuns podem ser analisadas, tudo sem ter que esperar (ou pagar) pelos processos longos e laboriosos de fertilização, embriogênese, etc.: PCR pode ser usado para criar genes mutantes com mutações escolhidas por cientistas à vontade. Essas mutações podem ser escolhidas para entender como as proteínas realizam suas funções e para alterar ou melhorar a função das proteínas.

O PCR tem várias vantagens. É bastante simples de entender e usar e produz resultados rapidamente. A técnica é altamente sensível, com potencial para produzir milhões a bilhões de cópias de um produto específico para sequenciamento, clonagem e análise. qRT-PCR compartilha as mesmas vantagens que o PCR, com uma vantagem adicional de quantificação do produto sintetizado. Portanto, tem seu uso para analisar alterações nos níveis de expressão gênica em tumores, micróbios ou outros estados de doença. [24]

O PCR é uma ferramenta de pesquisa muito poderosa e prática.O sequenciamento de etiologias desconhecidas de muitas doenças está sendo descoberto pela PCR. A técnica pode ajudar a identificar a sequência de vírus até então desconhecidos relacionados aos já conhecidos e, assim, nos dar uma melhor compreensão da própria doença. Se o procedimento puder ser ainda mais simplificado e sistemas sensíveis de detecção não radiométrica puderem ser desenvolvidos, a PCR assumirá um lugar de destaque no laboratório clínico nos próximos anos. [15]

Uma das principais limitações da PCR é que a informação prévia sobre a sequência alvo é necessária para gerar os primers que permitirão sua amplificação seletiva. [24] Isso significa que, normalmente, os usuários de PCR devem saber a (s) sequência (s) precisa (s) a montante da região alvo em cada um dos dois modelos de fita simples, a fim de garantir que a DNA polimerase se ligue corretamente aos híbridos de primer-modelo e subsequentemente, gera toda a região alvo durante a síntese de DNA.

Como todas as enzimas, as DNA polimerases também estão sujeitas a erros, o que, por sua vez, causa mutações nos fragmentos de PCR gerados. [41]

Outra limitação da PCR é que mesmo a menor quantidade de DNA contaminante pode ser amplificada, resultando em resultados enganosos ou ambíguos. Para minimizar a chance de contaminação, os pesquisadores devem reservar salas separadas para a preparação do reagente, a PCR e a análise do produto. Os reagentes devem ser dispensados ​​em alíquotas descartáveis. Pipetadores com êmbolos descartáveis ​​e pontas de pipeta extralongas devem ser usados ​​rotineiramente. [15]

Amostras ambientais que contêm ácidos húmicos podem inibir a amplificação por PCR e levar a resultados imprecisos.

