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Como o sistema de orientação de axônios atinge precisamente axônios específicos?

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Os axônios chegam ao terminal respondendo às moléculas de orientação dos axônios (AGMs) que atraem e repelem os cones de crescimento ou os fazem se mexer. Isso eu entendo.

Por meio de uma combinação muito específica de AGMs, pode-se traçar um caminho preciso que um cone de axônio seguirá até mesmo em metade do cérebro. Isso eu também entendo.

O que não entendo é que, no cérebro em desenvolvimento, existem milhões de axônios movendo-se para seus terminais ao mesmo tempo, e milhões de AGMs liberados por todo o cérebro. Quando um axônio parte em uma jornada para alcançar um AGM na extremidade oposta do cérebro, ele provavelmente passará por milhares de outros AGMs e ainda ignorará todos eles.

Quando um AGM é liberado, existem milhares de neurônios próximos, e ainda assim todos eles irão ignorá-lo, mas algum neurônio único através do cérebro irá procurá-lo.

Posso pensar em duas explicações possíveis:

  1. Existem AGMs únicos para cada neurônio que nenhum outro neurônio seguirá (mas não parece ser o caso).
  2. De alguma forma, existem instruções muito específicas conectadas a CADA neurônio, também conhecido como ignorar cinco netrinas, seguir o sexto, depois ignorar mais dois e, em seguida, seguir o nono até alcançá-lo (mas como é possível programar todos os neurônios do cérebro assim ?).

Então, como isso funciona na realidade?


Em suma, eu diria neurônios têm "instruções específicas". No entanto, não é tanto "ignore a quantidade de netrin X e pare". É mais como "receptores expressos 1, 30, 48 e 62" que, como uma combinação única, leva o cone de crescimento para onde está indo e o impede de formar uma conexão errônea ao longo do caminho. Forneci mais contexto abaixo que pode ajudar a fazer mais sentido.

Uma série de fatores entram em jogo com a orientação e o pathfinding adequados do axônio, mas acho que os dois abaixo são suficientes para isso:

  1. Existem diferentes receptores presentes ou ausentes na superfície da célula, dependendo do tipo de célula, o que permite que diferentes tipos de células respondam apenas a sinais específicos. No entanto, a maioria dos axônios em desenvolvimento expressa vários tipos de receptores, então eles podem responder a várias pistas de orientação (ou responder a um coquetel de pistas diferentes).
  2. Existem sinais não difusíveis presentes ao longo do caminho no qual o axônio está crescendo. Você pode ler sobre um tipo aqui: https://www.nature.com/articles/nn.2231. O ponto principal sobre os sinais não difusíveis é que eles podem estabilizar o cone de crescimento (o que pode promover o crescimento ou iniciar a formação de uma sinapse) ou podem repelir o cone de crescimento. Portanto, eles desempenham um papel importante em informar ao cone de crescimento o que é e o que não é o alvo adequado.

Agora há duas coisas em sua pergunta que devem reunir tudo. Primeiro, você afirma que o caminho preciso vem de uma "combinação específica de AGMs". Exatamente! A palavra-chave aqui é "combinação". Porque existem tantos AGMs que podem afetar o cone de crescimento de muitas maneiras, o combinação de receptores (e mensageiros secundários intracelulares) expressos no cone de crescimento e como eles funcionam em conjunto é o que é crítico. Em segundo lugar, você afirma que os cones de crescimento "ignorarão" os alvos potenciais à medida que passam por eles. Esse pode ser o caso (ou seja, se um cone de crescimento não tiver um receptor para algo que o alvo está expressando, ele não "agarrará" ou responderá muito à sua presença). No entanto, também pode ser que esses alvos potenciais expressem alguma pista não difusível que repele o cone de crescimento e não reconheça aquele local como seu destino final.


Papéis e mecanismos das moléculas de orientação do axônio na doença de Alzheimer

A doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa que se caracteriza pelo declínio progressivo da memória e disfunções cognitivas. Embora as causas da DA ainda não tenham sido estabelecidas, muitos mecanismos foram propostos. As moléculas de orientação do axônio desempenham papéis na ocorrência e no desenvolvimento da DA, participando de diferentes mecanismos. Portanto, quais papéis as moléculas de orientação de axônios desempenham na DA? Este estudo teve como objetivo elucidar como as moléculas de orientação de axônio Netrinas, Fendas, Semaforinas e Efrinas regulam os níveis de Aβ, hiperfosforilação da proteína tau, Reelin e outras formas através de diferentes vias de sinalização, a fim de mostrar os papéis das moléculas de orientação de axônio na ocorrência e desenvolvimento de DA. E espera-se que este estudo possa fornecer uma base teórica e novas perspectivas na busca de novos alvos terapêuticos para a DA.

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Organização dos componentes do citoesqueleto (filamentos de actina e microtúbulos) no cone de crescimento.

