Em formação

O que é esse líquido vermelho produzido por uma colônia de fungos?

O que é esse líquido vermelho produzido por uma colônia de fungos?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Em uma jarra, onde eu tinha algumas plantas de orquídea, um fungo começou a crescer há poucos dias. Tirei as plantas e deixei os fungos se expandirem e crescerem mais. Após alguns dias, gotas vermelhas começaram a aparecer na superfície do corpo do fungo (imagens abaixo).

Alguém sabe o que provavelmente pode ser ou reconhece os fungos? É um antibiótico ou outra coisa?


Prática de laboratório de microbiologia

O teste de Kirby-Bauer é usado para determinar a potência dos antibióticos em um patógeno medindo o diâmetro da zona de inibição ao redor do disco (zona clara) e comparando-o com um gráfico padrão de antibiótico para determinar se o patógeno é resistente, sensível / suscetível ou intermediário ao antibiótico.

Os desinfetantes matam as formas vegetativas de bactérias, mas não as formas de endosporo. Tóxico para humanos.

Inocular microorganismos em placas TSA com S. epidermidis (Gram +), B. cereus (endosporos), E. coli (Gram -) e P. aeruginosa (Gram -). Após a incubação, meça o diâmetro da zona clara (zona de inibição) e registre os resultados.

As bactérias Gram (+) foram mais suscetíveis a anti-sépticos e desinfetantes.

1. A placa de infusão de cérebro e coração é dividida em 4 seções:
a) DNA apenas
b) Células Str S
c) Células Str R (controle positivo)
d) Células Str S + DNA = A transformação ocorre aqui

2. Observe a placa BHI. Nenhum crescimento na seção um crescimento em todas as outras seções. Obtenha uma nova placa TSY inoculada com estreptomicina (antibiótico) e divida-a em 3 seções:
b) Células Str S
c) Células Str R (controle positivo)
d) Células Str S + DNA = A transformação ocorre aqui

2. Staphylococcus auerus: aglomerados de cocos Gram (+). A cor da colônia é amarela. Anaeróbio facultativo. Fermentador de glicose positivo. Teste de coagulase positivo.

3. Proprionibacterium acne: bastonetes de Gram (+). A cor da colônia é muito pequena, branco / rosa. Obrigue o anaeróbio. Fermentador de glicose positivo. Nenhum teste de coagulase necessário.

1) Colônias amarelas e ágar amarelo é (+) fermentador
-S. aureus
2) Colônias rosa e ágar vermelho é (-) fermentador
-S. epidermidis

2) observar a placa de ágar sangue para hemólise beta e alfa. Prepare a coloração de Gram das colônias acima e procure diplococos ou cadeias de cocos. Estes indicam Streptococcus.

3) para cada colônia que parece ser Streptococcus, realize os seguintes testes inoculando:
- Placa de ágar sangue com discos de antibióticos de bacitracina (Beta) e optoquina (Alfa / Gama)
-Bile esculina inclinada
- Tubo de sal NaCl

4) observar a placa de ágar sangue com disco de antibiótico de bacitracina para Beta e disco de antibiótico de optoquina para Alfa / Gama. Meça o diâmetro da zona de inibição. Se for maior que 14 mm, a bactéria é suscetível.


REVER artigo

  • 1 Divisão de Agricultura Sustentável, Centro de Nanobiotecnologia TERI-Deakin, Instituto de Energia e Recursos, Gurugram, Índia
  • 2 Escola de Ciências da Vida e Ambientais, Deakin University, Geelong, VIC, Austrália

A crescente preocupação com os efeitos nocivos dos corantes sintéticos tanto no consumidor quanto no meio ambiente tem despertado um grande interesse em alternativas de corantes naturais. Como resultado, a demanda mundial por corantes de origem natural está aumentando rapidamente nos setores de alimentos, cosméticos e têxteis. Os corantes naturais têm a capacidade de ser usados ​​para uma variedade de aplicações industriais, por exemplo, como corantes para substratos têxteis e não têxteis, como couro, papel, em tintas e revestimentos, em cosméticos e em aditivos alimentares. Atualmente, os pigmentos e corantes produzidos através de plantas e micróbios são a principal fonte explorada pelas indústrias modernas. Entre as outras fontes não convencionais, fungos filamentosos particularmente fungos ascomicetos e basidiomicetos (cogumelos) e líquenes (associação simbiótica de um fungo com uma alga verde ou cianobactéria) são conhecidos por produzir uma gama extraordinária de cores, incluindo várias classes químicas de pigmentos como como melaninas, azafilonas, flavinas, fenazinas e quininas. Esta revisão busca enfatizar a oportunidade oferecida por pigmentos naturalmente encontrados em fungos como uma alternativa verde viável às fontes atuais. Esta revisão apresenta uma discussão abrangente sobre a capacidade dos recursos fúngicos, como endófitos, halófitos e fungos, obtidos de uma variedade ou fontes, como solo, sedimentos, manguezais e ambientes marinhos. Um dos principais impulsionadores do interesse em fungos como fonte de pigmentos deriva de fatores ambientais e a discussão aqui se estenderá sobre o avanço das técnicas de extração mais ecológicas usadas para a extração de pigmentos intracelulares e extracelulares. A busca por compostos de interesse requer uma abordagem multidisciplinar e técnicas como metabolômica, engenharia metabólica e abordagens biotecnológicas que têm potencial para lidar com diversos desafios enfrentados pela indústria de pigmentos.


5 tipos principais de clonagem (com diagrama)

Desde tempos muito antigos, sabe-se que uma variedade de micróbios, como bactérias e leveduras (fungos), são úteis na fabricação de um grande número de produtos, por exemplo, ácido lático, etanol, vinagre, queijo, etc., como também de utilidade industrial substâncias como amilase, protease e antibióticos que salvam vidas, como penicilina e tetraciclina.

As proteínas celulares também podem ser produzidas por micróbios (bactérias e fungos). Várias cepas melhoradas desses micróbios foram desenvolvidas usando mutantes e outras técnicas convencionais.

Hoje, técnicas de clonagem de genes e engenharia genética são geralmente usadas para melhorar as cepas microbianas úteis para tantos propósitos:

(a) Para produzir compostos úteis, como enzimas e vitaminas em grande escala.

(b) Eles podem ser projetados para produzir vários produtos farmaceuticamente úteis, tais como insulina humana (por exemplo, em Escherichia coli), interferon, hormônio de crescimento humano e vacinas virais.

(c) Várias cepas microbianas são usadas em várias indústrias para realizar muitas funções importantes, como a remoção de lignina indesejada (por exemplo, Trametes).

(d) Micróbios (por exemplo, bactérias que acumulam metais pesados ​​como Pseudomonas) podem ser usados ​​para purificar o ambiente poluído (chamado de biorremediação).

(e) Certos micróbios, como Trichoderma (fungo) e Rhizobium (bactéria), são usados ​​para biocontrole (contra doenças e pragas de plantas) e como biofertilizadores, respectivamente.

No processo de clonagem de DNA, fragmentos de DNA eucariótico são introduzidos em células bacterianas, que são então cultivadas em colônias individuais em um prato de cultura.

