Em formação

7.5: Endoreplicação - Biologia

7.5: Endoreplicação - Biologia


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

A endoreplicação é a replicação do DNA durante a fase S do ciclo celular sem a conclusão subsequente da mitose e / ou citocinese. A endoreplicação ocorre em certos tipos de células em animais e plantas. Existem várias variações:

  • replicação de DNA com conclusão da mitose, mas sem citocinese.
  • replicação repetida do DNA sem formar novos núcleos na telófase. Isso pode resultar em:
    1. Poliploidia: os cromossomos replicados mantêm sua identidade individual.
    2. Polyteny: os cromossomos replicados permanecem em alinhamento preciso formando cromossomos "gigantes".
    3. várias condições intermediárias entre 1 e 2

A fotomicrografia mostra os cromossomos politênicos em uma célula da glândula salivar de um Drosophila melanogaster larva. Esses cromossomos também são encontrados em outras células grandes e ativas.

  • Cada um dos 4 pares de cromossomos de Drosophila passou por 10 rodadas de replicação de DNA.
  • Os homólogos maternos e paternos - assim como todas as suas duplicatas - estão alinhados em registro exato um com o outro.
  • Portanto, cada cromossomo consiste em um cabo contendo 2.048 fitas idênticas de DNA.
  • Eles são tão grandes que podem ser vistos durante a interfase; mesmo com um microscópio de luz de baixa potência.

Função de politenia

A resposta provável: amplificação do gene. Ter várias cópias de genes permite um alto nível de expressão gênica; isto é, transcrição e tradução abundantes para produzir os produtos gênicos. Isso explicaria a politenicidade sendo associada a células grandes e metabolicamente ativas (como as glândulas salivares). Os cromossomos politênicos são subdivididos em cerca de 5.000 bandas densas separadas por interbandas de luz. As bandas são subdivididas em:

  • bandas escuras de heterocromatina onde o DNA está fortemente compactado e há pouca transcrição gênica;
  • bandas cinzentas de eucromatina onde o DNA é compactado mais fracamente e há transcrição de gene ativa.

Estas oito fotomicrografias () mostram as mudanças no padrão de sopro dos segmentos equivalentes do cromossomo 3 em Drosophila melanogaster ao longo de cerca de 20 horas de desenvolvimento normal.

Observe que durante esse período, quando as larvas estavam se preparando para pupar, certos puffs se formaram, regrediram e se formaram novamente. No entanto, a ordem em que eram feitas era diferente. Por exemplo, na larva, a banda 62E torna-se ativa antes de 63E (c, d e e), mas quando a pupação começa, o inverso é verdadeiro (g, h).

Em geral, os puffs iniciais refletem a ativação de genes que codificam fatores de transcrição. Essas proteínas então se ligam aos promotores de outros genes, ativando-os e fazendo com que um sopro apareça em seus loci.


Mecanismos celulares e moleculares que controlam a ploidia

Romain Donné,. Chantal Desdouets, no Módulo de Referência em Ciências da Vida, 2018

Endoreplicação

A endoreplicação é um defeito específico do ciclo celular que envolve uma mudança do ciclo celular mitótico para o endociclo (Fig. 2 (A) Fox e Duronio, 2013). Isso permite a replicação do genoma nuclear sem cariocinese nem citocinese levando à geração de contingentes poliplóides mononucleados. Curiosamente, duas variantes de endoreplicação foram descritas (Fig. 2 (A)): Endociclagem e Endomitose. Durante a endociclagem, a célula alterna as fases G e S, enquanto na endomitose, a célula apresenta características de mitose, como condensação cromossômica, mas pula a citocinese. Classicamente, para realizar a alternância das fases G e S, há uma ativação / inibição cíclica de CDK2 / Ciclina E, e para escapar da mitose, CDK1 / Ciclina B1 deve ser inibida (Fox e Duronio, 2013). A endoreplicação foi amplamente caracterizada durante a embriogênese em diferentes organismos. Em camundongos, durante a implantação de blastocistos, as células trofoblásticas gigantes (TGC) realizam ciclos de endoreplicação e acumulam DNA em até 1000 conjuntos de cromossomos. Esta endoreplicação é desencadeada pela inibição da atividade de CDK1 mediada por p57 (CKI) (Ullah et al., 2008). Os megacariócitos (MKC) são outro exemplo de poliploidização regulada pelo desenvolvimento em mamíferos. Enquanto o TGC pula a mitose, o MKC se torna poliploide por endomitose (pula uma parte da anáfase e da telófase). Foi demonstrado que a regulação negativa do fator de troca de guanidina ECT2 evita a ativação de RhoA e clivagem do ingresso no sulco que está acoplado a uma diminuição na expressão de ciclina B1 (Gao et al., 2012, Nguyen e Ravid, 2010). Depois de muitas rodadas desse defeito do ciclo celular, o MKC atinge um estado poliplóide (com 128n cromossomos) importante para a formação de plaquetas (Raslova et al., 2007). Curiosamente, os ciclos de endoreplicação também são encontrados em cenários patológicos sob a ativação das células bloqueadoras de Resposta ao Dano do DNA (DDR) em G2 / M e protegendo o tecido da proliferação de células danificadas contendo instabilidades cromossômicas. Este processo foi descrito em doenças hepáticas durante a divisão dos hepatócitos esteatóticos (Gentric et al., 2015). Outros estudos demonstraram que a endoreplicação pode promover aneuploidia e que a crise telomérica da tumorigênese em fibroblastos leva ao encurtamento dos telômeros e falha da mitose. A partir daí, a reativação da telomerase induz a expansão dos clones e sua transformação (Davoli e de Lange, 2012).