Os cones de crescimento facilitam o crescimento e a orientação dos axônios agrupando e estendendo os filamentos de actina em estruturas conhecidas como filópodes e microespinhos. A ligação de filopódios e receptores de adesão a componentes ou ligantes da matriz extracelular (ECM) particular é traduzida em montagem de filamento de actina, remodelação do citoesqueleto e motilidade dirigida por força. Esses eventos culminam no crescimento do neurônio em direção ao seu alvo.

Os cones de crescimento contêm vários componentes do citoesqueleto que são organizados em três regiões: o domínio periférico (P), o domínio transicional (T) e o domínio central (C) [1].

  • O domínio P é composto principalmente de feixes de filamentos de actina unipolares embutidos em uma rede de actina menos polar. Ele contém lamelipódios e filopódios dinâmicos. Os microtúbulos também são encontrados temporariamente neste domínio.
  • O domínio T é uma interface fina entre os domínios P ​​e C.
  • O domínio C está localizado no centro do cone de crescimento próximo ao axônio. É principalmente composto por microtúbulos e contém numerosas organelas e vesículas.

Neurônio comissural espinhal de camundongo CD1 com cone de crescimento: imagem fornecida por Simon Moore, pesquisador da Universidade de Columbia


RESULTADOS

A eliminação de Robo3.1 em axônios comissurais pós-cruzamento é dependente da placa de piso e por meio de regulação translacional

Para explorar os mecanismos que regulam a eliminação de Robo3.1 de axônios comissurais espinhais pós-cruzamento, primeiro desenvolvemos uma estratégia para rotular axônios comissurais (CA). Usando um neurônio comissural dorsal (DCN) específico Cre linha-Atoh1-Cre e um repórter GFP -Rosa26-mT / mG, rotulamos axônios comissurais com GFP (Figura Suplementar S1A). A co-imunomarcação com um anticorpo específico para Robo3.1 (8) mostrou que Robo3.1 foi expresso apenas em axônios comissurais pré-cruzamento e cruzamento da linha média, mas não axônios pós-cruzamento (Figura Suplementar S1B e C). A correlação da expressão temporal do Robo3.1 com os estágios de cruzamento da linha média do axônio comissural sugeriu que o desaparecimento do Robo3.1 em axônios pós-cruzamento pode ser dependente da placa do assoalho. Para testar isso, desenvolvemos um em vitro ensaio no qual os explantes da medula espinhal dorsal (DSC) foram dissecados da medula espinhal E10.5 pré-cruzamento e cultivados com ou sem placa de piso anexada (Figura 1A). Depois que os axônios comissurais cresceram, monitoramos os níveis da proteína Robo3.1 nos axônios. Conforme mostrado na Figura 1B, a proteína Robo3.1 foi perdida em axônios comissurais que crescem através da placa de piso, em comparação com axônios que crescem para fora dos explantes sem entrar em contato com a placa de piso. Para confirmar ainda mais isso na Vivo, usamos um modelo de medula espinhal com deficiência de placa de piso por Gli2 nocaute (KO) (36). Conforme mostrado na Figura 1C, o nível de proteína Robo3.1 foi elevado em axônios de ‘cruzamento’ e mantido em axônios ‘pós-cruzamento’ em medula espinhal com deficiência de placa de assoalho de Gli2 - / - embriões, em comparação com Gli2 + /- controlar os irmãos da mesma ninhada. Estes resultados sugerem que a placa de piso é necessária para a eliminação da proteína Robo3.1 dos axônios comissurais pós-cruzamento. Para testar ainda mais se a placa de piso é suficiente para induzir a eliminação da expressão do Robo3.1, realizamos outro em vitro ensaio usando explantes DSC sem placa de piso anexada (Figura 1A). Preparamos meio condicionado da placa de piso (FP-CM) (42) e, em seguida, adicionamos FP-CM aos explantes DSC (Figura 1D). Em comparação com o meio condicionado de controle (Ctrl-CM), a aplicação de FP-CM resultou em uma perda da proteína Robo3.1 nos axônios (Figura 1D). Tomados em conjunto, esses dados mostram que a placa de piso é necessária, bem como suficiente para a eliminação do Robo3.1 em axônios comissurais pós-cruzamento.