À medida que uma célula se prolifera para formar uma colônia, a única molécula de DNA absorvida pelo fundador da colônia é repetidamente replicada pelas enzimas presentes nas células bacterianas, de modo que, ao final do período de crescimento, o número de cópias da sequência estranha foi grandemente amplificado.

A clonagem, portanto, pode ser usada como uma técnica para produzir grandes quantidades de uma determinada sequência de DNA, mas, mais importante, pode ser usada como uma técnica para isolar, em uma forma absolutamente pura, qualquer fragmento de DNA específico entre uma grande população heterogênea de moléculas de DNA.

Tipo 2. Clonagem de genes:

O objetivo da técnica de clonagem é introduzir uma cópia de um fragmento de DNA eucariótico em uma célula bacteriana receptora sob condições nas quais ela se replicará autonomamente do cromossomo hospedeiro. Para atingir esse objetivo, o DNA eucariótico deve estar ligado ao DNA de um vetor que normalmente se replica em um ambiente bacteriano.

O vetor mais comumente empregado em procedimentos de clonagem é o plasmídeo bacteriano. O uso de plasmídeos é o seguinte: Os plasmídeos são moléculas de DNA extra-cromossômicas não essenciais presentes em muitas bactérias.

Como o cromossomo bacteriano principal, eles são círculos de fita dupla, mas são muito menores e de constituição genética variável. Uma vez que os plasmídeos e os DNAs cromossômicos têm propriedades físicas muito diferentes, eles podem ser facilmente separados um do outro.

O DNA estranho a ser clonado é inserido no plasmídeo para formar a molécula de DNA recombinante. Este plasmídeo modificado é então adicionado a uma cultura bacteriana como DNA nu e na presença de CaCl2, uma pequena porcentagem das bactérias vai pegar uma dessas moléculas do meio. Uma vez que um plasmídeo é captado, ele se replica autonomamente dentro do receptor e é passado para sua progênie durante a divisão celular.

Uma grande variedade de plasmídeos foi isolada, muitos dos quais carregam genes para resistência a antibióticos. Se esses plasmídeos forem adicionados a uma cultura bacteriana e as células forem tratadas com antibióticos específicos, apenas as bactérias que absorveram o plasmídeo serão capazes de sobreviver.

Como o DNA do vetor se combina com aquele que forma o genoma eucariótico? As moléculas de DNA recombinante podem ser formadas de várias maneiras.

Os DNAs recombinantes podem ser construídos entre fragmentos de DNA com extremidades cegas. Isso pode ser feito adicionando enzimaticamente uma cadeia de nucleotídeos portadores de A ou C a uma cadeia do fragmento e uma cadeia complementar de nucleotídeos portadores de T ou G à cadeia oposta do vetor, misturando as duas populações e selando as moléculas com a ligase.

Clonando Fragmentos Genômicos:

Ao trabalhar com DNA genômico, é necessário isolar um ou mais genes específicos, como os que codificam as histonas, entre as milhares de sequências não relacionadas. O primeiro passo neste tipo de experimento é fragmentar o DNA com endonucleases de restrição.

Essas enzimas reconhecem sequências de 4 a 6 nucleotídeos de comprimento. Uma vez que o DNA é fragmentado, os fragmentos são combinados com o DNA do vetor, e a população diversa de moléculas de DNA recombinante é submetida ao procedimento de clonagem de DNA. Como uma determinada célula bacteriana ocupa apenas um plasmídeo, todas as células de uma determinada colônia conterão cópias da mesma molécula de DNA recombinante.

Digite # 3. Clonagem de células:

A célula bacteriana é, ao mesmo tempo, a célula somática e a célula germinativa. Tendo selecionado uma única bactéria, pode-se desenvolver grandes populações de células, todas idênticas em morfologia e bioquímica. Nos tempos modernos, por meio de técnicas de cultura refinadas, a clonagem de células tornou-se possível, e as populações puras de células cresceram a partir de uma única célula isolada.

A menor unidade viável de planta que se pode atualmente imaginar como se reproduzindo, crescendo e se desenvolvendo em cultura é uma única célula. Vários trabalhadores estabeleceram método que permitiria o crescimento de órgãos e tecidos vegetais isolados in vitro, em cultura.

Praticamente todas as plantas são totipotentes, mas em animais apenas o ovo fertilizado e as células-tronco no blastocisto embrionário são totipotentes.

Digite # 4. Clonagem de planta:

Totipotência celular é a capacidade das células maduras de mostrar que, quando liberadas do corpo da planta, têm a capacidade de se reorganizar em novos indivíduos. Steward e seus colegas de trabalho mostraram esse fenômeno nas culturas da cenoura. Aqui, os pequenos pedaços de raiz de cenoura madura foram cultivados em um meio líquido suplementado com leite de coco em recipientes especiais.

Estas culturas foram geralmente agitadas, o que libertou todos os agrupamentos de células para o meio. Alguns deles desenvolveram-se em aglomerados de enraizamento. Quando estes foram transferidos para os tubos contendo um meio semissólido, deram origem a planta inteira que floresceu e deu sementes.

Digite # 5. Clonagem Organismal:

É característico da reprodução vegetativa que uma parte vegetativa, quando retirada da planta e colocada em condições adequadas, substitua as partes que faltam e produz um indivíduo completo. Tem sido possível cultivar vários tipos de órgãos de plantas em cultura estéril, incluindo raízes, ápices caulinares, folhas, partes florais e frutos.

Os requisitos de nutrientes para essa cultura de órgãos variam consideravelmente de espécie para espécie e de acordo com o tipo de órgão em questão, mas certos requisitos gerais podem ser reconhecidos.

As plantas superiores intactas são autotróficas, ou seja, são capazes de sintetizar todas as substâncias orgânicas necessárias para sua vida a partir da água, dióxido de carbono, oxigênio e nutrientes minerais. Mas, uma vez que a maioria das culturas estéreis são incapazes de realizar a fotossíntese, é claro que elas exigirão pelo menos uma fonte de carbono, geralmente fornecida na forma de um açúcar como sacarose ou glicose.

Além disso, as culturas estéreis requerem os mesmos nutrientes minerais que a planta intacta, incluindo ambos os macronutrientes (por exemplo, nitrogênio, fósforo, potássio e cálcio) e micronutrientes ou oligoelementos (por exemplo, Mg, Fe, Mn, Zn, etc.).

Além dos requisitos para uma fonte de carbono e nutrientes minerais, verifica-se que a maioria dos órgãos isolados também necessita de certas substâncias orgânicas especiais, como vitaminas, ácido nicotínico, etc.

Este tipo de reprodução é amplamente aplicado a plantas importantes para a horticultura. Os horticultores geralmente se referem a ele como propagação vegetativa. Sua vantagem prática é que um único indivíduo pode dar origem a um grande número de plantas que serão uniformes porque todas têm a mesma constituição genética, ou genótipo.

Esse grupo de plantas derivado de uma única planta por propagação vegetativa é chamado de clone. Hoje em dia, a clonagem orgânica é uma prática comum para o desenvolvimento dos clones & # 8217 de plantas hortícolas e florestais.