  • PCR específico para alelo: uma técnica de diagnóstico ou clonagem baseada em variações de nucleotídeo único (SNVs não devem ser confundidos com SNPs) (diferenças de base única em um paciente). Requer conhecimento prévio de uma sequência de DNA, incluindo diferenças entre alelos, e usa iniciadores cujas extremidades 3 'abrangem o SNV (tampão de par de bases em torno de SNV geralmente incorporado). A amplificação por PCR em condições rigorosas é muito menos eficiente na presença de uma incompatibilidade entre o modelo e o iniciador, portanto, a amplificação bem-sucedida com um iniciador específico de SNP sinaliza a presença do SNP específico em uma sequência. [42] Consulte genotipagem SNP para obter mais informações.
  • PCR de montagem ou Conjunto de ciclagem de polimerase (PCA): síntese artificial de longas sequências de DNA através da realização de PCR em um pool de oligonucleotídeos longos com segmentos curtos sobrepostos. Os oligonucleotídeos alternam entre as direções sense e antisense, e os segmentos sobrepostos determinam a ordem dos fragmentos de PCR, produzindo assim seletivamente o produto final de DNA longo. [43]
  • PCR assimétrico: amplifica preferencialmente uma fita de DNA em um modelo de DNA de fita dupla. É usado em sondagem de sequenciação e hibridização onde a amplificação de apenas uma das duas fitas complementares é necessária. A PCR é realizada normalmente, mas com grande excesso do primer para a fita alvo de amplificação. Devido à amplificação lenta (aritmética) posterior na reação, após o primer limitante ter sido usado, são necessários ciclos extras de PCR. [44] Uma modificação recente neste processo, conhecida como euno ouvido-UMAdepoisTele-Exponential-PCR (LATE-PCR), usa um primer limitante com uma temperatura de fusão mais alta (Tm) do que o excesso de primer para manter a eficiência da reação, uma vez que a concentração limitante do primer diminui no meio da reação. [45]
  • PCR convectiva: uma forma pseudo-isotérmica de realizar PCR. Em vez de aquecer e resfriar repetidamente a mistura de PCR, a solução é submetida a um gradiente térmico. O fluxo convectivo conduzido por instabilidade térmica resultante embaralha automaticamente os reagentes de PCR das regiões quentes e frias, permitindo a PCR repetidamente. [46] Parâmetros como condições de contorno térmico e geometria do recinto de PCR podem ser otimizados para produzir PCR robusto e rápido aproveitando o surgimento de campos de fluxo caóticos. [47] Essa configuração de PCR de fluxo convectivo reduz significativamente a necessidade de energia do dispositivo e o tempo de operação.
  • PCR dial-out: um método altamente paralelo para recuperar moléculas de DNA precisas para a síntese de genes. Uma biblioteca complexa de moléculas de DNA é modificada com marcadores flanqueadores exclusivos antes do sequenciamento paralelo em massa. Os primers direcionados a tag permitem então a recuperação de moléculas com as sequências desejadas por PCR. [48]
  • PCR digital (dPCR): usado para medir a quantidade de uma sequência de DNA alvo em uma amostra de DNA. A amostra de DNA é altamente diluída de modo que, após executar muitos PCRs em paralelo, alguns deles não recebem uma única molécula do DNA alvo. A concentração de DNA alvo é calculada usando a proporção de resultados negativos. Daí o nome 'PCR digital'.
  • Amplificação dependente de helicase: semelhante ao PCR tradicional, mas usa uma temperatura constante em vez de percorrer os ciclos de desnaturação e anelamento / extensão. A DNA helicase, uma enzima que desenrola o DNA, é usada no lugar da desnaturação térmica. [49]
  • PCR de inicialização a quente: uma técnica que reduz a amplificação não específica durante as etapas de configuração inicial da PCR. Pode ser realizado manualmente aquecendo os componentes da reação à temperatura de desnaturação (por exemplo, 95 ° C) antes de adicionar a polimerase. [50] Foram desenvolvidos sistemas enzimáticos especializados que inibem a atividade da polimerase à temperatura ambiente, seja pela ligação de um anticorpo [12] [51] ou pela presença de inibidores ligados covalentemente que se dissociam apenas após uma etapa de ativação de alta temperatura. A PCR de inicialização a quente / finalização a frio é obtida com novas polimerases híbridas que são inativas à temperatura ambiente e são instantaneamente ativadas na temperatura de alongamento.
  • PCR in silico (PCR digital, PCR virtual, PCR eletrônico, e-PCR) refere-se a ferramentas computacionais usadas para calcular os resultados teóricos da reação em cadeia da polimerase usando um determinado conjunto de iniciadores (sondas) para amplificar sequências de DNA de um genoma ou transcriptoma sequenciado. A PCR in silico foi proposta como uma ferramenta educacional para a biologia molecular. [52]
  • PCR específico para interseqüência (ISSR): um método de PCR para impressões digitais de DNA que amplifica regiões entre repetições de sequências simples para produzir uma impressão digital única de comprimentos de fragmentos amplificados. [53]
  • PCR inverso: é comumente usado para identificar as sequências de flanco em torno das inserções genômicas. Envolve uma série de digestões de DNA e auto-ligação, resultando em sequências conhecidas em cada extremidade da sequência desconhecida. [54]
  • PCR mediada por ligação: usa pequenos ligantes de DNA ligados ao DNA de interesse e múltiplos primers emparelhamento aos ligantes de DNA. Tem sido usado para sequenciamento de DNA, caminhada do genoma e pegada de DNA. [55]
  • PCR específico para metilação (MSP): desenvolvido por Stephen Baylin e James G. Herman na Johns Hopkins School of Medicine, [56] e é usado para detectar a metilação de ilhas CpG no DNA genômico. O DNA é primeiro tratado com bissulfito de sódio, que converte bases de citosina não metiladas em uracila, que é reconhecida por primers de PCR como timina. Dois PCRs são então realizados no DNA modificado, usando conjuntos de iniciadores idênticos, exceto em quaisquer ilhas CpG dentro das sequências de iniciadores. Nestes pontos, um conjunto de iniciadores reconhece DNA com citosinas para amplificar DNA metilado, e um conjunto reconhece DNA com uracila ou timina para amplificar DNA não metilado. MSP usando qPCR também pode ser realizado para obter informações quantitativas em vez de qualitativas sobre metilação.
  • PCR de miniprimer: usa uma polimerase termoestável (S-Tbr) que pode se estender a partir de primers curtos ("smalligos") tão curtos quanto 9 ou 10 nucleotídeos. Este método permite PCR direcionado para regiões de ligação de primer menores e é usado para amplificar sequências de DNA conservadas, como o gene 16S (ou eucariótico 18S) rRNA. [57]
  • Amplificação de sonda dependente de ligação multiplex (MLPA): permite amplificar vários alvos com um único par de primers, evitando assim as limitações de resolução da PCR multiplex (ver abaixo).
  • Multiplex-PCR: consiste em vários conjuntos de primers em uma única mistura de PCR para produzir amplicons de tamanhos variados que são específicos para diferentes sequências de DNA. Ao direcionar vários genes ao mesmo tempo, informações adicionais podem ser obtidas em um único teste que, de outra forma, exigiria várias vezes os reagentes e mais tempo para realizar. As temperaturas de recozimento para cada um dos conjuntos de primer devem ser otimizadas para funcionar corretamente em uma única reação e tamanhos de amplicon. Ou seja, o comprimento do seu par de bases deve ser diferente o suficiente para formar bandas distintas quando visualizado por eletroforese em gel.