Química e Biologia (Curso 5-7)

Os Requisitos Gerais do Instituto incluem um Requisito de Comunicação que é integrado tanto ao Requisito HASS quanto aos requisitos de cada principal, veja os detalhes abaixo.

Resumo dos requisitos do assunto assuntos
Requisito de Ciências 6
Requisito de Humanidades, Artes e Ciências Sociais (HASS), pelo menos duas dessas disciplinas devem ser designadas como intensivas em comunicação (CI-H) para cumprir o Requisito de Comunicação. 8
Requisito de Eletivas Restritas em Ciência e Tecnologia (REST) ​​[pode ser satisfeito por 5.12 e 7.03 no Programa Departamental] 2
Requisito de Laboratório (12 unidades) [pode ser satisfeito por 7.003 [J] ou a combinação de 5.351, 5.352 e 5.353 no Programa Departamental] 1
Total de disciplinas GIR necessárias para o grau SB 17
Requisito de Educação Física
Requisito de natação, mais quatro cursos de educação física por oito pontos.

Programa Departamental

Escolha pelo menos duas disciplinas na área de concentração designadas como comunicação intensiva (CI-M) para cumprir o Requisito de Comunicação.


Resultados e discussão

A rede regulatória global inferida para HalobacteriumNRC-1

Aplicamos nosso método ao arqueão halofílico Halobacterium NRC-1. o Halobacterium o genoma contém 2.404 genes não redundantes, dos quais 124 são anotados como TFs conhecidos ou putativos [28, 29]. O procedimento de biclustering e inferência de rede foi realizado em um conjunto de dados gerado recentemente contendo 268 medições de microarray de mRNA deste archaeon sob uma ampla gama de perturbações genéticas e ambientais ('Kaur A, Pan M, Meislin M, El-Geweley R, Baliga NS' e 'Whitehead K, Kish A, Pan M, Kaur A, Rei N, Hohmann L, Diruggiero J, Baliga NS', comunicações pessoais), [30, 31]. Vários TFs não mudam significativamente em seus níveis de expressão no conjunto de dados dos 124 TFs identificados, 100 exibiram uma mudança significativa nos níveis de expressão em todo o conjunto de dados e os 24 TFs restantes foram excluídos do conjunto de influências potenciais (ver Materiais e métodos, abaixo) [32]. TFs fortemente correlacionados (aqueles com correlação maior que 0,85) foram agrupados posteriormente, resultando em 72 reguladores (alguns representando múltiplos reguladores correlacionados). A esses 72 reguladores potenciais foram adicionados 10 fatores ambientais para um total de 82 possíveis preditores para os 1.934 genes com sinal significativo no conjunto de dados. Além desse conjunto de dados principal, 24 novos experimentos (coletados após o ajuste do modelo) foram usados ​​para estimativa de erro independente subsequente ao procedimento de inferência da rede.

O método cMonkey (Reiss DJ, Baliga NS, Bonneau R, dados não publicados) foi aplicado a este conjunto de dados (268 condições originais) para genes e condições do bicluster, com base nos dados de expressão gênica, uma rede de associações funcionais e a ocorrência e detecção de cis-actuando motivos reguladores em sequências upstream de bicluster. Biclustering resultou em 300 biclusters cobrindo 1.775 genes. 159 genes adicionais, que exibiram mudança significativa em relação à referência comum em todo o conjunto de dados, foram determinados por cMonkey como tendo padrões de expressão únicos e, portanto, não foram incluídos nos biclusters; esses 159 genes foram inferidos individualmente.

O procedimento de inferência da rede regulatória foi então realizado nesses 300 biclusters e 159 genes individuais, resultando em uma rede contendo 1.431 influências regulatórias (bordas da rede) de intensidade variável. Dessas influências regulatórias, 495 representam interações entre dois TFs ou entre um TF e um fator ambiental. Selecionamos o modelo nulo para 21 biclusters (nenhuma influência ou apenas influências regulatórias fracas encontradas, conforme descrito em Materiais e métodos, abaixo), indicando que estamos excluindo rigorosamente genes sub-determinados e biclusters de nosso modelo de rede. A proporção de pontos de dados para parâmetros estimados é de aproximadamente 67 (uma constante de tempo mais três influências regulatórias, em média, de 268 condições). Nosso conjunto de dados não está completo no que diz respeito ao repertório fisiológico e ambiental completo para Halobacterium NRC-1, e vários TFs têm sua atividade modulada por fatores não observados (por exemplo, modificações pós-tradução e a ligação de ligantes não observados) as relações regulatórias para muitos genes, portanto, não são visíveis, dado o conjunto de dados atual. A Figura 1 mostra a rede resultante para Halobacterium NRC-1 no Cytoscape, disponível como um início da Web do Cytoscape / Gaggle [33, 34].

A rede regulatória inferida de Halobacterium NRC-1, visualizado usando Cytoscape e Gaggle. (uma) A rede regulatória inferida completa. Os reguladores são indicados como círculos, com bordas pretas não direcionadas aos biclusters (retângulos) dos quais são membros. Setas verdes e vermelhas representam repressão (β & lt 0) e ativação (β & gt 0) bordas, respectivamente. A espessura das bordas de regulação é proporcional à força da borda, conforme determinado pelo Inferelador (β para essa borda). As interações são mostradas como triângulos conectados aos reguladores por bordas azuis. Influências fracas (|β| & lt 0.1) não são mostrados. (b) Exemplo de regulação do Bicluster 76. Os quatro fatores de transcrição (TFs) senhorR, kaiC, VNG1405C, e VNG2476C foram selecionados pelo Inferelator como os reguladores mais prováveis ​​dos genes no bicluster 76 do conjunto de todos os (82) reguladores candidatos. Os pesos relativos, β, pelos quais se prevê que os reguladores se combinem para determinar o nível de expressão dos genes do bicluster 76, são indicados ao lado de cada borda de regulação. Os TFs VNG2476C e kaiC combinar em uma relação lógica AND. phoU e prp1 são TFs pertencentes ao bicluster 76.