Muitas orquídeas produzem lindas flores em plantas clonadas. Os cientistas desenvolveram plantas agrícolas importantes do ponto de vista agronômico. A produção rápida de tais plantas pode ser alcançada usando células meristemáticas que se dividem ativamente, que ocorrem nos ápices da raiz e parte aérea da planta.

Para a agricultura, colheitas resistentes a doenças, secas, insetos-pragas e tolerantes a herbicidas foram produzidas com sucesso por manipulação de genes.

Alimentos geneticamente modificados (GMF), como arroz rico em vitamina A e sementes de leguminosas ricas em lisina, estão agora se tornando componentes populares dos alimentos básicos para humanos.


Produção de celulase alcalina por fungos isolados de uma floresta tropical intacta do Peru

Fungos produtores de celulase alcalina foram isolados de solos de uma floresta tropical intacta do Peru. O método da placa de diluição do solo foi usado para a enumeração e isolamento de fungos celulolíticos de crescimento rápido em um meio seletivo enriquecido. Onze das 50 colônias morfológicas diferentes foram finalmente selecionadas usando o ensaio de limpeza de placa com CMC como substrato em diferentes valores de pH. Todas as 11 cepas produziram celulases em cultura líquida com atividades em valores de pH alcalinos sem uma diminuição aparente delas, indicando que são verdadeiras produtoras de celulase alcalina. Aspergillus sp. LM-HP32, Penicillium sp. LM-HP33 e Penicillium sp. LM-HP37 foram os melhores produtores de celulase FP (& gt3 U mL −1) com produtividades específicas mais altas (& gt30 U g −1 h −1). Três cepas foram consideradas adequadas para o desenvolvimento de processos para a produção de celulase alcalina. Os solos das florestas tropicais amazônicas são boas fontes de fungos industriais com características particulares. Os resultados do presente estudo são de interesse comercial e biológico. As celulases alcalinas podem ser utilizadas no polimento e lavagem do processamento de denim da indústria têxtil.

1. Introdução

A biomassa vegetal é um dos recursos renováveis ​​mais abundantes para muitos propósitos e é composta principalmente por três tipos de polímeros: celulose, hemicelulose e lignina que estão fortemente interligados e quimicamente ligados por forças não covalentes e por ligações cruzadas covalentes. A estrutura polimérica molecular rígida e complexa da biomassa celulósica torna a lignocelulose altamente resistente ao ataque químico, solubilização e bioconversão. Os procedimentos de pré-tratamento físico ou químico que quebram as estruturas lignocelulósicas e, assim, aumentam a acessibilidade enzimática são necessários para a conversão da biomassa em vários bioprodutos possíveis [1, 2]. A hidrólise enzimática de materiais de celulose envolve ações sinérgicas de celulases, bem como xilanases e outras enzimas [3, 4]. As celulases são enzimas relativamente caras e uma redução significativa no custo será importante para seu uso comercial. A maioria das celulases industriais é produzida por fungos em fermentação submersa. Trichoderma reesei é a espécie fúngica mais importante usada para a produção de celulase, embora produza baixos níveis de β-glucosidase [5]. Algum Aspergillus espécies também são importantes produtoras de celulase com níveis mais elevados de β-glucosidase do que T. reesei [6].

O uso de enzimas para processamento de fibra de algodão em substituição a métodos químicos e físicos como o uso de álcalis e lavagem com pedras é relativamente recente e tem se mostrado mais eficaz, pois produz menos desgaste no tecido, é mais barato e tem redução impacto ambiental [7]. Na limpeza enzimática, o uso de pectinases, celulases e proteases tem sido avaliado e encontrado um efeito sinérgico entre elas. A mistura de celulases e pectinases é a mais eficaz [8]. A limpeza enzimática é realizada em pH neutro [7] e, embora existam pectinases que funcionam de forma ótima neste pH, a maioria das celulases comerciais tem atividade ótima em pH ácido. Portanto, o tratamento sequencial foi feito ajustando o pH da fibra em cada estágio [8]. As celulases foram recentemente encontradas com atividade ideal em pH neutro a alcalino, e estão gradualmente sendo incorporadas aos processos de tratamento de fibra, especialmente no polimento e lavagem do processamento de denim, porque o pH alcalino ou neutro reduz o contra-tingimento têxtil [9-11]. Além disso, foi observado que as celulases neutras são menos agressivas ao desgaste das fibras de algodão e são preferidas em relação às celulases ácidas [10]. Celulases neutras e alcalinas têm sido identificadas e isoladas de bactérias [9, 12, 13] e fungos [10, 14], e a prospecção de novos microrganismos é uma constante.

Conforme afirmado acima, a demanda por novas enzimas para desenvolver processos ambientalmente seguros na indústria têxtil aumentará devido aos requisitos regulamentares adotados na maioria dos países. A bioprospecção de novos microrganismos produtores de celulase alcalina em ambientes menos estudados pode ajudar nesse sentido. O Peru é um país diversificado e possui uma riqueza de diversidade microbiana muito ampla, embora pouco estudada e explorada. Portanto, neste trabalho, fungos do solo amazônico de uma floresta tropical peruana não perturbada foram isolados e testados quanto à sua capacidade de produzir celulases alcalinas que podem ser utilizadas no polimento e lavagem do processamento de denim na indústria têxtil.

2. Materiais e métodos

2.1. Local de Amostragem

Amostras de solo foram coletadas em cinco pontos de amostragem da floresta intacta de Macuya, perto de Pucallpa, Peru, localizada na latitude 8 ° 27′28,55′′S e longitude 74 ° 53′44,33′′W. A temperatura média do solo foi de 24,8 ° C e o pH das amostras de solo variou entre 6,5 e 7,0.

2.2. Amostras de solo

Em cada ponto de amostragem de 1 m 2, a serapilheira foi removida e aproximadamente 1 kg de solo foi cortado dos 20 cm superiores usando uma pequena pá e faca e dividido em cinco amostras de 200 g. Amostras sem restos de plantas e pedras foram colocadas em garrafas plásticas e resfriadas para transporte. O solo foi homogeneizado manualmente por meio de mistura completa. As amostras de solo foram então congeladas a -20 ° C. Todas as ferramentas e materiais usados ​​foram lavados e esterilizados [15].

2.3. Triagem Primária

Diluições em série das amostras experimentais de solo usando água destilada estéril foram usadas para o isolamento do fungo em meio de triagem de ágar. Este meio continha, por litro, 1 g de carboximetilcelulose (CMC), 0,5 g de xilose, 1 g de peptona, 1 g de extrato de levedura, 0,5 g de K2HPO4, 0,5 g MgSO4

7h2O, 5 mg de FeSO4 7h2O, 1,6 mg MnSO4 2h2O, 1,4 mg de ZnSO4 7h2O, 2 mg de CoCl2 6h2O e 15 g de ágar. O pH do meio foi ajustado para 5,5 com uma solução de NaOH 1 N ou HCl 1 N. Após a autoclavagem, oxitetraciclina foi adicionada a uma concentração final de 100 µg mL −1. As placas inoculadas foram incubadas a 28 ° C durante cinco dias. As colônias selecionadas foram isoladas e purificadas em placas de ágar batata dextrose (PDA) e conservadas em inclinações de PDA a 4 ° C.