A eliminação de Robo3.1 em axônios comissurais pós-cruzamento é dependente da placa de piso e por meio de regulação translacional. (UMA) Desenhos esquemáticos mostrando em vitro ensaios de cultura de explante. Explantes da medula espinhal dorsal (DSC) contendo neurônio comissural dorsal (DCN) da medula espinhal E10.5 foram dissecados e cultivados com ou sem placa de assoalho (FP) até que os axônios comissurais cresceram. (B) Explantes DSC de E10.5 Atoh1-Cre +/- Rosa26-mT / mG +/- medulas espinhais embrionárias foram dissecadas e cultivadas como mostrado em (A). A proteína Robo3.1 foi amplamente perdida em axônios comissurais crescendo através da placa de piso, enquanto sua expressão foi mantida em explantes sem placa de piso. (C) A expressão do Robo3.1 foi examinada na placa de piso deficiente Gli2 - / - embriões e seus irmãos heterozigotos de controle em E11.5. Como mostrado, a expressão de Robo3.1 foi elevada no cruzamento de axônios comissurais em Gli2 - / - medula espinhal (caixa pontilhada branca) em comparação com o controle alfabetizado (caixa pontilhada branca) e mantida em axônios comissurais pós-cruzamento (pontas de seta brancas). (D) Explantes DSC de E10.5 Atoh1-Cre +/- Rosa26-mT / mG +/- medulas espinhais embrionárias sem placa de assoalho (como mostrado em A) foram cultivadas com meio condicionado. O tratamento de meio condicionado com placa de piso (FP-CM) resultou em diminuição dramática de Robo3.1 em axônios comissurais em comparação com Ctrl-CM. (E) Quantificação de imunofluorescência (IF) Robo3.1 em axônios comissurais de explantes DSC cultivados, mostrando que os tratamentos por FP-CM e inibidor da síntese de proteínas cicloheximida (CHX) tiveram efeitos semelhantes na eliminação da proteína Robo3.1 (n = 24 campos confocais para Ctrl, n = 29 campos confocais para FP-CM, n = 27 campos confocais para CHX). (F) Os níveis de proteína Robo3.1 foram medidos por anti-HA WB após HA-Robo3.1 foi expresso em células COS-7 que foram coletadas em diferentes pontos de tempo após o tratamento com CHX. (G) Quantificação dos resultados em (F) e cálculo da meia-vida para a proteína Robo3.1 (n = 3 repetições). (H) Quantificação de Robo3.1 IF em axônios comissurais de explantes de DSC cultivados, mostrando que o tratamento com o inibidor de proteassoma MG-132 levou ao acúmulo dramático da proteína Robo3.1 (n = 10 campos confocais para veículo, n = 24 campos confocais para MG-132). Todos os dados são a média ± S.E.M. Os dados de quantificação de IF (E, H) são representados como gráficos de caixa e bigode. Para E: Ctrl versus FP-CM, ****P = 9,06E – 09 Ctrl versus CHX, ****P = 5,11E-09 FP-CM versus CHX, ns, não significativo (P = 0,21) por análise de variância unilateral (ANOVA) seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey. Para H: Veículo versus MG-132, ****P = 4,46E-11 por Aluno não pareado t teste. Barras de escala, 50 μm (B – D).

A eliminação de Robo3.1 em axônios comissurais pós-cruzamento é dependente da placa de piso e por meio de regulação translacional. (UMA) Desenhos esquemáticos mostrando em vitro ensaios de cultura de explante. Explantes da medula espinhal dorsal (DSC) contendo neurônio comissural dorsal (DCN) da medula espinhal E10.5 foram dissecados e cultivados com ou sem placa de assoalho (FP) até que os axônios comissurais cresceram. (B) Explantes DSC de E10.5 Atoh1-Cre +/- Rosa26-mT / mG +/- medulas espinhais embrionárias foram dissecadas e cultivadas como mostrado em (A). A proteína Robo3.1 foi amplamente perdida em axônios comissurais crescendo através da placa de piso, enquanto sua expressão foi mantida em explantes sem placa de piso. (C) A expressão do Robo3.1 foi examinada na placa de piso deficiente Gli2 - / - embriões e seus irmãos heterozigotos de controle em E11.5. Como mostrado, a expressão de Robo3.1 foi elevada no cruzamento de axônios comissurais em Gli2 - / - medula espinhal (caixa pontilhada branca) em comparação com o controle alfabetizado (caixa pontilhada branca) e mantida em axônios comissurais pós-cruzamento (pontas de seta brancas). (D) Explantes DSC de E10.5 Atoh1-Cre +/- Rosa26-mT / mG +/- medulas espinhais embrionárias sem placa de assoalho (como mostrado em A) foram cultivadas com meio condicionado. O tratamento de meio condicionado com placa de piso (FP-CM) resultou em diminuição dramática de Robo3.1 em axônios comissurais em comparação com Ctrl-CM. (E) Quantificação de imunofluorescência (IF) Robo3.1 em axônios comissurais de explantes DSC cultivados, mostrando que os tratamentos por FP-CM e inibidor da síntese de proteínas cicloheximida (CHX) tiveram efeitos semelhantes na eliminação da proteína Robo3.1 (n = 24 campos confocais para Ctrl, n = 29 campos confocais para FP-CM, n = 27 campos confocais para CHX). (F) Os níveis de proteína Robo3.1 foram medidos por anti-HA WB após HA-Robo3.1 foi expresso em células COS-7 que foram coletadas em diferentes pontos de tempo após o tratamento com CHX. (G) Quantificação dos resultados em (F) e cálculo da meia-vida para a proteína Robo3.1 (n = 3 repetições). (H) Quantificação de Robo3.1 IF em axônios comissurais de explantes de DSC cultivados, mostrando que o tratamento com o inibidor de proteassoma MG-132 levou ao acúmulo dramático da proteína Robo3.1 (n = 10 campos confocais para veículo, n = 24 campos confocais para MG-132). Todos os dados são a média ± S.E.M. Os dados de quantificação de IF (E, H) são representados como gráficos de caixa e bigode. Para E: Ctrl versus FP-CM, ****P = 9,06E – 09 Ctrl versus CHX, ****P = 5,11E-09 FP-CM versus CHX, ns, não significativo (P = 0,21) por análise de variância unilateral (ANOVA) seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey. Para H: Veículo versus MG-132, ****P = 4,46E-11 por Aluno não pareado t teste. Barras de escala, 50 μm (B – D).