  • PCR assistido por nanopartículas (nanoPCR): algumas nanopartículas (NPs) podem aumentar a eficiência da PCR (sendo assim chamadas de nanoPCR), e algumas podem até superar os intensificadores de PCR originais. Foi relatado que os pontos quânticos (QDs) podem melhorar a especificidade e a eficiência da PCR. Nanotubos de carbono de parede única (SWCNTs) e nanotubos de carbono de parede múltipla (MWCNTs) são eficientes em aumentar a amplificação de PCR longa. Nanopó de carbono (CNP) pode melhorar a eficiência de PCR repetida e PCR longa, enquanto óxido de zinco, dióxido de titânio e NPs de Ag aumentam o rendimento da PCR. Os dados anteriores indicaram que os NPs não metálicos mantiveram a fidelidade de amplificação aceitável. Dado que muitos NPs são capazes de aumentar a eficiência do PCR, é claro que é provável que haja um grande potencial para melhorias na tecnologia nanoPCR e desenvolvimento de produtos. [58] [59]
  • PCR aninhado: aumenta a especificidade da amplificação do DNA, reduzindo o background devido à amplificação não específica do DNA. Dois conjuntos de primers são usados ​​em dois PCRs sucessivos. Na primeira reação, um par de primers é usado para gerar produtos de DNA, que além do alvo pretendido, ainda podem consistir em fragmentos de DNA amplificados não especificamente. O (s) produto (s) são então usados ​​em uma segunda PCR com um conjunto de iniciadores cujos locais de ligação são completamente ou parcialmente diferentes e localizados a 3 'de cada um dos iniciadores usados ​​na primeira reação. A PCR aninhada é freqüentemente mais bem-sucedida na amplificação específica de fragmentos longos de DNA do que a PCR convencional, mas requer um conhecimento mais detalhado das sequências alvo.
  • PCR de extensão de sobreposição ou Emenda por extensão de sobreposição (SOEing) : uma técnica de engenharia genética usada para unir dois ou mais fragmentos de DNA que contêm sequências complementares. É usada para unir pedaços de DNA contendo genes, sequências regulatórias ou mutações. A técnica permite a criação de construções de DNA longas e específicas. Também pode introduzir deleções, inserções ou mutações pontuais em uma sequência de DNA. [60] [61]
  • PAN-AC: usa condições isotérmicas para amplificação e pode ser usado em células vivas. [62] [63]
  • PCR quantitativo (qPCR): usado para medir a quantidade de uma sequência alvo (geralmente em tempo real). Ele mede quantitativamente as quantidades iniciais de DNA, cDNA ou RNA. PCR quantitativo é comumente usado para determinar se uma sequência de DNA está presente em uma amostra e o número de suas cópias na amostra. PCR quantitativo tem um alto grau de precisão. Métodos quantitativos de PCR usam corantes fluorescentes, como Sybr Green, EvaGreen ou sondas de DNA contendo fluoróforo, como TaqMan, para medir a quantidade de produto amplificado em tempo real. Às vezes também é abreviado para RT-PCR (tempo real PCR), mas esta abreviatura deve ser usada apenas para PCR de transcrição reversa. qPCR são as contrações apropriadas para PCR quantitativo (PCR em tempo real).
  • PCR reverso do complemento (RC-PCR): Permite a adição de domínios funcionais ou sequências de escolha a serem anexadas independentemente a qualquer uma das extremidades do amplicon gerado em uma única reação de tubo fechado. Este método gera primers específicos para o alvo dentro da reação pela interação de primers universais (que contêm as sequências ou domínios desejados a serem anexados) e sondas RC.
  • PCR de transcrição reversa (RT-PCR): para amplificar DNA a partir de RNA. A transcriptase reversa transcreve o RNA em cDNA, que é então amplificado por PCR. O RT-PCR é amplamente utilizado no perfil de expressão, para determinar a expressão de um gene ou para identificar a sequência de um transcrito de RNA, incluindo locais de início e término da transcrição. Se a sequência de DNA genômico de um gene for conhecida, o RT-PCR pode ser usado para mapear a localização de exons e íntrons no gene. A extremidade 5 'de um gene (correspondente ao local de início da transcrição) é tipicamente identificada por RACE-PCR (Amplificação rápida de extremidades de cDNA).
  • PCR dependente de RNase H (rhPCR): uma modificação de PCR que utiliza primers com um bloco de extensão 3 'que pode ser removido por uma enzima RNase HII termoestável. Este sistema reduz dímeros de primer e permite que reações multiplexadas sejam realizadas com um número maior de primers. [64]
  • PCR-primer específico único (SSP-PCR): permite a amplificação de DNA de fita dupla mesmo quando a informação da sequência está disponível em apenas uma extremidade. Este método permite a amplificação de genes para os quais apenas uma informação de sequência parcial está disponível e permite que o genoma unidirecional caminhe de regiões conhecidas para regiões desconhecidas do cromossomo. [65]
  • PCR de fase sólida: abrange vários significados, incluindo amplificação de polônia (onde colônias de PCR são derivadas de uma matriz de gel, por exemplo), PCR de ponte [66] (os primers são covalentemente ligados a uma superfície de suporte sólido), PCR de fase sólida convencional (onde PCR assimétrica é aplicado na presença de primer de suporte de suporte sólido com sequência correspondente a um dos primers aquosos) e PCR de fase sólida aprimorada [67] (em que PCR de fase sólida convencional pode ser melhorada empregando alta Tm e primer de suporte sólido aninhado com aplicação opcional de um termômetro 'passo' para favorecer o priming de suporte sólido).
  • PCR suicida: normalmente usado em paleogenéticos ou outros estudos em que evitar falsos positivos e garantir a especificidade do fragmento amplificado é a prioridade mais alta. Foi originalmente descrito em um estudo para verificar a presença do micróbio Yersinia pestis em amostras dentais obtidas em sepulturas do século 14 de pessoas supostamente mortas pela peste durante a epidemia de Peste Negra medieval. [68] O método prescreve o uso de qualquer combinação de primer apenas uma vez em uma PCR (daí o termo "suicídio"), que nunca deveria ter sido usado em qualquer reação de PCR de controle positivo, e os primers devem sempre ter como alvo uma região genômica nunca amplificada antes no laboratório usando este ou qualquer outro conjunto de primers. Isso garante que nenhum DNA contaminante de reações de PCR anteriores esteja presente no laboratório, o que poderia gerar falsos positivos.
  • PCR assimétrica térmica entrelaçada (TAIL-PCR): para o isolamento de uma sequência desconhecida que flanqueia uma sequência conhecida. Dentro da sequência conhecida, TAIL-PCR usa um par aninhado de iniciadores com diferentes temperaturas de anelamento, um iniciador degenerado é usado para amplificar na outra direção da sequência desconhecida. [69]
  • PCR Touchdown (PCR step-down): uma variante da PCR que visa reduzir o fundo inespecífico, diminuindo gradualmente a temperatura de anelamento conforme o ciclo da PCR progride. A temperatura de recozimento nos ciclos iniciais é geralmente alguns graus (3–5 ° C) acima do Tm dos primers usados, enquanto nos ciclos posteriores, é alguns graus (3–5 ° C) abaixo do primer Tm. As temperaturas mais altas dão maior especificidade para a ligação do iniciador e as temperaturas mais baixas permitem uma amplificação mais eficiente dos produtos específicos formados durante os ciclos iniciais. [70]
  • Caminhada rápida universal: para caminhada do genoma e impressão digital genética usando um PCR 'bilateral' mais específico do que as abordagens convencionais 'unilaterais' (usando apenas um iniciador específico de gene e um iniciador geral - que pode levar a 'ruído' artefatual) [71] em virtude de um mecanismo que envolve a formação da estrutura do laço. Derivados simplificados de UFW são LaNe RAGE (nested PCR dependente de lariat para amplificação rápida de extremidades de DNA genômico), [72] 5'RACE LaNe [73] e 3'RACE LaNe. [74]