2.4. Triagem Secundária

Um ensaio de limpeza de placa semiquantitativo foi desenvolvido com base no método anterior de Teather e Wood [16]. Para isso, o mesmo meio de triagem de ágar sem xilose e oxitetraciclina foi dispensado em microplacas de ELISA de fundo plano Labsystem de 96 poços estéreis (LabSource, Arbor, IL, EUA), cada poço contendo 150 µMeio de triagem de ágar L. Pequenas quantidades de esporos de fungos foram semeados no topo de cada poço e incubados a 28 ° C por 72 h. Quatro repetições foram usadas para cada isolado de fungo. O conteúdo de cada poço (após verificação do crescimento do microrganismo) foi removido assepticamente com um punção e colocado em placas de vidro especialmente projetadas (300 cm 2) contendo o substrato enzimático meio sólido [17].

O meio sólido do substrato enzimático continha, por litro de tampão, 5 g de CMC e 15 g de ágar. Para pH 4,8, 7,4, 8,4 e 9,4, foram usados ​​citrato 0,05 mol L-1, solução salina tampão de fosfato, barbital-HCl e tampão glicina-NaOH, respectivamente. A atividade da enzima foi avaliada após 4 h de incubação a 50 ° C em uma câmara úmida, inundando as placas com uma solução aquosa de 1 mg mL -1 de vermelho do Congo por 15 min. A solução de vermelho do Congo foi então despejada e as placas foram posteriormente tratadas por inundação com NaCl 1 mol L -1 por 15 min. O diâmetro das zonas claras foi medido e considerado uma indicação da atividade da celulase.

2,5. Produção de celulase em cultura líquida

Os esporos das cepas selecionadas foram lavados de placas de PDA de 5 dias com 10 mL de solução Tween 80 0,1% (v / v), e esta suspensão (1 × 10 6 esporos por mL) foi usada como inóculo. O meio de produção de celulase para o crescimento e produção de celulase tinha a seguinte composição: KH2PO4 2 g L -1 (NH4)2TÃO4 1,4 g L -1 ureia 0,3 g L -1 CaCl2 2h2O 0,3 g L -1 MgSO4 7h2O 0,3 g L −1 peptona 1 g L −1 Tween 80 0,2% (v / v) FeSO4 7h2O 5 mg L -1 MnSO4 2h2O 1,6 mg L -1 ZnSO4 7h2O 1,4 mg L -1 CoCl2 6h2O 2 mg L −1 e lactose 10 g L −1 ou celulose microcristalina de 20 mícrons 10 g L −1. O pH do meio foi ajustado para 5,5 com uma solução de NaOH 1 N ou HCl 1 N. Cada frasco de 250 mL contendo 70 mL de meio de produção foi inoculado com 3% (v / v) da suspensão de esporos acima. Todos os frascos inoculados foram incubados a 28 ° C em um banho agitador a 175 rev.min -1 por 72 h. Três réplicas foram feitas em todos os casos. As culturas foram centrifugadas a 3.000 rev.min -1 por 20 min. Sólidos foram usados ​​para determinação de biomassa, e os sobrenadantes foram usados ​​para atividade enzimática e determinações de proteína solúvel.

2.6. Determinação de biomassa

Para culturas de lactose, a biomassa foi determinada medindo o peso celular seco. Para as culturas de celulose, a biomassa foi determinada indiretamente pela medição da proteína intracelular contida da seguinte forma: os sólidos da cultura foram triturados em um almofariz com nitrogênio líquido. A biomassa em pó foi suavemente suspensa em 5 mL de tampão de extração (0,01 mol L -1 Tris HCL pH8 0,001 mol L -1 EDTA, 2% (p / v) polivinilpolipirrolidona, agitada em vórtice e centrifugada a 8000 rpm por 30 min a 4 ° C em seguida, o sobrenadante foi coletado [18]. Os sobrenadantes foram precipitados com metanol-clorofórmio seguindo o procedimento de Wessel e Fluegge [19]. Amostras de proteínas foram sucessivamente misturadas com metanol (4 volumes), clorofórmio (1 volume) e água destilada (3 volumes) e centrifugados a 14.000 rev.min -1 a 4 ° C por 2 min. A fase superior foi cuidadosamente removida e 3 volumes de metanol foram adicionados seguidos de centrifugação a 14.000 rev.min -1 por 2 min. O sobrenadante foi descartado. O pellet foi seco ao ar em temperatura ambiente e então ressuspenso em tampão fosfato salino.A concentração de proteína foi estimada usando o procedimento de Lowry et al. [20].

2.7. Atividade de celulase

A celulase, como atividade de papel de filtro (FPA), foi determinada de acordo com 96 µO método baseado em microplaca L (MPB) descrito por Xiao et al. [21] com algumas modificações. Anteriormente, o método FPA padrão [22] foi testado para avaliar a sensibilidade e reprodutibilidade do método MPB. As análises estatísticas mostraram que as atividades de celulase determinadas com o método MPB não eram significativamente diferentes das atividades medidas com o FPA padrão (resultados não mostrados).

O ensaio MPB foi realizado da seguinte forma: a 32 µUma alíquota de L da amostra de enzima de cultura diluída foi adicionada em placas de PCR UltraFlux (LabSource, Arbor, IL, EUA) poços contendo um disco de papel de filtro dobrado de 7 mm de diâmetro (Whatman N ° 1) e 64 µL de 0,05 mol L -1 de tampão correspondente (pH 4,8, 7,4, 8,4 ou 9,4). Após incubação a 50 ° C por 60 min, 100 µL de reagente DNS foi adicionado a cada poço da placa e incubado a 95 ° C por 5 min. Após o desenvolvimento da cor, um 160 µL alíquota de cada amostra foi transferida para os poços de microplacas de ELISA de fundo plano Labsystem de 96 poços (LabSource, Arbor, IL, EUA) contendo 85 µL de H destilado2O e a absorvância a 540 nm foi medida num leitor de placas Rayto RT-2100C (Rayto Life and Analytical Sciences, Nanshan, Shenzhen, China). De acordo com as recomendações da IUPAC [22], um branco de enzima (32 µL alíquota de enzima diluída e 64 µTampão L) e branco do substrato (96 µTampão L e disco de papel de filtro dobrado de 7 mm) foram incluídos em cada ensaio. Uma unidade de enzima (U) é definida como a quantidade de enzima que libera 1 µproduto mol por minuto de equivalentes de glicose.

2.8. Determinação de proteína solúvel

Os sobrenadantes da cultura foram precipitados com dois volumes de ácido tricloroacético a 10% (p / v), agitados em vórtex, mantidos durante a noite a 4 ° C e centrifugados a 6.000 rev.min -1 a 4 ° C por 25 min. Os peletes foram ressuspensos em solução salina tampão de fosfato e a concentração de proteína foi estimada por Lowry et al. [20] procedimento.