Um exemplo da regulação prevista de um único bicluster, bicluster 76 (contendo genes envolvidos no transporte de Fe e Mn Tabela 1), é mostrado na Figura 1b. Entre os 82 reguladores possíveis, quatro foram selecionados como os reguladores mais prováveis ​​deste bicolor. A função aprendida desses TFs permite a previsão dos níveis de expressão do gene bicluster 76 sob novas condições, incluindo perturbações genéticas (por exemplo, para prever os níveis de expressão em um kaiC de nocaute, a influência de kaiC pode ser removida da equação ajustando seu peso para zero). Discutimos o modelo regulatório previsto para o bicluster 76 mais abaixo.

Avaliamos a capacidade do modelo de rede inferida de prever o estado de expressão de Halobacterium NRC-1 em uma base de todo o genoma. Para cada condição experimental, fizemos previsões de cada estado do bicluster, com base nos níveis de reguladores e fatores ambientais, e comparamos os valores de expressão previstos com o estado medido correspondente (usando o desvio quadrático médio [RMSD] para avaliar a diferença, ou erro, conforme descrito em Materiais e métodos, abaixo). Desta forma, avaliamos o desempenho preditivo da rede inferida em experimentos no conjunto de dados de treinamento e nos 24 experimentos no conjunto de teste independente (ao qual nos referimos como o conjunto de dados recém-coletados). O nível de expressão de um bicluster é previsto a partir do nível de TFs e fatores ambientais que o influenciam na rede, no ponto de tempo anterior (para condições de curso de tempo) ou na condição atual (para condições de estado estacionário). As estimativas de erro para os 300 biclusters e 159 genes únicos são mostradas nas Figuras 2 e 3. Para os biclusters, o erro médio de 0,37 é significativamente menor do que o intervalo de razões observadas nos dados (porque todos os biclusters foram normalizados para ter variâncias de cerca de 1,0 antes do ajuste do modelo), indicando que o estado geral da expressão global está bem previsto. Nosso poder preditivo sobre os novos dados (Figuras 2 e 3, painéis direitos) é semelhante ao dos dados de treinamento (o RMS médio sobre o conjunto de treinamento está dentro de 1 desvio padrão do RMS médio sobre os novos dados), indicando que nosso procedimento está impondo parcimônia razoável sobre os modelos (usando encolhimento L1 juntamente com validação cruzada de dez vezes [CV], conforme descrito em Materiais e métodos, abaixo) e estimando com precisão o grau em que podemos prever os níveis de expressão de biclusters como uma função de FT e níveis de fatores ambientais.

Poder preditivo da rede inferida em biclusters. (uma) O erro de desvio quadrático médio (RMSD) da resposta prevista em comparação com a resposta verdadeira para os 300 biclusters previstos avaliados ao longo das 268 condições do conjunto de treinamento. (b) O erro RMSD dos mesmos 300 biclusters avaliados em novos dados (24 condições) coletados após o ajuste do modelo / construção da rede.

Poder preditivo em genes com perfis de expressão únicos. Histogramas de desvio quadrático médio (RMSD) de resposta prevista versus resposta medida, conforme calculado na Figura 2. (uma) O erro RMSD de predito para resposta verdadeira para os 159 genes que cMonkey identificou como tendo padrões de expressão únicos e, portanto, não foram incluídos em nenhum bicluster. (b) O mesmo erro sobre os novos dados coletados após o ajuste do modelo / construção da rede para esses 159 isolados.

Embora a maioria dos biclusters tenha novos valores RMS de dados bem combinados pelos valores RMS do conjunto de treinamento, também há nove biclusters (biclusters 1, 37, 77, 82, 99, 137, 161, 165 e 180) com valores RMS significativamente maiores nos novos dados do que nos dados de treinamento. Não foi possível identificar quaisquer características desses biclusters periféricos (coerência do bicluster, tamanho do bicluster, variância dentro e fora da amostra para os biclusters, e assim por diante) que os distingue de outros biclusters. Também investigamos o desempenho preditivo para os 159 genes que não foram incluídos nos biclusters pelo cMonkey. Encontramos um bom desempenho preditivo (sobre os novos dados, bem como sobre os dados de treinamento) para aproximadamente metade desses genes - uma taxa de sucesso muito menor do que a observada para genes representados por biclusters. Existem várias explicações possíveis para essa capacidade diminuída de prever genes que também escapam ao bicluster. A média dos níveis de expressão sobre os genes que são co-regulados dentro dos biclusters pode ser considerada uma média do sinal e, portanto, genes únicos são mais propensos a erros sistemáticos e aleatórios do que os níveis de expressão dos biclusters. Outra explicação possível é que esses genes elusivos estão sob a influência de FTs que interagem com fatores não observados, como metabólitos. Existem também cerca de cinco condições que não conseguimos prever bem em relação às outras 264 condições (grandes valores RMS no treinamento e novos dados, Figuras 2 e 3). Não é de surpreender que essas cinco condições estejam todas situadas diretamente após grandes perturbações nas séries temporais, quando o sistema está flutuando dramaticamente ao restabelecer a estase.