As enzimas resistentes ao calor que são um componente-chave na reação em cadeia da polimerase foram descobertas na década de 1960 como um produto de uma forma de vida microbiana que vivia nas águas superaquecidas da Fonte do Cogumelo de Yellowstone. [75]

Um artigo de 1971 no Journal of Molecular Biology por Kjell Kleppe e colegas de trabalho no laboratório de H. Gobind Khorana descreveram pela primeira vez um método de uso de um ensaio enzimático para replicar um molde curto de DNA com primers em vitro. [76] No entanto, essa manifestação inicial do princípio básico da PCR não recebeu muita atenção na época e a invenção da reação em cadeia da polimerase em 1983 é geralmente creditada a Kary Mullis. [77]

Quando Mullis desenvolveu o PCR em 1983, ele trabalhava em Emeryville, Califórnia, para a Cetus Corporation, uma das primeiras empresas de biotecnologia, onde era responsável pela síntese de cadeias curtas de DNA. Mullis escreveu que concebeu a ideia do PCR enquanto cruzava a Pacific Coast Highway uma noite em seu carro. [78] Ele estava brincando em sua mente com uma nova forma de analisar mudanças (mutações) no DNA quando percebeu que, em vez disso, havia inventado um método de amplificação de qualquer região do DNA por meio de ciclos repetidos de duplicação impulsionados pela DNA polimerase. No Americano científico, Mullis resumiu o procedimento: "Começando com uma única molécula do DNA do material genético, o PCR pode gerar 100 bilhões de moléculas semelhantes em uma tarde. A reação é fácil de executar. Não requer mais do que um tubo de ensaio, alguns reagentes simples , e uma fonte de calor. " [79] A impressão digital de DNA foi usada pela primeira vez para testes de paternidade em 1988. [80]

Mullis e o professor Michael Smith, que desenvolveram outras formas essenciais de manipulação do DNA, [81] foram agraciados com o Prêmio Nobel de Química em 1993, sete anos depois que Mullis e seus colegas da Cetus colocaram sua proposta em prática pela primeira vez. [82] O artigo de Mullis de 1985 com RK Saiki e HA Erlich, "Enzymatic Amplification of β-globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia" - a invenção da reação em cadeia da polimerase (PCR) - foi homenageado por uma Citation for Chemical Prêmio Revelação da Divisão de História da Química da American Chemical Society em 2017. [83] [1]

No cerne do método de PCR está o uso de uma DNA polimerase adequada, capaz de resistir às altas temperaturas de & gt90 ° C (194 ° F) necessárias para a separação das duas fitas de DNA na dupla hélice de DNA após cada ciclo de replicação. As polimerases de DNA inicialmente empregadas para experimentos in vitro que antecederam a PCR foram incapazes de suportar essas altas temperaturas. [1] Portanto, os primeiros procedimentos para a replicação do DNA eram muito ineficientes e demorados, e exigiam grandes quantidades de DNA polimerase e manuseio contínuo ao longo do processo.