2.9. Estatisticas

Os dados foram analisados ​​pelo Statgraphics Centurion XVI (Statpoint Technologies, Inc., Warrenton, VA, EUA). A análise de variância (ANOVA) pelo desenho estatístico categórico multifatorial foi conduzida na maioria dos casos. Outras análises estatísticas estão indicadas no texto, e também foram processadas com o mesmo software.

3. Resultados

3.1. Isolamento de Fungos de Amostras de Solo

Cinco amostras de solo de Macuya, uma floresta tropical intacta (Pucallpa, Peru), foram usadas para isolar fungos produtores de celulase alcalina usando um meio de triagem contendo CMC e xilose como fontes de carbono e como indutores de celulase. Todas as amostras de solo mostram valores semelhantes de propágulos fúngicos capazes de usar as fontes de carbono (4,5–7 × 10 4 UFC g –1 solo seco Tabela 1). Com base nas diferenças na morfologia da colônia, 50 colônias foram isoladas, purificadas e submetidas a uma triagem secundária para detectar a atividade da celulase em diferentes valores de pH. Possivelmente devido ao desenho do meio de isolamento e curto tempo de incubação, uma predominância dos gêneros. Aspergillus e Penicillium entre os 50 isolados fúngicos foi encontrado.

3.2. Triagem da atividade da celulase

A atividade celulolítica dos 50 isolados fúngicos foi testada semiquantitativamente usando o ensaio de limpeza de placa com CMC como substrato em diferentes valores de pH (ver Seção 2). Muitos isolados de fungos mostraram atividade celulolítica mesmo em pH 9,4. No entanto, apenas aqueles isolados que deram zonas claras com diâmetros acima de 1 mm em todos os valores de pH alcalino foram selecionados para análise posterior. Portanto, 11 cepas pertencentes aos Aspergilli e Penicilli passaram na triagem e foram selecionadas para a produção de celulase em cultura líquida (Tabela 2). Deformação Aspergillus sp. LM-HP32, Aspergillus sp. LM-HP34, Penicillium sp. LM-HP37, e Penicillium sp. LM-HP14 deu as zonas de compensação mais altas em todos os valores de pH.


OBJETIVOS DE DESEMPENHO PARA LAB 3

Depois de concluir este laboratório, o aluno será capaz de concluir os seguintes objetivos:

1. Dada uma mistura de uma bactéria Gram-positiva e uma Gram-negativa e placas de ágar Columbia CNA, MacConkey e Trypticase Soy, descreva as etapas que você executaria para eventualmente obter culturas puras de cada organismo.

2. Defina: meio seletivo, meio diferencial, meio de enriquecimento e meio seletivo-diferencial de combinação.

3. Declare a utilidade do ágar Columbia CNA e do ágar MacConkey.

4. Descreva como cada um dos itens a seguir apareceria quando cultivado em ágar MacConkey:

1. Usando o método de isolamento em placa listrada, obtenha colônias isoladas de uma mistura de microorganismos.

2. Retire as colônias isoladas de microorganismos crescendo em uma placa estriada e transfira-as assepticamente para um meio estéril para obter culturas puras.

1. Quando for dada uma placa de ágar Columbia CNA ou ágar MacConkey mostrando colônias discretas, interprete corretamente os resultados.


Agradecemos o apoio experimental de Hiroko Kato e Takamitsu Soma na Universidade de Tsukuba. Este trabalho é apoiado pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS). KAKENHI concede 18K05545 e 18K15143, uma bolsa do Instituto de Fermentação de Osaka (IFO), Bolsa do Instituto Noda para Pesquisa Científica e Agência de Ciência e Tecnologia do Japão (JST) ERATO outorga número JPMJER1502.

Contribuições de autores

G Abeysinghe: análise formal, validação, investigação e visualização.

M Kuchira: análise formal, validação, investigação e visualização.

G Kudo: análise formal, validação, investigação e visualização.

S Masuo: análise formal, validação, investigação e metodologia.

A Ninomiya: investigação e metodologia.

K Takahashi: software e análise formal.

AS Utada: curadoria de dados, software e análise formal.

D Hagiwara: curadoria de dados e análise formal.

N Nomura: conceituação, recursos, aquisição de financiamento e administração do projeto.

N Takaya: conceituação, recursos, administração de projetos e redação - revisão e edição.

N Obana: conceituação, recursos, curadoria de dados, análise formal, aquisição de financiamento, validação, investigação, visualização, metodologia, administração de projeto e redação - rascunho original, revisão e edição.

N Takeshita: conceituação, recursos, curadoria de dados, análise formal, supervisão, aquisição de financiamento, validação, investigação, visualização, metodologia, administração de projeto e redação - rascunho original, revisão e edição.


O que é esse líquido vermelho produzido por uma colônia de fungos? - Biologia

Produzido por Jim Deacon
Instituto de Biologia Celular e Molecular, Universidade de Edimburgo


Os líquenes foram descritos como "organismos duplos" porque são associações simbióticas entre dois (ou às vezes mais) tipos de microorganismos inteiramente diferentes -

  • um fungo (denominado o mycobiont)
  • uma alga verde ou uma cianobactéria (chamada de fotobionte).

Existem muitos exemplos de simbiose na natureza, mas os líquenes são únicos porque têm aparência e comportamento bastante diferente de seus organismos componentes. Assim, os líquenes são considerados organismos por si próprios e recebem nomes genéricos e de espécie. No entanto, para fins taxonômicos, os nomes são, na verdade, nomes de fungos: os líquenes são considerados um grupo especial de fungos - os fungos liquenizados.

Existem cerca de 13.500 a 17.000 espécies de líquenes, que se estendem dos trópicos às regiões polares. Alguns deles crescem na casca de árvores temperadas ou como epífitas nas folhas de árvores em florestas tropicais. Others occupy some of the most inhospitable environments on earth, growing on cooled lava flows and bare rock surfaces, where they help in the process of soil formation, and on desert sands where they help to stabilise the surface and enrich it with nutrients (see Cyanobacteria ). Some other types of lichen grow abundantly on tundra soils, providing a vital winter food source for animals (including reindeer and caribou) in arctic and sub-arctic regions.Yet other lichens grow on or in the perennial leaves of some economically important tropical crop plants such as coffee, cacao and rubber, where they are regarded as parasites.

All these features make lichens interesting and significant in environmental terms. But lichens also pose challenging scientific problems - how do two or more microorganisms interact at the cellular, genetical and biochemical levels to produce a unique, hybrid organism?

The "body" of a lichen is termed the thallus, and its general shape enables us to group lichens into four broad categories.

  • Foliose lichens have a flat, leaf-like structure (Figures A-B below).
  • Fruticose lichens have an erect or pendulous, bushy structure (Figure C, below).
  • Squamulose lichens have a thallus consisting of minute, scale-like squamules (Figures D-E below)
  • Crustose lichens produce a flat crust on or beneath rock or tree surfaces (Figures F-G, below).

Foliose lichens. (A) Parmelia physodes, growing on the twigs of a shrub. The lobes, about 1 cm diameter, are silvery-grey above, black below. (B) Peltigera polydactyla, growing on soil. The lobes are semi-erect, 1-2 cm diameter, and have brown fungal fruiting bodies (ascocarps) at their tips (see later). In this case the lichen thallus is grey because it has dried, but it rapidly becomes bluish-green when rewetted.