Também realizamos vários testes para determinar o quão bem nossa formulação de modelo e procedimento de ajuste foram realizados em comparação com três formulações simplificadas, conforme descrito em detalhes no arquivo de dados adicionais 1. Resumidamente, esses testes adicionais mostram que nossa formulação atual para modelagem temporal é essencial para o desempenho deste procedimento (RMSD médio sem modelagem temporal significância de 0,40 de comparação com o modelo completo P & lt 10 -10, por emparelhado t teste) e produz modelos significativamente mais parcimoniosos. Eles também mostram que os modelos restritos a um único preditor por bicluster apresentam desempenho significativamente pior em relação aos novos dados (RMSD médio com apenas um único preditor por bicluster 0,43 P & lt 10-16). Finalmente, os testes adicionais mostram que a nossa inclusão de interações na formulação do modelo atual melhora o poder preditivo (RMSD médio sem interações 0,41, P & lt 0,03).

Controle homeostático dos principais processos biológicos por pessoas previamente não caracterizadas trhfamília

o trh família de reguladores em Halobacterium (Incluindo trh1 para trh7) são membros do LrpA/AsnC família, reguladores que são amplamente distribuídos entre as espécies bacterianas e de archaea [35]. Seu papel específico na regulamentação de Halobacterium NRC-1 os genes eram, antes deste estudo, desconhecidos. Prevemos que quatro das proteínas trh desempenham um papel significativo na coordenação da expressão de diversos processos celulares com processos de transporte concorrentes. A Figura 4 mostra um layout do Cytoscape da sub-rede ao redor trh3, trh4, trh5, e trh7. Existe uma semelhança significativa nas funções representadas pelos biclusters regulados por cada uma das proteínas trh, dando alguma indicação de que as influências aprendidas têm significado biológico. Além disso, cada proteína trh regula um conjunto único de biclusters. Usando a sub-rede prevista, podemos formar hipóteses altamente direcionadas quanto à regulação que medeia o equilíbrio homeostático de diversas funções na célula. Nossa previsão para trh3, por exemplo, é que é um repressor dos sistemas de captação de fosfato e aminoácidos e que é co-regulado com (e, portanto, um possível ativador de) diversos processos metabólicos que envolvem o consumo de fosfato. Trh3 assim, parece ser a chave para Halobacterium NRC-1 homeostase de fosfato (um fator limitante no Halobacterium ambiente natural). Declarações / hipóteses semelhantes podem ser extraídas da rede aprendida para outros reguladores de função anteriormente desconhecida, desta forma, a rede representa um primeiro passo para completar a anotação do componente regulatório do proteoma. A Figura 5 mostra o perfil de expressão previsto para 12 dos biclusters mostrados na Figura 4.

Regulação / homeostase do processo central, incluindo processo de transporte diverso, por trh3, trh4, trh5, trh7, tbpD, e kaiC. Biclusters (retângulos com altura proporcional ao número de genes no bicluster e largura proporcional ao número de condições incluídas no bicluster) são coloridos por função, conforme indicado na legenda. Nos casos em que várias funções estão presentes em um único bicluster, as funções mais representadas são listadas.

Desempenho preditivo em biclusters que representam processos-chave. Cada gráfico mostra um bicluster com um tema funcional dominante da Figura 4. A linha vermelha indica o perfil de expressão medido e a linha azul mostra o perfil conforme previsto pelo modelo de rede. As condições na região mais à esquerda de cada plotagem foram incluídas no bicluster, as regiões do meio mostram as condições excluídas do bicluster e a região mais à direita de cada plotagem corresponde às 24 medições que não faziam parte do conjunto de dados original. As duas regiões mais à direita de cada gráfico, portanto, demonstram poder preditivo sobre as condições que não estão no conjunto de treinamento. Os parâmetros do modelo de estimativa foram feitos usando apenas as condições mais à esquerda / verde.

Verificação experimental de influências regulatórias

Descrevemos agora brevemente três casos nos quais as influências regulatórias previstas foram apoiadas por mais experimentação.

VNG1179Cativa uma ATPase do tipo P1 transportadora de Cu

Prevemos que o bicluster 254, contendo uma putativa ATPase do tipo P1 transportadora de Cu, é regulado por um grupo de TFs correlacionados contendo VNG1179C e VNG6193H - dois reguladores com supostos domínios de ligação a metais [28]. Esses reguladores tornaram-se alvos atraentes para investigações futuras. O Inferelator prevê que VNG1179C e / ou VNG6193H são ativadores transcricionais de yvgX (um membro do bicluster 254). VNG1179C é um Lrp/AsnC regulador familiar que também contém um domínio TRASH de ligação a metal [35, 36]. Cepas com deleções de gene único in-frame de ambos VNG1179C e yvgX (um dos alvos propostos e transportador de cobre conhecido) resultou em crescimento diminuído semelhante na presença de Cu. Além disso, a análise recente de microarray confirmou que, ao contrário do tipo selvagem, yvgX os níveis de transcrição não são regulados positivamente pelo Cu no VNG1179C cepa excluída. Essa falta de ativação de yvgX no VNG1179C A cepa de deleção resultou em crescimento pobre na presença de Cu para cepas com deleção em cada um dos dois genes (Kaur A, Pan M, Meislin M, El-Geweley R, Baliga NS, comunicação pessoal).