A descoberta em 1976 de Taq polimerase - uma DNA polimerase purificada da bactéria termofílica, Thermus aquaticus, que vive naturalmente em ambientes quentes (50 a 80 ° C (122 a 176 ° F)) [13], como fontes termais, abriu o caminho para melhorias dramáticas no método de PCR. A DNA polimerase isolada de T. aquaticus é estável em altas temperaturas, permanecendo ativo mesmo após a desnaturação do DNA, [14] evitando assim a necessidade de adicionar nova DNA polimerase após cada ciclo. [2] Isso permitiu um processo automatizado baseado em termociclador para amplificação de DNA.

Editar disputas de patentes

A técnica de PCR foi patenteada por Kary Mullis e atribuída à Cetus Corporation, onde Mullis trabalhou quando inventou a técnica em 1983. O Taq A enzima polimerase também foi protegida por patentes. Houve vários processos judiciais de alto perfil relacionados à técnica, incluindo um processo malsucedido movido pela DuPont. A empresa farmacêutica suíça Hoffmann-La Roche comprou os direitos das patentes em 1992 e atualmente [ quando? ] mantém aqueles que ainda estão protegidos.

Uma batalha relacionada a patentes sobre o Taq A enzima polimerase ainda está em andamento em várias jurisdições ao redor do mundo entre Roche e Promega. Os argumentos legais se estenderam além da vida do PCR original e Taq patentes de polimerase, que expiraram em 28 de março de 2005. [84]


Etapa 5: otimização qPCR

Projeto e teste de primer

Durante a expressão do gene, o DNA é primeiro transcrito em mRNA. Nos eucariotos, as regiões não codificantes da sequência de mRNA, conhecidas como íntrons, são removidas e as regiões codificadoras de proteínas, conhecidas como exons, são unidas para produzir o mRNA maduro que é traduzido em proteína. Este processo é chamado de splicing de RNA. O genoma humano contém

20.000 genes codificadores de proteínas, que podem ser processados ​​em mais de 80.000 mRNA codificadores de proteínas, e o número estimado de proteínas sintetizadas está na faixa de 250.000 a 1 milhão [23]. Isso sugere que a regulação da expressão gênica é um processo complicado. Um dos processos regulatórios é o splicing alternativo, no qual exons específicos do mesmo gene são unidos para produzir mRNAs múltiplos, chamados de variantes de splice, que são então traduzidos em diferentes isoformas de proteínas. Recomendamos incluir todas as variantes de splice de um gene alvo, a menos que o usuário esteja interessado apenas em uma variante de splice particular do gene alvo. Também é preferível projetar iniciadores que se liguem especificamente ao cDNA, mas não ao DNA genômico, uma vez que a amplificação do DNA genômico pode interferir na análise da expressão gênica. Isso pode ser alcançado projetando uma sequência de primer que cruza uma junção exon-exon, ou incluindo um grande íntron entre o primer direto e reverso. Este é um requisito essencial se nenhuma etapa de eliminação do DNA genômico for realizada durante a extração do RNA. Em certas circunstâncias, como quando a sequência do gene alvo não contém um íntron ou o primer não pode ser localizado na junção exon-exon devido à sequência de DNA, o DNA genômico deve ser removido da amostra de RNA antes de ser convertido em cDNA. Por exemplo, o gene que codifica o membro 6 da família A da proteína de choque térmico humano (HSPA6) não contém nenhum íntron e, portanto, o DNA genômico deve ser removido da amostra de RNA para evitar que os iniciadores amplifiquem tanto o DNA genômico quanto o cDNA simultaneamente durante a reação qPCR . A vantagem de usar kits baseados em coluna de rotação disponíveis comercialmente para extrair RNA é que eles geralmente incluem uma etapa de eliminação de DNA genômico.

Para testar se os primers são específicos para cDNA, uma abordagem é realizar reações qPCR usando cDNA, um controle & # x002d7RT ou água como modelo. Os amplicons finais de PCR podem então ser separados usando eletroforese com um gel de agarose a 2%. Uma única banda nítida de DNA de tamanho esperado deve estar presente apenas na reação com cDNA se os primers estão apenas se ligando ao cDNA (Fig. 4).

Os produtos do fragmento de DNA produzidos a partir de uma reação de PCR com os mesmos primers, mas usando água (Pista 2), -RT (reação de síntese de cDNA contendo RNA, mas sem cDNA, Pista 3) ou cDNA (Pista 4) como molde, foram separados em um gel de agarose a 2%. A pista 1 é a escada de DNA de 100 pb. Uma única banda nítida de DNA do tamanho esperado, que são os amplicons finais da PCR, está presente apenas na reação com o cDNA.