Fruticose and squamulose lichens. (C) Usnea comosa, growing on a wooden post. This lichen has a branched, filamentous thallus which hangs down from the point of attachment. (D) Cladonia pyxidata, growing on peaty soil. This lichen has a scale-like squamulose structure (arrowhead) but also produces erect stalked cups termed podetia. (E) Cladonia coccifera, similar to C. pyxidata but the rims of the podetia bear many conspicuous red ascocarps.

Crustose lichens. (F) A patchwork of lichens on a rock surface, including several colonies of the green-coloured Rhizocarpon geographicum and the white Lecidia species. (G) Lecanora muralis (also known as Squamaria muralis) growing on a wall. The thallus has a pale green colour with small lobes at the margin but the centre is crustaceous. Also present are many pale brown ascocarps.

A few lichen fungi (approximately 20) are members of the fungal group Basidiomycota, but the vast majority are members of the Ascomycota (ascus-forming fungi) and they often produce conspicuous fungal fruiting bodies (ascocarps) - usually disk-shaped structures termed apothecia (e.g. Figures E, G). Almost half of the recorded fungi in the world are ascomycota, and nearly half of these are found only in lichens. Although their spores are dispersed from the fruiting bodies, these fungi do not seem to have an independent role in nature because they are extremely slow-growing and generally lack the enzyme systems for degrading complex polymers.

In contrast to the many thousands of lichen fungi, there are only about 100 photosynthetic partners. The most common are single-celled green algae of the genus Trebouxia (Figure H), which are found in many lichens of temperate and arctic/alpine regions, including all species of the common lichen genus Cladonia (see Figures D, E). Trebouxia species seldom grow as free-living cells in nature instead they seem to be specialised lichen symbionts. Another common photobiont is the filamentous green algal genus Trentepohlia, especially in Mediterranean and tropical regions. This and other algal genera of the tropical lichens can be found growing independently in nature. About 10% of lichens have cyanobacteria (e.g. Nostoc) as the main or only photosynthetic partner. For example, this is true of many Peltigera species (Figure B). However, some lichens that contain green algae can also have cyanobacteria in special wart-like structures on the lichen surface. These structures are termed cephalodia. They are found in about 3-4% of lichen species and their role is probably to exploit the nitrogen-fixing ability of cyanobacteria.

The fact that lichens can be formed by more than one type of fungus and more than one type of photosynthetic partner shows us that the lichen symbiosis must have evolved independently on several occasions.

Lichens vary in their degree of structural organisation. At one extreme are some simple, almost casual associations between fungal hyphae and photosynthetic cells, in which there is little structural modification. These simple associations may be quite common but are inconspicuous. The more conspicuous lichens have a well-defined structure, often with distinct zonation of the partners, as shown in Figures I-K, below. Usually, the photosynthetic cells are found in a defined band where they are closely associated with fungal hyphae, for nutrient exchange. Above this band is a cortex consisting of tightly packed fungal cells with a gelatinous matrix between them. Within and below the photosynthetic zone is a medulla of loosely packed hyphae. Often there is a thinner, lower cortex, and several types of lichen attach themselves to a surface by root-like structures termed rhizinae or rhizines (see Fig. K ).

Figure I. Structure of the lichen Peltigera polydactyla. In cross section (left) the lichen thallus is seen to consist of an upper cortex (c) of tightly packed fungal cells resembling a tissue. This is seen at higher magnification in the centre image. Beneath the cortex is a medulla (m) of more typical fungal hyphae (seen at higher magnification in the right-hand image). The photosynthetic cells (a cyanobacterium in this case) are seen as a green-coloured band beneath the cortex. The lichen also has a lower cortex, beneath the medulla, but it is not seen in this section.

Note the air pockets in the upper part of the medulla, close to the photosynthetic zone (grey-black regions in the left-hand image). They indicate that the fungal hyphae in this region are hydrophobic. Note also the extremely thick walls of hyphae in the medulla (the right-hand image). These thick-walled, hydrophobic hyphae contribute to drought-tolerance.

Figures J, K. Structure of the common foliose lichen Xanthoria parietina, which grows on many types of surface, including concrete, roofs of buildings, and rocks subjected to sea spray. The lichen thallus (J) has foliose lobes at the margin (see top of Figure J) but much of the surface is covered with bright orange apothecia about 3-5 mm diameter (arrowheads). The orange colour of this lichen is due to production of the pigment parietin at the lichen surface.

(K) Cross section of one of the marginal lobes, viewed by phase-contrast microscopy. The photosynthetic zone (p) is seen as a distinct band of green algal cells. Above this band is the cortex (c) consisting of densely packed fungal cells . The surface of the cortex is pigmented because the cell walls are impregnated with parietin. The lower part of the thallus consists of a medulla (m) with conspicuous air pockets (uma), and a thin lower cortex (lc) Like many foliose lichens, Xanthoria produces rhizinae (r) that penetrate into crevices and help to anchor the lichen to a surface. The pigmentation near the tip of the rhizina is due to production of a purple-red pigment by the hyphal cells in this region.

The mycobiont has two principal roles in the lichen symbiosis:

    to protect the photobiont from exposure to intense sunlight and desiccation

to absorb mineral nutrients from the underlying surface or from minute traces of atmospheric contaminants.

The photobiont also has two roles:

    to synthesise organic nutrients from carbon dioxide

in the case of cyanobacteria, to produce ammonium (and then organic nitrogen compounds) from N2 gas, by nitrogen fixation. In some ecosystems such as desert soils, tundra heaths, and Douglas-fir forests of the Pacific Northwest of the USA, lichens can provide the major input of nitrogen which supports other forms of life (see Further reading ).

Thus, through the lichen partnership, the photobionts are protected and able to grow in conditions in which they could not grow alone they also benefit from the highly efficient uptake of mineral nutrients by the lichen fungi. The fungi, in turn, obtain sugars and in some cases organic nitrogen from the photosynthetic partner, enabling them to grow in environments deficient in organic nutrients.

Lichens are remarkable for their ability to withstand prolonged drying and to resume activity rapidly after rewetting. Most lichens that contain green algae can recover from drought by absorbing water from humid air and then begin to photosynthesise. However, the lichens that contain cyanobacteria can only resume photosynthesis after absorbing free (liquid) water.

The drought-tolerance of lichens is likely to be conferred by a water-repellent (hydrophobic) coating on the hyphal walls of the medulla. Small peptides that are rich in sulphur-containing amino acids have been found on the hyphal walls of many free-living fungi. They are termed hydrophobins and they probably also occur in lichen fungi. The presence of these compounds would ensure that the medulla around the photosynthetic cells does not become waterlogged, allowing the diffusion of gaseous carbon dioxide for photosynthesis. Of interest, the hydrophobic materials seem to be produced only by the fungus, because cells of Trebouxia, which have a naturally hyrophilic surface, become covered with a hydrophobic material when grown in the presence of a lichen fungus.

The rewetting of lichens is thought to start by water absorption in the gelatinous matrix of the cortex, after which water might move through the medulla in the wall space of the fungal hyphae or perhaps by capillarity in regions where the hyphae have a hydrophilic surface.