Em seguida, queríamos explorar como a placa de piso controlava o nível de proteína do Robo3.1. Porque Robo3.1 o nível de transcrição não diminuiu, mas, em vez disso, aumentou drasticamente nos estágios de cruzamento e pós-cruzamento (E11.5 e E12.5) em comparação com o estágio de pré-cruzamento (E10.5) (8), a eliminação da proteína Robo3.1 não era provável devido à diminuição da transcrição, splicing ou estabilidade de Robo3.1 mRNA. Na verdade, o tratamento de explantes DSC por meio condicionado em placa de piso (FP-CM) não mudou Robo3.1 Níveis de mRNA (Figura Suplementar S1D), que apoiou esta ideia. Nossa hipótese é que existem dois possíveis mecanismos pós-transcricionais que poderiam ser adotados pela placa de piso para eliminar a proteína Robo3.1. Mecanismo 1: a proteína Robo3.1 tem uma meia-vida curta e a tradução contínua é um pré-requisito para manter a repressão do nível da proteína Robo3.1 de sua tradução pode resultar no esgotamento desta proteína rapidamente. Mecanismo 2: a proteína Robo3.1 tem meia-vida longa e não precisa de síntese contínua. A ativação da via de degradação pode levar à sua eliminação.

Para distinguir esses dois modelos, realizamos os seguintes experimentos. Em primeiro lugar, tratamos explantes DSC com inibidor da síntese de proteínas cicloheximida (CHX) e descobrimos que a proteína Robo3.1 em axônios comissurais foi eliminada de forma semelhante como tratamento FP-CM (Figura 1E). Também da mesma forma que FP-CM, o tratamento com CHX não mudou Robo3.1 Níveis de mRNA (Figura Suplementar S1D). Esses resultados implicaram que a placa de piso regulou os níveis do Robo3.1 por meio de regulação translacional. Em segundo lugar, medimos a meia-vida da proteína Robo3.1. O Robo3.1 marcado com HA (hemaglutinina) foi expresso em células COS-7 e o lisado celular foi coletado em diferentes pontos de tempo após o tratamento com CHX. Em seguida, os níveis de proteína Robo3.1 foram medidos por Western Blotting anti-HA. Como mostrado, a proteína Robo3.1 foi eliminada muito mais rapidamente do que a β-Actina quando a síntese de proteínas foi inibida (Figura 1F e G). A meia-vida calculada para a proteína Robo3.1 é 87 ± 4 min, o que classifica o Robo3.1 como uma proteína de vida curta de acordo com os padrões estabelecidos (45, 46). Em terceiro lugar, descobrimos que o tratamento de explantes DSC com MG-132, um inibidor de proteassoma, levou ao acúmulo significativo da proteína Robo3.1 em axônios comissurais sem afetar Robo3.1 níveis de mRNA (Figura 1H e Suplementar S1E), apoiando que Robo3.1 é continuamente sintetizado. Todos juntos, esses dados suportam um modelo de que a proteína Robo3.1 tem uma meia-vida curta e seus níveis são rigidamente controlados por meio de regulação translacional: a tradução contínua mantém os níveis de proteína Robo3.1 no pré-cruzamento e no cruzamento com a repressão dos axônios comissurais de sua tradução por A placa de piso resulta em uma eliminação rápida da proteína Robo3.1, de modo que os axônios comissurais podem sair da placa de piso, tornando-se axônios pós-cruzamento.

O leitor de m 6 A YTHDF1 se liga e controla a tradução de m 6 A modificado Robo3.1 mRNA