A especificidade do primer também pode ser verificada pela análise da curva de fusão. A análise da curva de fusão é uma avaliação das características de dissociação do DNA de fita dupla (o produto da reação qPCR) durante o aquecimento e pode ser usada em reações qPCR com corantes intercalantes, como SYBR Green. SYBR Green só apresenta fluorescência quando está ligado ao DNA de fita dupla, mas não na presença de DNA de fita simples. No final de uma execução de qPCR, o termociclador é programado para aumentar a temperatura gradualmente de 60 & # x000b0C a 95 & # x000b0C (0,05 & # x000b0C & # x000b7s -1) e para medir a quantidade de fluorescência. O amplicon de PCR de fita dupla começa a desnaturar em DNA de fita simples, resultando em fluorescência diminuída. A temperatura na qual a ligação de hidrogênio base-base entre duas fitas de DNA é quebrada depende de seu comprimento, conteúdo de guanina-citosina e sua complementaridade, portanto, uma curva de fusão única da taxa de variação de fluorescência (-Rn) versus temperatura será produzida para cada fragmento de DNA de fita dupla específico (Fig. 5). Se mais de um fragmento de DNA for produzido durante a reação qPCR, usando cDNA e DNA genômico como modelo, respectivamente, mais de uma curva de fusão será detectada. É altamente recomendável incluir a análise da curva de fusão com a análise qPCR baseada em SYBR Green e garantir que um único produto específico seja produzido em todas as reações que amplificam o mesmo gene alvo. Isso pode ser feito facilmente adicionando o programa de temperatura da curva de fusão no final de uma execução qPCR, que é uma função disponível na maioria dos instrumentos qPCR.

A reação qPCR usando cDNA sintetizado a partir da amostra Intact (rosa) e Degraded RNA (vermelho) mostra a mesma curva de fusão, indicando que o mesmo amplicon de PCR é produzido. No entanto, uma curva de fusão diferente é observada ao usar o cDNA sintetizado a partir da amostra de RNA tratada com RNase (azul), o que mostra que um amplicon de PCR diferente é produzido durante a reação qPCR. Nossas recomendações para otimização qPCR estão listadas na Caixa 6.

Caixa 6

Recomenda-se projetar primers qPCR que são específicos para o gene alvo e apenas amplificar cDNA (por exemplo, direcionar todas as isoformas pretendidas e abranger uma junção entre exons), e a especificidade do primer precisa ser testada como parte do processo de validação qPCR [ 1]. Recomendamos incluir uma análise da curva de fusão para testar a especificidade do primer, pois não requer nenhuma etapa extra. De acordo com as diretrizes MIQE, os autores são obrigados a fornecer informações suficientes sobre o alvo qPCR e primers, como o símbolo do gene, número de acesso de sequência e comprimento do amplicon [1] (ver exemplo no Experimento 4).

Otimizando o desempenho de qPCR

Em uma reação qPCR, o ciclo de quantificação (Cq) o valor é definido como o número de ciclos necessários para que o sinal fluorescente exceda a fluorescência de fundo (também conhecido como ciclo de limiar (Ct), ponto de cruzamento (Cp), ou ponto de decolagem (TOP) em publicações anteriores). Os programas de software qPCR podem definir o limite automaticamente após a determinação da fluorescência da linha de base do ciclo 3 ao 15 em toda a placa de reação, que é conhecido como valor da linha de base. Por padrão, o programa de software QuantStudio Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA), que usamos em nosso laboratório, define esse limite em dez desvios padrão acima da fluorescência média da linha de base. No entanto, a linha de base e o limite podem ser ajustados manualmente.

Para obter alta eficiência de amplificação (um aumento no número de amplicons de PCR por ciclo), tanto o primer quanto a concentração de cDNA precisam ser otimizados para diferentes genes-alvo. A eficiência de amplificação recomendada está entre 93% e 105% (a inclinação do Cq contra o Log da entrada de cDNA em uma curva padrão está entre -3,2 e -3,5 e o valor de R 2 está acima de 0,98 (ver exemplos na Fig 6) [15].

Uma curva padrão foi gerada usando uma diluição de 10 vezes de cDNA como modelo para reações qPCR. O C resultanteq os valores são plotados contra o Log da entrada de cDNA. A eficiência, assim como o valor de R 2, estão dentro da faixa aceitável. As eficiências de Ciclofilina e PGC-1 & # x003b1 são aproximadamente iguais, como o valor absoluto da inclinação de & # x00394Cq contra o Log da entrada de cDNA é & # x0003c 0.1.

A escolha da concentração de cDNA para a reação qPCR final dependerá do kit qPCR de escolha, dos primers usados, bem como do nível de expressão do gene alvo. Em nosso laboratório, primeiro diluímos o cDNA dez vezes com água antes de usar em qualquer reação qPCR. Ao testar um novo conjunto de primers, uma curva padrão deve ser gerada usando uma série de amostras de cDNA diluídas como modelo (Fig 6, usando Ciclofilina e PGC-1 & # x003b1 como um exemplo,). Uma reação de controle & # x0201cno template & # x0201d deve ser configurada usando apenas água (controle sem modelo, TFC). A eficiência de amplificação qPCR pode então ser calculada a partir da inclinação do gráfico de Cq valores plotados contra o Log da entrada de cDNA (Eficiência = (10 & # x022121 / inclinação & # x02013 1) & # x000d7 100). Novos conjuntos de primers devem ser projetados e testados se a eficiência da amplificação não estiver dentro da faixa recomendada.