Most attention to nutrient exchange in lichens has centred on the mechanisms of carbon flow from the photosynthetic partner to the fungus, because radioactive labelling studies have shown that both green algae and cyanobacteria can release up to 90% of their photosynthate to the fungal partner.

In lichens with Trebouxia, and presumably also with other green algae, the fungal hyphae can produce short branches that penetrate through the algal wall to serve as nutrient-absorbing haustoria. This is similar to the behaviour of biotrophic plant pathogens (see Biotrophic Plant Pathogens ). In contrast, in lichens with cyanobacteria (e.g. Peltigera) there is no penetration of the photosynthetic cells. Instead, the fungal hyphae of the central region (usually hydrophobic) produce thin-walled protrusions that penetrate the hydrophilic gelatinous sheaths that surround the cyanobacterial cells.

The major soluble carbohydrates in lichens are sugar alcohols (polyols). In the fungal partner these compounds are present as mannitol and, to a lesser degree, arabitol. In these respects lichen fungi are no different from other fungi, which characteristically have sugar alcohols as the main soluble carbohydrates. The green algae produce sugar alcohols as their main photosynthetic products - e.g. the sugar alcohol ribitol is produced by Trebouxia. However, the cyanobacteria seem to release glucose to the fungal partner. This seems to occur passively through a glucose carrier in the cell membrane, after enzymic degradation of an intracellular glucan (glucose polymer) in the cyanobacteria.

Of interest, the maximum rates of nutrient release from the photosynthetic partner occur in optimal moisture conditions, whereas the photosynthetic cells retain most of their carbohydrate in conditions of water stress. So, it has been suggested that cycles of wetting and drying may be advantageous in maintaining a lichen symbiosis, because both partners could gain sufficient carbohydrate at different stages of this cycle.

Figures L, M. The fungal sporing stage of Xanthoria parietina. (eu) Section through part of a thallus in the region of a disk-shaped apothecium. The apothecium consists of many club-shaped asci (one ascus is marked by an arrowhead) with sterile "packing" hyphae (paraphyses) between the asci. The tips of the paraphyses are orange-pigmented (top of the section). (M) Part of the apothecium crushed to show the asci (one marked by an arrowhead), each containing 8 oval ascospores, and the orange-tipped paraphyses.

Figures N-P. The fungal sporing stage of Peltigera polydactyla. ( N ) Apothecia are seen as brown, shield-like structures at the tips of the thallus (this Figure is a close-up of Figure B). ( O ) Part of a crushed apothecium showing asci (one marked by arrowhead) and brown-tipped paraphyses. ( P ) Ascospores released by crushing an apothecium. In this lichen the ascospores are needle-shaped, unlike the oval ascospores of Xanthoria.

Most lichens are dispersed by vegetative propagation. The dry lichen thallus is brittle, so fragments can be broken off easily and transported by wind or by animals. In addition, several lichens produce stalk-like or pillar-shaped structures termed isidia, which are easily broken off and dispersed. All these fragments can resume growth in a new environment after they are rewetted.

A further means of propagation is by the production of specialised dispersal units termed soredia (Figures Q, R). These consist of a few photosynthetic cells enveloped in fungal hyphae, and they are formed as a powdery mass near the centre of a lichen thallus or (e.g. Parmelia physodes, Figure A) at the tips of some of the thallus lobes. Soredia are readily dispersed by wind.

In addition to these dispersal methods, many lichens produce apothecia or other fungal fruiting structures, to disperse the spores of the fungal partner (Figures eu-P) The spores in these cases (ascospores) are formed in asci as the result of sexual reproduction (see The Fungal Web ), although a few lichen fungi produce asexual dispersal spores. When these spores germinate they must contact the cells of a photosynthetic partner to establish a new lichen thallus. This process of "reassembly" of a lichen can be demonstrated in experimental conditions, and evidence suggests that it also occurs in nature. But its frequency in natural conditions may vary substantially between different types of lichen. For example, the separate dispersal of fungal and algal (Trebouxia) spores might be the major means of dispersal for the common lichen Xanthoria parietina (see Figure J) and for Buellia species because these lichens do not seem to have soredia. In these cases there is immunological evidence to suggest that lichens are synthesised in nature from free-living Trebouxia and fungal spores on rock surfaces (Mukhtar et al., 1994).

Figure Q. Physcia grisea, a common lichen that grows on walls, trees and fence posts in city environments. The colony margins consist of narrow lobes (about 2-3 mm) but the centre of each thallus has a darker, greener appearance and is more granular, because it is covered with soredia.

Figure R. Seven soredia seen at high magnification. Each is about 0.1 mm diameter and consists of a cluster of algal cells in a meshwork of hyphae.

Lichens are amongst the slowest-growing organisms, but their tolerance of environmental extremes enables them to colonise habitats where few other macroscopic organisms can grow. They grow where neither the fungal partner nor the photosynthetic partner could survive alone, because they benefit from their unique symbiotic association.

However, most lichens are highly intolerant of atmospheric pollution, particularly sulphur dioxide, so they are found mainly in rural environments rather than cities. Only a few species, such as Physcia grisea e Xanthoria parietina, are found commonly in towns, and even they grow poorly in towns compared with in non-polluted environments. Part of the reason for this intolerance is the extreme efficiency of lichen fungi in accumulating nutrients from trace levels in the atmosphere. An extreme demonstration of this is the ability of lichens to accumulate radioactive isotopes from the environment. Following the Chernobyl disaster, the lichens (mainly Cladonia rangiferina, the "reindeer moss") of northern Scandinavia accumulated so much radioactivity that reindeer feeding on them were considered dangerous for human consumption.

(1) Books, journals and major reference sources

Hale ME (1983) The Biology of Lichens. Edward Arnold, London [The best general book on lichen biology]

Nash TH (1996) Lichen Biology. Cambridge University Press, Cambridge. [An update of Hale's book, with chapters by different authors, but highly detailed - not recommended for beginners]

The main journal for all aspects of lichens is The Lichenologist, published by Academic Press.

Many detailed aspects of lichen biology can be found in the three volumes of CRC Handbook of Lichenology (ed. M. Galun), 1988. CRC Press, Boca Raton, Fl, USA.

Access many lichen sites through the home page of the International Association of Lichenologists ( not on this server )

See also: Lichen photos ( not on this server )

And a "lighter" but useful site: Fun with Lichens ( not on this server )

(3) Selected references for specific topics:

Synthesis of lichens in laboratory conditions, and in nature:

Stocker-W rg tter E & Turk R (1991) Artificial resynthesis of thalli of the cyanobacterial lichen Peltigera praetextata under laboratory conditions. Lichenologist 23, 127-138.

Mukhtar A, Garty J & Galun M (1994) Does the lichen alga Trebouxia occur free-living in nature: further immunological evidence. Symbiosis 17, 247-253.

Movement of radionuclides from lichens through the animal food chain:

Thomas PA, Sheard JW & Swanson S (1994). Health Physics 66, 666-677.