Para explorar ainda mais os mecanismos que regulam a proteína Robo3.1 em nível de tradução, testamos o envolvimento de uma modificação importante da regulação pós-transcricional - m 6 A. A modificação m 6 A e seus leitores, incluindo YTHDF1, YTHDF2 e YTHDF3, desempenham papéis importantes na regulação da tradução e estabilidade do mRNA (18-22). O rígido controle translacional de Robo3.1 (Figura 1) nos levou a questionar se isso ocorre por meio do mecanismo de modificação m 6 A. Para testar isso, primeiro verificamos se Robo3.1 mRNA é modificado por m 6 A ou não. Dados de mapeamento de m 6 A publicados no cérebro (26, 28, 29, 31, 33) não nos deram muitas informações sobre a modificação de m 6 A de Robo3.1, provavelmente devido à expressão baixa e restrita de Robo3.1. O preditor de sítio m 6 A de mamífero denominado SRAMP (sbaseado em equência RN / D umadenosina mlocal de etilação predictor) (47) é uma ferramenta poderosa e previu com sucesso locais m 6 A em mRNAs (16). Análise de Robo3.1 O mRNA com o programa SRAMP previu cinco locais m 6 A de alta confiança (Figura 2A e S2A suplementar). Além disso, confirmamos isso por meio de experimentos. Imunoprecipitação anti-m 6 A usando dois anticorpos m 6 A diferentes puxados para baixo Robo3.1 mRNA de RNA da medula espinhal embrionária de camundongo (Figura 2B). A mutação dos locais m 6 A previstos (Figura 2A) resultou em uma perda quase completa da modificação m 6 A em Robo3.1 mRNA, mostrado pela falha em derrubar m 6 A-mutado Robo3.1 mRNA de células COS-7 expressando Robo3.1-MT m6A em comparação com células que expressam Robo3.1-WT (Figura 2C). Esses resultados sugerem que Robo3.1 mRNA é modificado por m 6 A. Para testar se a modificação m 6 A está envolvida na regulação de Robo3.1 tradução, monitoramos os efeitos de derrubar o escritor m 6 A METTL3. Neurônios comissurais espinhais dissociados foram cultivados e, em seguida, infectados com o vírus lenti expressando shMettl3 que levou a uma redução dramática dos níveis de proteína METTL3 em neurônios comissurais em comparação com o controle shRNA (Figura 2D). A queda de METTL3 levou à supressão de Robo3.1 tradução que foi indicada pelo declínio significativo do nível de proteína Robo3.1 em axônios comissurais (Figura 2E e F), sem alteração Robo3.1 Níveis de mRNA (Figura Suplementar S2B). Estes dados indicam que a modificação m 6 A é necessária para Robo3.1 tradução.

Robo3.1 O mRNA é modificado por m 6 A e ligado pelo leitor m 6 A YTHDF1. (UMA) Sites m 6 A previstos em Robo3.1 mRNA pelo programa SRAMP. (B) Anti-m 6 A IP removido Robo3.1 mRNA de RNA de medula espinhal embrionária de camundongo usando dois anticorpos m 6 A diferentes (um mAb e outro pAb) com IgG correspondente como controles. RT-PCR foi realizado para detectar Robo3.1 mRNA em elutos. (C) Verificação de sites m 6 A em Robo3.1 mRNA. Anti-m 6 A IP falhou ao puxar para baixo Robo3.1 mRNA de células COS-7 expressando Robo3.1 com sites m 6 A mutados (Robo3.1-MT m6A ) comparado com Robo3.1-WT. (D) Knockdown de METTL3 em neurônios comissurais. Neurônios comissurais dissociados da medula espinhal dorsal de camundongo E10.5 foram infectados com expressão de vírus lenti shMettl3, marcado pela etiqueta eGFP. Derrubada por shMettl3 por 48 h resultou em diminuição dramática dos níveis de proteína METTL3 nos neurônios, em comparação com shCtrl. (E) Knockdown de METTL3 levou a diminuições significativas dos níveis de proteína Robo3.1 em axônios comissurais em comparação com shCtrl. Barra de escala, 10 μm. (F) Quantificação de Robo3.1 IF relativa a eGFP em (E). Todos os dados são a média ± S.E.M. e são representados como gráficos de caixa e bigode: ****P = 1.18E – 5 (n = 15 axônios para shCtrl n = 19 axônios para shMettl3), por Aluno não pareado t teste. (G) RNA IP (RIP) retirado Robo3.1 mRNA de lisado da medula espinhal embrionária de camundongo com anticorpo YTHDF1, mas não com IgG de controle. (H) Ligação de YTHDF1 com Robo3.1 O mRNA é dependente de m6A. RIP usando o anticorpo YTHDF1 falhou ao puxar para baixo Robo3.1 mRNA de células COS-7 que co-expressam YTHDF1 e Robo3.1 com locais m 6 A mutados (MT m6A ) comparado com WT Robo3.1.