SirRregula os principais processos de transporte

SirR foi descrito anteriormente como um regulador envolvido na resistência à fome de ferro em Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus aureus. SirR é possivelmente um regulador da transcrição dependente de Mn e Fe em vários sistemas microbianos e um homólogo de dtxR [37]. Existe um forte homólogo de S. epidermidis sirR no Halobacterium genoma, mas o papel desta proteína no Halobacterium circuito regulador não foi determinado. Nós previmos que senhorR e kaiC são reguladores centrais, envolvidos na regulação de biclusters associados ao transporte de Mn / Fe, como o bicluster 76 (Figura 1b). Incluídos neste bicluster estão três genes, a saber zurA, zurM e ycdH, que juntos codificam um transportador ABC específico de Mn / Fe, consistente com a observação recente de que senhorR é necessário para a sobrevivência do estresse induzido por metal (Kaur A, Pan M, Meislin M, El-Geweley R, Baliga NS, comunicação pessoal). A Figura 6 mostra os níveis de expressão previstos e medidos para o bicluster 76 como uma função de reguladores inferidos (senhorR, kaiC) para todas as condições, incluindo séries temporais, medições de equilíbrio, vazamentos e novos dados. Observe que as influências regulatórias para este bicluster foram inferidas apenas usando as 189 condições (de um total de 268 possíveis) que cMonkey incluídas neste bicluster as condições excluídas eram de baixa variância ou não exibiam expressão coerente para os genes neste bicluster. SirR Perfis de mRNA em todas as 268 condições experimentais originais são positivamente correlacionados com mudanças no nível de transcrição nestes três genes. No entanto, ao excluir SirR, os níveis de mRNA desses três genes aumentaram na presença de Mn, sugerindo que SirR funciona como um repressor na presença de Mn, em aparente contraste com nossa previsão. Na verdade, um papel duplo na regulação foi observado para pelo menos uma proteína na família de reguladores para os quais SirR pertence, que funciona como ativador e repressor sob condições de baixo e alto Mn, respectivamente [38]. Embora mais investigação seja necessária, o Inferelator identificou com sucesso parte desta relação regulatória e o emparelhamento correto do regulador e do alvo.

Resposta medida e prevista para processos de transporte (bicluster 76). O vermelho mostra a resposta medida do bicluster 76 em 277 condições (níveis de expressão de mRNA medidos conforme descrito em Materiais e métodos, no texto). Bicluster 76 representa processos de transporte controlados pelos reguladores KaiC e SirR (Figura 1b). Azul mostra o valor previsto pela rede de influência do regulador. Condições em (uma) correspondem às condições incluídas no bicluster 76 (condições para as quais esses genes têm alta variância e são coerentes). (b) Mostra as condições fora do bicluster, mas no conjunto de dados original / de treinamento. (Essas regiões não foram usadas para ajustar o modelo do bicluster 76, porque os modelos foram ajustados apenas nas condições do bicluster.) (c) Contém condições / medições que não faziam parte do conjunto de dados original e, portanto, não estavam presentes quando o biclustering e os procedimentos de inferência de rede / ajuste de modelo subsequentes foram realizados. As regiões B e C demonstram poder preditivo fora da amostra.

TfbFativa o componente proteico do ribossomo

Halobacterium NRC-1 tem várias cópias dos principais componentes de sua maquinaria de transcrição geral (TfbA para TfbG e TbpA para TbpF) Os estudos em andamento são direcionados para determinar o grau em que essas cópias múltiplas dos TFs gerais são responsáveis ​​pela regulação diferencial dos processos celulares (Facciotti MT, Bonneau R, Reiss D, Vuthoori M, Pan M, Kaur A, Schmidt A, Whitehead K, Shannon P, Dannahoe S, comunicação pessoal), [39]. Nós prevemos que TfbF é um ativador de genes que codificam proteínas ribossômicas. Os genes que codificam a proteína ribossomal são distribuídos em sete biclusters, todos os sete devem ser controlados por TfbF. Esta previsão foi verificada medindo as interações proteína-DNA para TfbF pela análise do chip ChIP como parte de um amplo estudo de sistemas de Tfb e Tbp padrões de ligação em todo o genoma (Facciotti MT, Bonneau R, Reiss D, Vuthoori M, Pan M, Kaur A, Schmidt A, Whitehead K, Shannon P, Dannahoe S, comunicação pessoal).


DISCUSSÃO

Nossos resultados mostram que a endoreplicação transitória gera células poliplóides (≥8C) que podem retornar à divisão propensa a erros, o que pode causar instabilidade severa do genoma ao desovar células aneuplóides proliferativas. Embora as iECs poliplóides montem fusos multipolares que começam a sofrer anáfase multipolar durante a RTM, freqüentemente existem cromossomos atrasados ​​no sulco citocinético, o que resulta em uma falha na citocinese. Isso pode levar a duas células-filhas com conteúdos genômicos muito diferentes. Os iECs retornando à mitose tinham níveis mais baixos de HSET, e sua superexpressão resgatou parcialmente a multipolaridade do fuso na divisão de iECs, consistente com seu papel conhecido no agrupamento de centrossoma. No entanto, a expressão de HSET levou a apenas uma redução modesta em CIN, o que sugere que genes regulados negativamente adicionais em iECs provavelmente contribuem para CIN durante RTM. Tomados em conjunto, nossos estudos fornecem um modelo para a compreensão dos mecanismos pelos quais os ciclos celulares alternativos levam ao desenvolvimento da poliploidia e como essas divisões sujeitas a erros, em última análise, levam à instabilidade genômica.