Contribution of lichens to nitrogen-enrichment of various ecosystems:

Pike LH (1978) Bryologist 81, 247-257.
Crittenden PD & Kershaw KL (1978) Bryologist 81, 258-267.
Eldridge DJ & Greene RSB (1994) Australian Journal of Soil Research 32, 389-415.
Nadkarni NM (1994) American Zoologist 34, 70-78.

Smith DC & Douglas AE (1987) The Biology of Symbiosis. Edward Arnold, London.

Richardson DHS (1993). The physiology of drying and rewetting in lichens. pp. 275-296 in Stress Tolerance of Fungi (Ed. DH Jennings) Academic Press, London.

Lichen interactions and community development:

Lawrey JD (1991) Biotic interactions in lichen community development a review. Lichenologist 23, 205-214.


Resultados

Isolation and chemical characterization of SRF secondary metabolites

The filtered culture broth of SRF (3 l) was extracted with EtOAc to afford 95 mg of crude extract that was separated by flash chromatography. Six fractions were collected, and among these, fraction 2 (10·5 mg), fraction 3 (9·3 mg) and fraction 4 (6·6 mg) contained the bulk of material recovered. Methanolic extracts of the mycelium and the other collected fractions showed no biological activity and were mainly constituted by fatty acids (GC-MS data not shown).

One of the less polar fractions (fraction 2) gave 10·5 mg of a metabolite that was identified as veratryl alcohol (VA –Fig. 1a). The structure of VA was deduced from 1 H NMR and 13 C NMR/ Distortionless Enhancement by Polarization Transfer (DEPT) spectral data. The MS analysis indicated a molecular ion [M] + at m/z 168, corresponding to the molecular formula C9H12O3. The isolated compound showed the same spectroscopic properties to those reported for VA ( Lundquist and Kirk 1978 ): 1 H NMR 400 MHz, CDCl3: 3·88 (3 H, s, OCH3), 3·89 (3 H, s, OCH3), 4·62 (2 H, s, CH2), 6·84 (1 H, d, J = 8 Hz ortho coupling), 6·90 (1 H, dd, J = 1·6 Hz, meta coupling, and 8 Hz, ortho coupling), 6·93 (1 H, d, J = 1·6 Hz, meta coupling).

Chemical structures of secondary metabolites isolated from the sterile red fungus. (a) veratryl alcohol (VA) (b) 4-hydroxymethyl-quinoline.

Fractions 3 and 4 were further purified by preparative TLC to afford 4-hydroxymethyl-quinoline (1·5 mg) (OQ –Fig. 1b). The mass spectrum from GC-MS analysis showed a [M] + peak at m/z 157 and a high level of similarity with that of 4-quinolinecarbaldehyde. These data were not in agreement with those obtained by NMR analysis, particularly for the presence of a singlet of two protons at δ 5·18 and a –CH2– (DEPT) at δ 61·55 that can be assigned to a hydroxymethyl group. A one-proton doublet at δ 7·55 (J = 4·5 Hz) showed coupling to another at δ 8·91, indicative of a 4-hydroxymethylquinoline. To resolve this incongruence, a sample of the metabolite was treated with the silylating agent BSTFA. The mass spectrum of the trimethylsilyl derivative indicated that the original compound had the molecular formula C10H9NO. The peak at m/z 157 arose from the corresponding 4-quinolinecarbaldehyde, an artefact of the GC-MS analysis.

Antifungal and plant growth promotion activity of SRF secondary metabolites

The evaluation of antifungal activity of VA revealed weak inhibition against R. solani (about 10% at 1 μg: Fig. 2), while up to 45 and 35% inhibitions were registered using 1 μg of the metabolite against P. irregulare e S. sclerotiorum, respectively. However, the increase in the metabolite concentration did not affect significantly the levels of inhibition (Fig. 2).

Antibiotic activity of veratryl alcohol against (◆) Sclerotinia sclerotiorum, () Pythium irregulare and (▪) Rhizoctonia solani. Concentrations ranging from 0·1 to 100 μg per plug. Bars indicate standard deviation.

OQ inhibited the growth of P. irregulare (50%), S. sclerotiorum (35%) and R. solani (20%) at 100 μg (Fig. 3). Lower concentrations significantly reduce OQ activity against all the tested pathogens (Fig. 3).

Antibiotic activity of hydroxymethyl-quinoline against (◆) Sclerotinia sclerotiorum, () Pythium irregulare and (▪) Rhizoctonia solani. Concentrations ranging from 0·1 to 100 μg per plug. Bars indicate standard deviation.

The effects of VA and OQ on plant growth promotion were evaluated by measuring the length of the canola seedlings whose seeds were previously coated with different amounts of the SRF metabolites. The growth of canola seedlings was affected by treatments with VA and OQ. The length of canola seedlings increased when seeds were treated with 0·01 ng of VA (Table 1) or with 0·1–1 μg of OQ (Table 2). On the other hand, VA and OQ did not significantly promote root growth in comparison to control (Tables 1 and 2). Interestingly, a reduction in root length by about 30% was observed when seeds were coated with 1 μg VA (Table 1).

Stem length (cm) SD Root length (cm) SD
Control 1·171a 0·045 6·425a 1·639
1 μg 1·114a 0·136 4·600b 0·545
0·1 μg 1·200a 0·187 6·100a 0·954
0·01 μg 1·100a 0·087 6·689a 1·679
1 ng 1·267a 0·141 7·975a 1·444
0·1 ng 1·240a 0·136 7·629a 1·163
0·01 ng 1·675b 0·259 7·500a 2·080
  • Values are means of ten replicates. Values with the same letter do not differ significantly (P < 0·05).
  • SD, ± standard deviation.
Stem length (cm) SD Root length (cm) SD
Control 1·200a 0·156 6·425a 1·639
1 μg 1·620b 0·160 7·657a 2·265
0·1 μg 1·738b 0·264 6·500a 1·133
0·01 μg 1·289a 0·137 6·575a 0·807
1 ng 1·210a 0·170 6·600a 1·439
0·1 ng 1·257a 0·238 7·486a 1·333
0·01 ng 1·250a 0·087 7·800a 0·998
  • Values are means of ten replicates. Values with the same letter do not differ significantly (P < 0·05).
  • SD, ± standard deviation.

Automation When Working with Bacterial Colonies

Like many laboratory research aspects, the growing and picking of bacterial colonies can be automated with robotics and automation software.

In fact, labs can use automation throughout the workflow, from preparing the bacterial samples for plating to isolating the molecules or proteins of choice from the picked colonies.

A colony picking robot can accurately select the required bacterial colony by using advanced imaging hardware and algorithms. It can determine how many cells are in a colony, on the average from colony size, automatically identify the desired colonies according to customizable parameters such as radius, color, or separation and pick the colonies that fit the preset parameters. It can also automatically record and store information on the selected colonies ensuring you have complete documentation.

Working with bacterial colonies is an essential part of any biological lab as they are often the main component used in research and within the production of proteins and enzymes. Therefore, accurately identifying colony morphology and picking the right colony can significantly improve your lab results.


Assista o vídeo: Płachetka Zwyczajna Kołpakowata - koszenie grzybów w ilości kosmicznej! (Dezembro 2022).