Para todos os experimentos descritos neste artigo, usamos uma concentração inicial de primer de 300 nM. Recomenda-se escolher as concentrações de primer e cDNA dentro da faixa dinâmica linear para qPCR, o que resulta em um Cq entre 20 e 30 [15]. No entanto, em reações com um alto Cq valor (& # x0003e30, dependendo do nível de expressão do gene alvo e do protocolo qPCR), é necessário executar reações qPCR com diferentes concentrações de primer e usar a concentração que dá o menor Cq valor (indicando que a reação foi realizada nas condições mais eficientes). Diferentes kits de reação qPCR podem recomendar uma concentração de primer diferente. Nossas recomendações para otimizar o desempenho de qPCR estão listadas na Caixa 7.

Box 7

É sugerido manter a configuração padrão da máquina & # x02019s como o limite, mas sempre verificar se ela foi definida na região de amplificação exponencial em todos os gráficos de amplificação e se todos os gráficos estão paralelos e acima do ruído de fundo da linha de base [ 15]. Cada reação qPCR deve ser otimizada para atingir um C preferidoq valor (20 a 30) e eficiência de amplificação (93% & # x02013105%). Para alguns genes alvo, é difícil obter primers com a eficiência de amplificação desejada, mesmo depois de testar vários conjuntos de primers. Recomendamos o uso de primers com uma eficiência de amplificação mais próxima da faixa desejada entre 93% e 105% (ver primers para ACTB e GAPDH como exemplos na Experiência 4).


SCRIPT RT-qPCR ProbesMaster

Descrição:
SCRIPT RT-qPCR ProbesMaster é projetado para análises quantitativas em tempo real de modelos de RNA usando sondas fluorescentes com rótulo duplo. A mistura pronta para uso é baseada em uma transcriptase reversa geneticamente modificada com estabilidade térmica aprimorada, proporcionando maior especificidade, alto rendimento de cDNA e eficiência aprimorada para fragmentos de cDNA longos e altamente estruturados.
O 2x conc. mix contém todos os reagentes necessários para RT-qPCR (exceto template, primers e a sonda fluorescente dupla marcada) para garantir uma preparação rápida e fácil com um mínimo de etapas de pipetagem. As enzimas de qualidade premium e o tampão de reação otimizado contendo dNTPs ultrapuros garantem resultados superiores de PCR em tempo real.
RT-qPCR é usado para amplificar DNA de fita dupla a partir de modelos de RNA de fita simples para permitir uma quantificação rápida em tempo real de alvos de RNA. Na etapa de transcrição reversa, a transcriptase reversa sintetiza moléculas de DNA de fita simples (cDNA) complementares ao modelo de RNA. No primeiro ciclo da etapa de PCR, a DNA polimerase hot-start sintetiza moléculas de DNA complementares ao cDNA, gerando assim um molde de DNA de fita dupla. A atividade da polimerase de início a quente é bloqueada à temperatura ambiente e ligada automaticamente no início da desnaturação inicial. A ativação térmica evita a extensão de primers não especificamente recozidos e formações de primer-dímero em baixas temperaturas durante a configuração de PCR.
O RT-qPCR de uma etapa oferece tremenda conveniência quando aplicado à análise de alvos de várias amostras de RNA e minimiza o risco de contaminações.
A mistura também pode ser usada em combinação com o corante de referência ROX (# PCR-351) em instrumentos de PCR compatíveis com a avaliação do sinal ROX.

Contente:
SCRIPT RT-qPCR ProbesMaster
Mistura pronta para uso de SCRIPT Reverse Transcriptase, Hot Start Polymerase, RNase Inhibitor, dNTPs, buffer de reação e estabilizadores.

Sondas fluorescentes com rótulo duplo:
A tecnologia de PCR em tempo real baseada em sondas de DNA duplamente rotuladas fornece um sistema de PCR altamente sensível e específico com capacidade de multiplexação. Requer dois primers de PCR padrão e a sonda de DNA que hibridiza com uma parte interna do amplicon. A sequência da sonda de DNA duplamente marcada deve evitar a estrutura secundária e a formação de primer-dímero.

Continue com a transcrição reversa e a ciclagem térmica, conforme recomendado.

Transcrição reversa e ciclagem térmica:
Coloque os frascos em um ciclador PCR e inicie o seguinte programa.

reverter
transcrição 5)
50-55 ° C10-15 min1x
inicial
desnaturação 6)
95 ° C5 min1x
desnaturação95 ° C15 s35-45x
recozimento e
alongamento
60-65 ° C 7) 1 min 8) 35-45x

Para uma especificidade e amplificação ideais, pode ser necessária uma otimização individual dos parâmetros recomendados. Observe que os tempos de reação e as temperaturas ideais devem ser ajustados para cada par particular de RNA / primer.


ESBOÇO E JUSTIFICATIVA DO MÉTODO

O kit de extração foi selecionado com base em sua eficiência para isolar DNA genômico e plasmídeo de planta que deve ser posteriormente amplificado pela PCR. A extração de DNA consiste em quebrar a parede celular, eliminando o RNA e removendo proteínas por precipitação. Em seguida, o DNA é fixado em coluna de afinidade, lavado e eluído. Abordagens semelhantes já foram aplicadas à detecção de DNA de outras plantas [6] ou de vírus [7].