Robo3.1 O mRNA é modificado por m 6 A e ligado pelo leitor m 6 A YTHDF1. (UMA) Sites m 6 A previstos em Robo3.1 mRNA pelo programa SRAMP. (B) Anti-m 6 A IP removido Robo3.1 mRNA de RNA de medula espinhal embrionária de camundongo usando dois anticorpos m 6 A diferentes (um mAb e outro pAb) com IgG correspondente como controles. RT-PCR foi realizado para detectar Robo3.1 mRNA em elutos. (C) Verificação de sites m 6 A em Robo3.1 mRNA. Anti-m 6 A IP falhou ao puxar para baixo Robo3.1 mRNA de células COS-7 expressando Robo3.1 com sites m 6 A mutados (Robo3.1-MT m6A ) comparado com Robo3.1-WT. (D) Knockdown de METTL3 em neurônios comissurais. Neurônios comissurais dissociados da medula espinhal dorsal de camundongo E10.5 foram infectados com expressão de vírus lenti shMettl3, marcado pela etiqueta eGFP. Derrubada por shMettl3 por 48 h resultou em diminuição dramática dos níveis de proteína METTL3 nos neurônios, em comparação com shCtrl. (E) Knockdown de METTL3 levou a diminuições significativas dos níveis de proteína Robo3.1 em axônios comissurais em comparação com shCtrl. Barra de escala, 10 μm. (F) Quantificação de Robo3.1 IF relativa a eGFP em (E). Todos os dados são a média ± S.E.M. e são representados como gráficos de caixa e bigode: ****P = 1.18E – 5 (n = 15 axônios para shCtrl n = 19 axônios para shMettl3), por Aluno não pareado t teste. (G) RNA IP (RIP) retirado Robo3.1 mRNA de lisado da medula espinhal embrionária de camundongo com anticorpo YTHDF1, mas não com IgG de controle. (H) Ligação de YTHDF1 com Robo3.1 O mRNA é dependente de m6A. RIP usando anticorpo YTHDF1 falhou em puxar para baixo Robo3.1 mRNA de células COS-7 que co-expressam YTHDF1 e Robo3.1 com locais m 6 A mutados (MT m6A ) comparado com WT Robo3.1.

Continuamos a testar se m 6 A-modificado Robo3.1 O mRNA pode ser reconhecido e vinculado por leitores m 6A. Imunoprecipitação de RNA (RIP) de lisado da medula espinhal embrionária de camundongo com anticorpo YTHDF1 detectado Robo3.1 mRNA, mas não com IgG de controle (Figura 2G). Experimentos RIP realizados em células COS-7 que coexpressam YTHDF1 e WT Robo3.1 (Robo3.1-WT) detectou Robo3.1 mRNA, mas não com m 6 A-mutado Robo3.1 (Robo3.1-MT m6A ) (Figura 2H Figura Suplementar S2C), sugerindo que a ligação de YTHDF1 com Robo3.1 O mRNA é dependente de m6A.

Foi demonstrado que YTHDF1 aumenta a eficiência translacional de mRNAs modificados com m 6 A (19). Portanto, queríamos saber se YTHDF1 poderia regular a tradução de Robo3.1. A co-transfecção de pCS2-HA-Robo3.1-WT com pCAGGS-Ythdf1-IRES-eGFP em células COS-7 levou a um aumento dramático dos níveis de proteína Robo3.1 em comparação com o controle pCAGGS-IRES-eGFP (Figura 3A e B ), sem afetar Robo3.1 Níveis de mRNA (Figura Suplementar S3A), sugerindo que YTHDF1 pode melhorar a tradução de Robo3.1. Experimentos semelhantes foram feitos usando pCAGGS-YTHDF2-IRES-eGFP que não mostrou regulação positiva da tradução de Robo3.1 por YTHDF2 (Figura Suplementar S3B e C), sugerindo regulação translacional de Robo3.1 é um mecanismo específico de YTHDF1. Curiosamente, esta regulação positiva de Robo3.1 a tradução por YTHDF1 foi perdida quando os locais m6A previstos foram mutados em Robo3.1 (pCS2-HA-Robo3.1-MT m6A) (Figura 3A e B), indicando que esta regulação translacional é dependente de m6A. Para confirmar ainda que a regulação positiva do nível de proteína Robo3.1 por YTHDF1 é mediada por controle de tradução, usamos CHX para inibir a síntese de Robo3.1, o que resultou em uma diminuição do nível de proteína Robo3.1 em células HEK293T que expressam HA-Robo3.1 ( Figura 3C e D, as duas primeiras condições sem YTHDF1). Inibição semelhante da síntese de HA-Robo3.1 por CHX foi encontrada em células que co-expressam YTHDF1 (Figura 3C e D, as duas últimas condições com YTHDF1), sugerindo que YTHDF1 de fato aumenta os níveis de proteína Robo3.1 por meio do controle translacional, mas não outro mecanismos como afetar a estabilidade da proteína Robo3.1, ou Robo3.1 Estabilidade do mRNA (Figura Suplementar S3D).