Perturbação do ciclo celular pode induzir poliploidia

As respostas das células à perturbação do ciclo celular são altamente heterogêneas, incluindo parada do ciclo celular, deslizamento mitótico ou morte celular. Por exemplo, os agentes que danificam o DNA, os inibidores da quinase do ciclo celular e os agentes antimicrotúbulos podem induzir a poliploidização ou o deslizamento mitótico (Roberts et al., 1990 Verdoodt et al., 1999 Erenpreisa et al., 2005, 2008 Puig et al., 2008). Está claro em nosso trabalho que as células podem ser induzidas em ciclos celulares variantes, resultando em alta ploidia com baixo nível de morte celular. Estudos recentes indicam que a falha mitótica é geralmente seguida por parada do ciclo celular dependente de p53 ou morte celular por meio da ativação da via Hipopótamo (Ganem e Pellman, Ganem 2012 et al., 2014). Em contraste, descobrimos que as células p53 + HCT-116 foram submetidas a endoreplicação no tratamento com RO3306 ou SU6656 em vez de ficarem presas em um estado tetraplóide, indicando que a endoreplicação pode ser uma alternativa pela qual as células evitam a catástrofe mitótica. Além disso, nossos dados demonstram que a maior parte da morte celular ocorre após o retorno das iECs à mitose, e não após o tratamento inicial com a droga. As células de endociclagem podem ter um limiar de apoptose mais alto (Zheng et al., 2012) e tolerar altos níveis de danos ao DNA (Ullah et al., 2008, 2011 Davoli e de Lange, 2011). No Drosófila, células de endocilhamento induzidas e de ocorrência natural não apoptam em resposta ao estresse genotóxico, porque reprimem a via p53 (Mehrotra et al., 2008 Hassel et al., 2014 Zhang et al., 2014). Além disso, a rede de resposta a danos no DNA é regulada para evitar respostas a danos em fibroblastos embrionários de camundongos endoreplicados induzidos, o que também pode explicar como as células de endociclagem podem ter um limite apoptótico mais alto (Zheng et al., 2012). Juntos, esses estudos apóiam a ideia de que os ciclos celulares variantes, como aqueles que ocorrem com a endoreplicação, podem ser um contribuinte importante, mas subestimado, para a sobrevivência celular e a instabilidade genômica.

Uma questão sem resposta é como as células optam por se submeter ao endociclo versus endomitose. Em alguns casos, essa é uma escolha de desenvolvimento. Por exemplo, células trofoblásticas gigantes em mamíferos e células das glândulas salivares em Drosófila ambos reprimem fortemente a função CDK1 e têm oscilações de Cdk2 / ciclina E alternando com APC / Cdh1 (Palazón et al., 1998 Hattori et al., 2000 Edgar e Orr-Weaver, 2001). Em contraste, os megacariócitos tornam-se poliplóides através da endomitose (Jackson, 1990) devido, pelo menos em parte, aos níveis reduzidos de Cdk1 / ciclina B (Ravid et al., 2002). Nosso achado de que altas concentrações de RO3306 induziram endociclos enquanto concentrações mais baixas induziram endomitose sugere que Cdk1 é um mediador importante na escolha entre endociclo e endomitose. Juntos, esses resultados apóiam a ideia de que endociclo e endomitose são variações em um continuum com diferentes graus de repressão dos osciladores da quinase mitótica.

A regulação negativa dos principais atores mitóticos pode levar à segregação cromossômica defeituosa e citocinese

A cinesina-14 HSET é essencial para o agrupamento do centrossoma em células com amplificação do centrossoma (Kwon et al., 2008). Em células tetraploides, o agrupamento de centrossomas em dois pólos leva a defeitos na divisão celular devido a ligações inadequadas de cinetocoro-microtúbulo que se formam nos fusos multipolares transitórios (Ganem et al., 2009). Nossos dados apoiam a ideia de que as células poliplóides têm níveis aumentados de multipolaridade e uma falha no agrupamento do centrossoma em comparação com a divisão das células tetraploides, potencialmente amplificando a extensão dos desatamentos cinetocore-microtúbulo (Fujiwara et al., 2005). Consistente com essa ideia, descobrimos que HSET foi regulado para baixo em iECs e que a superexpressão de HSET reduziu a extensão da multipolaridade do fuso. Além disso, nossas observações sugerem que o aumento de cinetocoros mal anexados em células poliplóides pode levar a cromossomos atrasados ​​aumentados que resultam em falha de citocinese. Na verdade, o kinesin-14 ncd estava entre os genes regulados negativamente em Drosófila endocycling cells, e nossos resultados atuais suportam a ideia de que a cinesina-14 humana, HSET, também pode ser um jogador importante na fidelidade da segregação cromossômica durante RTM de células poliplóides. Estudos anteriores também mostraram que um grupo semelhante de genes mitóticos são regulados negativamente em Drosófila e células de endociclagem de camundongo (Maqbool et al., 2010 Chen et al., 2012 Pandit et al., 2012). Um modelo atraente é que esse nível mais baixo de expressão do gene mitótico contribui para os vários defeitos na formação do fuso, segregação cromossômica e citocinese quando as células endoreplicadas retornam à mitose.

Uma observação interessante é que na RTM, as iECs retornam a um número cromossômico semelhante ao da população inicial inicial, sugerindo que essas células poliplóides sofrem divisões que reduzem o conteúdo do genoma. Essas divisões genômicas redutoras foram descritas pela primeira vez em fibroblastos tetraplóides e, posteriormente, foram encontradas em vários tipos de células (Duncan et al., 2010 Fox et al., 2010 Hassel et al., 2014 Schoenfelder et al., 2014). Estudos anteriores concluíram que as divisões celulares multipolares em hepatócitos poliploides de camundongo resultaram na reversão da ploidia em uma etapa para a progênie com conteúdo genômico dividido pela metade ou dividido em quartos (Duncan et al., 2010). Consistente com esta observação, descobrimos que nossos iECs apresentam fusos multipolares e passam por uma anáfase multipolar. However, due to cytokinesis failure, iEC RTM usually resulted in two or three daughter cells of different sizes and DNA contents. Kinetochore analysis of the first-generation progeny in these cells showed highly variable levels of chromosomes in the resulting daughter cell nuclei, suggesting that ploidy reversal is not a one-step process in the iECs. In addition, our FACS data suggest that ploidy reversal occurs over successive cell divisions, ultimately resulting in a DNA content that is similar to that in control cells. Of interest, it was recently shown in an analysis of tumors with numerical CIN that both diploid and tetraploid chromosomal populations converged on a near-triploid DNA content, suggesting that there is likely some type of selective advantage to maintaining a certain level of aneuploidy (Laughney et al., 2015).