Observe que, neste experimento, a PCR é usada para determinar se a farinha de soja contém material vegetal geneticamente modificado, mas a técnica também pode ser usada em vários contextos, como paleontologia e ciência forense [8 - 12]. O PCR prossegue em três fases: 1) desnaturação por calor do DNA de fita dupla, 2) hibridização dos primers nas sequências por resfriamento e 3) alongamento do DNA por meio da extensão dos primers em direções opostas. Essas três etapas são chamadas de ciclo, e a PCR consiste na repetição desse ciclo. A quantidade de DNA é amplificada exponencialmente. O rendimento de DNA, portanto, aumenta em função de 2 n, onde n é o número de ciclos. Isso significa que, após um ciclo, a quantidade de DNA é duplicada e, após 30 ciclos, teoricamente o DNA foi amplificado mais de 109 vezes e pode ser facilmente detectado em gel de eletroforese.

Para este experimento, os primers de PCR foram projetados para detectar dois tipos de genes. O primeiro conjunto de primer amplifica genes endógenos de plantas, um gene do cloroplasto e o gene específico da lectina da soja. Dessa forma, verificamos a presença do DNA da planta e, em particular, do DNA da soja. O segundo conjunto de iniciadores amplifica sequências normalmente não encontradas em plantas, mas introduzidas por transformação genética. Neste caso, os dois DNAs estranhos amplificados são o promotor 35 S constitutivamente ativo do vírus do mosaico da couve-flor e o terminador do gene da nopalina sintetase (NOS) de Agrobacterium tumefaciens. Se qualquer uma dessas duas sequências for amplificada, isso mostra que o DNA alvo é transgênico [1]. Em princípio, todas as safras agrícolas geneticamente modificadas aprovadas foram transformadas com construções contendo um ou ambos os elementos. A identificação de novas sequências promotoras e terminadoras em construções transgênicas está se tornando uma questão de preocupação para os cientistas.

Os primers de PCR foram projetados para criar produtos amplificados de diferentes tamanhos para facilitar sua identificação. A Tabela I mostra as sequências dos iniciadores sintetizados. Os locais de recozimento foram escolhidos para gerar apenas um único fragmento de DNA para simplificar a interpretação. Esses fragmentos são visualizados como bandas em géis de agarose após PCR (consulte a tabela para os tamanhos das sequências amplificadas).


Reação em cadeia da polimerase

David P. Clark,. Michelle R. McGehee, em Molecular Biology (Terceira Edição), 2019

5 PCR inverso

Outra abordagem que usa informações de sequência incompleta para amplificar um gene alvo é PCR inverso . Nesse caso, uma sequência de parte de uma longa molécula de DNA, digamos um cromossomo, é conhecida. O objetivo é estender a análise ao longo da molécula de DNA até regiões desconhecidas. Para sintetizar os primers para PCR, a sequência alvo desconhecida deve ser flanqueada por duas regiões de sequência conhecida. A situação atual é exatamente o oposto disso. Para contornar esse problema, a molécula alvo de DNA é primeiro convertida em um círculo.

A realização de PCR em um molde circular de DNA amplifica regiões vizinhas de sequência desconhecida.

Uma enzima de restrição, geralmente uma que reconhece uma sequência de seis bases, é usada para fazer o círculo. Esta enzima não deve cortar na sequência conhecida, mas irá cortar a montante e a jusante da região conhecida. O fragmento resultante terá uma sequência desconhecida primeiro, a sequência conhecida no meio, seguida por uma sequência mais desconhecida. As duas extremidades do fragmento terão extremidades adesivas compatíveis que são facilmente ligadas entre si para formar um círculo de DNA (Fig. 6.12). Dois primers correspondentes à região conhecida e voltados para fora ao redor do círculo são usados ​​para PCR. A síntese do novo DNA ocorrerá em torno do círculo no sentido horário a partir de um primer e no sentido anti-horário a partir do outro. No geral, a PCR inversa fornece várias cópias de um segmento de DNA contendo algum DNA à direita e algum DNA à esquerda da região original conhecida.

A PCR inversa permite que sequências desconhecidas sejam amplificadas por PCR, desde que estejam localizadas ao lado do DNA em que a sequência já é conhecida. O DNA é cortado com uma enzima de restrição que não corta dentro da região da sequência conhecida, como mostrado na Etapa 1. Isso gera um fragmento de DNA contendo a sequência conhecida flanqueada por duas regiões de sequência desconhecida. Uma vez que o fragmento tem duas extremidades coesivas correspondentes, ele pode ser facilmente circularizado pela DNA ligase. Finalmente, a PCR é realizada nos fragmentos circulares de DNA (Etapa 2). Dois primers são usados ​​voltados para fora da sequência de DNA conhecida. A amplificação por PCR fornece várias cópias de um produto linear que inclui DNA desconhecido dos lados esquerdo e direito.


Assista o vídeo: Como otimizar a concentração de primers e sondas na PCR em tempo real (Dezembro 2022).