O leitor m 6 A YTHDF1 controla a tradução de Robo3.1 mRNA de uma maneira dependente de m 6 A. (UMA) YTHDF1 pode melhorar a tradução de Robo3.1. A co-expressão de WT Robo3.1 com YTHDF1 em células COS-7 resultou em um aumento dramático do nível de proteína Robo3.1 por IF, em comparação com um vetor vazio expressando apenas eGFP. No entanto, YTHDF1 não conseguiu aumentar a tradução de Robo3.1 com locais m 6 A mutados (Robo3.1-MT m6A ) Barra de escala, 25 μm. (B) Quantificação de Robo3.1 IF relativa a eGFP em (A). (C) A análise de Western blotting mostrando a regulação dos níveis de proteína Robo3.1 por YTHDF1 é através do controle translacional. O inibidor da síntese de proteínas CHX bloqueou a tradução de Robo3.1 em células HEK293T que expressam HA-Robo3.1. Efeitos semelhantes foram encontrados com células que co-expressam HA-Robo3.1 e YTHDF1. (D) Quantificação dos níveis relativos de HA-Robo3.1 para β-actina em (C). Todos os dados são a média ± S.E.M. Os dados de quantificação de IF (B) são representados como gráficos de caixa e bigode: ***P = 5.11E – 04, ‘Robo3.1-WT + IRES-eGFP’ (n = 16 células) versus ‘Robo3.1-WT + Ythdf1-IRES-eGFP’ (n = 17 células) ns, não significativo (P = 0.41), ‘Robo3.1-WT + IRES-eGFP’ (n = 15 células) vsRobo3.1-MT m6A + Ythdf1-IRES-eGFP’ (n = 18 células) por análise de variância unilateral (ANOVA) seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey. Dados de quantificação WB (D, n = 3 repetições) são representados como gráficos de pontos: **P = 0,002 (‘HA-Robo3.1’ versus ‘HA-Robo3.1 + CHX’) **P = 0,002 (‘HA-Robo3.1’ versus ‘HA-Robo3.1 + YTHDF1’) ***P = 1.41E-04 (‘HA-Robo3.1 + YTHDF1’ versus ‘HA-Robo3.1 + YTHDF1 + CHX’) por análise de variância unilateral (ANOVA) seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey.

O leitor m 6 A YTHDF1 controla a tradução de Robo3.1 mRNA de uma maneira dependente de m 6 A. (UMA) YTHDF1 pode melhorar a tradução de Robo3.1. A co-expressão de WT Robo3.1 com YTHDF1 em células COS-7 resultou em um aumento dramático do nível de proteína Robo3.1 por IF, em comparação com um vetor vazio expressando apenas eGFP. No entanto, YTHDF1 não conseguiu aumentar a tradução de Robo3.1 com sites m 6 A mutados (Robo3.1-MT m6A ) Barra de escala, 25 μm. (B) Quantificação de Robo3.1 IF relativa a eGFP em (A). (C) A análise de Western blotting mostrando a regulação dos níveis de proteína Robo3.1 por YTHDF1 é através do controle translacional. O inibidor da síntese de proteínas CHX bloqueou a tradução de Robo3.1 em células HEK293T que expressam HA-Robo3.1. Efeitos semelhantes foram encontrados com células que co-expressam HA-Robo3.1 e YTHDF1. (D) Quantificação dos níveis relativos de HA-Robo3.1 para β-actina em (C). Todos os dados são a média ± S.E.M. Os dados de quantificação de IF (B) são representados como gráficos de caixa e bigode: ***P = 5.11E – 04, ‘Robo3.1-WT + IRES-eGFP’ (n = 16 células) versus ‘Robo3.1-WT + Ythdf1-IRES-eGFP’ (n = 17 células) ns, não significativo (P = 0.41), ‘Robo3.1-WT + IRES-eGFP’ (n = 15 células) vsRobo3.1-MT m6A + Ythdf1-IRES-eGFP’ (n = 18 células) por análise de variância unilateral (ANOVA) seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey. Dados de quantificação WB (D, n = 3 repetições) são representados como gráficos de pontos: **P = 0,002 (‘HA-Robo3.1’ versus ‘HA-Robo3.1 + CHX’) **P = 0,002 (‘HA-Robo3.1’ versus ‘HA-Robo3.1 + YTHDF1’) ***P = 1.41E-04 (‘HA-Robo3.1 + YTHDF1’ versus ‘HA-Robo3.1 + YTHDF1 + CHX’) por análise de variância unilateral (ANOVA) seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey.

Juntos, esses dados apóiam que Robo3.1 O mRNA é modificado por m 6 A, e reconhecido e ligado por YTHDF1 que pode aumentar sua tradução.

YTHDF1 regula a tradução de endógenos Robo3.1 em neurônios comissurais e a expressão de YTHDF1 é controlada pela placa de piso

Em seguida, testamos se YTHDF1 poderia regular a tradução de endógenos Robo3.1 em neurônios comissurais. Neurônios comissurais espinhais dissociados foram cultivados e, em seguida, infectados com vírus lenti derrubando ou superexpressando Ythdf1 (Figura 4A– F). Derrubando YTHDF1 com dois shRNAs contra Ythdf1 (shYtdhf1-2 e shYthdf1-3) resultou em diminuição dramática dos níveis de proteína YTHDF1 em neurônios comissurais em comparação com o controle shRNA (Figura 4A). Porque Robo3.1 mRNA não foi detectado em axônios comissurais e não traduzido localmente em axônios (10), a regulação de Robo3.1 a tradução ocorrerá no soma neuronal e a proteína Robo3.1 será transportada para os axônios para exercer suas funções. Em seguida, monitoramos os níveis de proteína Robo3.1 em axônios comissurais. A queda de YTHDF1 levou à supressão de Robo3.1 tradução que foi indicada pelo declínio significativo do nível de proteína Robo3.1 em axônios comissurais (Figura 4B e C), com Robo3.1 Os níveis de mRNA não foram afetados (Figura Suplementar S4A). A superexpressão de YTHDF1 em neurônios comissurais (Figura 4D) levou a aumentos significativos dos níveis de proteína Robo3.1 (Figura 4E e F), sem alterar Robo3.1 Níveis de mRNA (Figura Suplementar S4B). Estes resultados sugerem que YTHDF1 pode melhorar a tradução de endógenos Robo3.1 em neurônios comissurais.