Consequence of CIN after transient endoreplication

A potential shortcoming of genome reductive mitosis is that mitotic cells do not have enough genome content to buffer the deleterious effects of the massive aneuploidy that occurs in these divisions. Multipolar cell divisions in cells with excess centrosomes typically result in low viability of the progeny (Ganem et al., 2009). In contrast, the kinetochore distribution analysis of our polyploid cells suggests that progeny from these divisions have a larger number of kinetochores and thus likely have a higher probability to have at least one complete set of chromosomes. In addition, the high cytokinesis failure rate during RTM in polyploid cells results in only two or three daughter cells, decreasing the probability of cells containing incomplete chromosomal complements incompatible with life. Our studies also show that iEC daughters undergo multiple rounds of division to ultimately reduce the genome, but the fraction of cells that ultimately survive is not known. A future goal will be to assess the precise mechanisms by which polyploid cells return to a near-triploid state.

Aneuploidy after RTM in polyploid cells after transient endoreplication may lead to karyotype evolution and selective cellular advantage. Our FISH analysis of chromosomes 2 and 7 demonstrated that the chromosomes are not evenly distributed into daughter cells during polyploid divisions, suggesting that these cells have high levels of CIN and a different chromosome composition from the original cell population. It has been proposed that high levels of CIN allow for selective advantages in the subsequent daughter cells due to the selection of certain favorable chromosomal complements (Duncan, 2013). In contrast, error-prone divisions in tetraploid cells usually lead to loss or gain of only a few chromosomes in daughter cells, resulting in subclones with accumulated mutations (Storchova and Pellman, 2004 Fujiwara et al., 2005). A more striking example is that the aneuploid daughters that arise after polyploid divisions in mouse hepatocytes quickly adapt to external stress (Duncan et al., 2012). A future goal will be to understand whether and how these polyploid divisions lead to favorable karyotypes and the underlying molecular mechanisms that govern this selection.

Polyploid mitosis could contribute to cancer relapse

CIN followed by selection of aneuploid cells is proposed to play a major role in tumorigenesis (Storchova and Pellman, 2004 Fujiwara et al., 2005 Weaver et al., 2007 Williams et al., 2008 Davoli and de Lange, 2011 Varetti and Pellman, 2012 Silk et al., 2013). Our data suggest that transient iECs are a potent contributor to CIN and aneuploidy, suggesting that transient iECs may contribute to tumorigenesis. It is well known that many cancers are polyploid and that polyploidy often correlates with poor prognosis (Davoli and de Lange, 2011), but it is not clear what the mechanistic link is between these observations. Some studies suggest that polyploidy invariably leads to senescence or apoptosis (Verdoodt et al., 1999), consistent with our observation that a fraction of polyploid cell divisions result in cell death. It is well established that many chemotherapeutic agents target the cell cycle, resulting in a failure in cell cycle progression and a triggering of apoptosis. However, we propose that a fraction of the cells escape apoptosis and instead enter the alternative cell cycle state of endocycle or endomitosis (Figure 9). When cells undergo endoreplication, they are resistant to genotoxic stress, such as would be caused by radiation therapy. Thus a transient switch to endoreplication could provide a mechanism for therapy resistance. On discontinuation of the chemotherapy, these transient iECs would be competent to resume mitotic divisions, which are highly error-prone. In this sense, error-prone RTM would elevate rates of genome instability, with microselection of proliferative aneuploid daughters contributing to tumor regrowth. Taken together, our findings support the idea that a return to mitosis by polyploid iECs may be an underappreciated aspect of tumorigenesis and provide a novel inroad into the identification of new therapeutic strategies.

FIGURE 9: Model. After treatments that perturb cell cycle progression, a fraction of the cells escape apoptosis and instead enter the alternative cell cycle state of endoreplication (endocycle/endomitosis). Switching to endoreplication may provide a mechanism for therapy resistance. On discontinuation of the perturbation, many cells die, but a fraction of these polyploid cells resume mitotic divisions, which are highly error-prone, contributing to tumor heterogeneity and leading to cancer relapse.


Discussão

The results presented here show a central role for endogenous Myc in epidermal homeostasis. The reduction of the proliferative compartment led to premature differentiation both in vivo and in culture. However, keratinocytes were capable of cycling in vivo in the absence of Myc, and drastic cell-cycle phasing defects were not observed in proliferative cells, in agreement with observations in dmyc Drosófila mutants (Johnston et al., 1999). It is worth noting, though, that an upregulation of L-myc was detected in younger mice before the more severe phenotype arose. A possible compensatory effect by L-myc or other pathways supporting proliferation in KO epidermis, cannot be ruled out. However, keratinocytes continued to cycle in adult mice even when L-myc and B-myc were downregulated and N-myc was undetectable. In addition, neither a compensatory effect nor the presence of cells carrying undeleted Myc was detected in culture, as no growing clones were obtained from any KO mouse. Nevertheless, the hyperproliferation involved in wound healing, hair follicles and stratified cultures was consistently and severely compromised, indicating that Myc is required for rapid epidermal proliferative cycles.

Myc, cell size and endoreplication

KO cells were significantly smaller, suggesting that cellular growth might be the primary defect in keratinocytes without Myc, causing the observed effects on the proliferation/differentiation balance. Suppression of Myc activity in epidermis also impaired keratinocyte endoreplication. Endoreplication has been often disregarded or poorly studied in mammalian organisms, in spite of the fact that it is found in various human tissues including epidermis (Gandarillas et al., 2000) (J.Z. et al., unpublished), and that it might have an important role in cellular growth (for example, see Edgar and Orr-Weaver, 2001). A correlation between DNA ploidy, cell-size and -differentiation has been observed in plants, Drosófila and mammals, but their interdependence is not clear. However, it has been shown that endoreplication allows plant cells to increase in size, also during epidermal differentiation (Traas et al., 1998 Kondorosi et al., 2000). Our present data suggest that endoreplication is not required for terminal differentiation to take place, but that it is necessary for the cell enlargement that occurs during normal post-mitotic differentiation (Banks-Schlegel and Green, 1981 Gandarillas et al., 2000).

Myc and stem cell function

A possible role of Myc in regulating stem cell biology has been recently proposed (Gandarillas and Watt, 1997 Waikel et al., 2001 Arnold and Watt, 2001). Our data show that Myc KO stem cells are unable to amplify and have a limited life span in culture, and give rise to a limited proliferative progeny in vivo. Reconciling the data reported for the exogenous and the endogenous gene on keratinocytes reveals that Myc pushes stem cells into clonal expansion along the differentiation programme when overactivated (Gandarillas and Watt, 1997 Waikel et al., 2001 Arnold and Watt, 2001), but causes stem cell daughters to enter premature differentiation when absent. Altogether our results suggest that the stem cell turnover is higher and that their compartment might be reduced, in adult Myc KO epidermis. A logical rationale to explain this seems that incapable to undergo rapid amplification and in order to sustain epidermis, stem cells are forced to divide and undergo differentiation more frequently and therefore, their compartment might be progressively reduced. This would explain why the difference observed in the replication index between KO and control epidermis at a given time was not drastic and yet the proliferative compartment (TAC) was reduced. According to this, Myc would not be required for stem cell divisions, nor `a switch' of the stem cell decision to enter the differentiation programme (Gandarillas et Watt, 1997), but it would be `an amplifier' of such a decision (Fig. 9). If this model is correct, the skin should have more difficulties to grow with time and indeed, a more severe phenotype appeared after 2 or 3 months of age. Another expectable consequence of forcing stem cells to divide more frequently is that the epidermis would age prematurely, and this seems to be the case of adult KO skin, since it appeared atrophic and slow regenerating. Altogether, a correct Myc activity appears essential for normal stem cell function and renewal.

Myc and cell growth

The tight and shiny skin and the reduced body size of epidermal Myc KO mice resemble the phenotype of epidermal-specific transgenics for the keratinocyte growth-inhibitory factor TGF-β (Sellheyer et al., 1993), which is known to downregulate Myc. These features are also reminiscent of the `tight skin contracture' human inherited lethal syndrome affecting newborns (Lowry et al., 1985 Lenz and Meschede, 1993 Abrahamson and Stone, 2002). Interestingly, this condition has been described by some authors as `generalised skin atrophy' or hypoplasia (Lenz and Meschede, 1993), and this is consistent with our observations.

A key remaining question is whether mammalian Myc function and cell growth are coupled to cell division. Johnston et al. (Johnston et al., 1999) concluded that Drosófila dmyc stimulates the G1/S transition independently of mitosis control, thus resulting in increased cell size. We made similar observations after constitutive activation of Myc in human keratinocytes, which resulted in cell size increase upon a cell division block (Gandarillas et al., 2000). This coincidence is consistent with the fact that dmyc and Myc share biological activities (Gallant et al., 1996 Schreiber-Agus et al., 1997). However, by reducing Myc expression in the whole mouse body, Trumpp et al. (Trumpp et al., 2001) found fewer cells of normal size in some organs. They suggested that Myc is not essential for cellular growth and instead controls the decision of cells to divide or not to divide, due to a tighter coupling of cell growth and cell division in mammals. Our results show that endogenous Myc controls mammalian epidermal cell size both in proliferative and especially, in postmitotic cells. Two possible reconciling explanations for such discrepancy are that the mice analysed by Trumpp et al. had some remaining Myc expression, and/or that the consequences of Myc function are tissue dependent and cell context dependent rather than species specific. Interestingly, Myc produced larger cells when overexpressed (Kim et al., 2000) and smaller cells when inactivated (Baena et al., 2005), in mouse liver, another endoreplicative tissue. Interestingly, two different groups have reported a requirement of dmyc in Drosófila endoreplication (Maines et al., 2004 Pierce et al., 2004). A selective advantage of cells overexpressing dmyc in Drosófila has also been recently reported by inducing apoptosis of cells with lower levels of dmyc (de la Cova et al., 2004 Moreno and Basler, 2004). Whether this effect is related or not to cell growth remains to be elucidated. A role for Myc in stem cell renewal has also been very recently reported by Wilson et al. (Wilson et al., 2004) in bone marrow. In agreement with our observations, the authors conclude that Myc is not required for stem cell proliferation, although in this case they find an accumulation of stem cells. Different tissue-regulatory mechanisms and cell contexts might account for the different consequences of Myc function (a similar conclusion has been drawn from overexpression of Myc in mouse liver by Beer et al.) (Beer et al., 2004).

The study presented here shows that at least in some tissues and as for dmyc in flies, mammalian Myc function and cell growth are not tightly coupled to cell division. This implies that in addition to cell growth control deregulation, oncogenic alterations may have to hit the mitosis checkpoint to trigger tumorigenesis. In all cases reported, nevertheless, endogenous or exogenous Myc function resulted in increased biomass production, an advantage that tumours would clearly not hesitate to select. Unifying Myc functions in the mammalian body and carcinogenesis should now be the challenge.