YTHDF1 regula a tradução de endógenos Robo3.1 em neurônios comissurais e é controlada pela placa de assoalho. (UMA) Knockdown de YTHDF1 em neurônios comissurais. Neurônios comissurais dissociados da medula espinhal de camundongo E10.5 foram infectados com expressão de vírus lenti shYthdf1-2 e shYthdf1-3, respectivamente, e marcados com o rótulo eGFP. Derrubada por shYthdf1 por 48 h resultou em diminuição dramática dos níveis de proteína YTHDF1 em axônios comissurais, em comparação com shCtrl. (B) Knockdown de YTHDF1 levou a diminuições significativas dos níveis de proteína Robo3.1 em axônios comissurais em comparação com shCtrl. (C) Quantificação de Robo3.1 IF relativa a eGFP em (B). n = 16 axônios para shCtrl n = 17 axônios para shYthdf1-2 n = 16 axônios para shYthdf1-3. (D) Superexpressão de YTHDF1 em neurônios comissurais. Neurônios comissurais dissociados da medula espinhal de camundongo E10.5 foram infectados com vírus lenti expressando YTHDF1, marcado por marcação eGFP. A superexpressão de YTHDF1 resultou em aumento dramático dos níveis de proteína YTHDF1 em axônios comissurais, em comparação com o controle. (E) A superexpressão de YTHDF1 levou a aumentos significativos dos níveis de proteína Robo3.1 em axônios comissurais em comparação com eGFP ao controle. (F) Quantificação de Robo3.1 IF relativa a eGFP em (E). n = 14 axônios para IRES-eGFP n = 16 axônios para Ythdf1-IRES-eGFP. (G) Regulação da expressão de YTHDF1 por placa de piso. Explantes DSC de medulas espinhais embrionárias de camundongo E10.5 foram cultivados com FP-CM ou Ctrl-CM. A análise de WB foi realizada para medir os níveis de proteína YTHDF1. (H) Quantificação de sinais WB em (G). Todos os dados são a média ± S.E.M. Os dados de quantificação de IF (C, F) são representados como gráficos de caixa e bigode: Para C, ****P = 8.05E-7 (shYthdf1-2 contra shCtrl), ****P = 3,83E-7 (shYthdf1-3 contra shCtrl), ns, não significativo (P = 0.76, shYthdf1-2 contra shYthdf1-3) para F, ****P = 3,35E – 6 por Aluno não pareado t teste. Dados de quantificação WB (H, n = 5 réplicas) são representados como gráficos de pontos: ****P = 1,68E – 8 por alunos emparelhados t teste. Barras de escala, 10 μm (B e E).

YTHDF1 regula a tradução de endógenos Robo3.1 em neurônios comissurais e é controlada pela placa de piso. (UMA) Knockdown de YTHDF1 em neurônios comissurais. Neurônios comissurais dissociados da medula espinhal de camundongo E10.5 foram infectados com o vírus lenti expressando shYthdf1-2 e shYthdf1-3, respectivamente, e marcados com o rótulo eGFP. Derrubada por shYthdf1 por 48 h resultou em diminuição dramática dos níveis de proteína YTHDF1 em axônios comissurais, em comparação com shCtrl. (B) Knockdown de YTHDF1 levou a diminuições significativas dos níveis de proteína Robo3.1 em axônios comissurais em comparação com shCtrl. (C) Quantificação de Robo3.1 IF relativa a eGFP em (B). n = 16 axônios para shCtrl n = 17 axônios para shYthdf1-2 n = 16 axônios para shYthdf1-3. (D) Superexpressão de YTHDF1 em neurônios comissurais. Neurônios comissurais dissociados da medula espinhal de camundongo E10.5 foram infectados com vírus lenti expressando YTHDF1, marcado por marcação eGFP. A superexpressão de YTHDF1 resultou em aumento dramático dos níveis de proteína YTHDF1 em axônios comissurais, em comparação com o controle. (E) A superexpressão de YTHDF1 levou a aumentos significativos dos níveis de proteína Robo3.1 em axônios comissurais em comparação com eGFP ao controle. (F) Quantificação de Robo3.1 IF relativa a eGFP em (E). n = 14 axônios para IRES-eGFP n = 16 axônios para Ythdf1-IRES-eGFP. (G) Regulação da expressão de YTHDF1 por placa de piso. Explantes DSC de medulas espinhais embrionárias de camundongo E10.5 foram cultivados com FP-CM ou Ctrl-CM. A análise de WB foi realizada para medir os níveis de proteína YTHDF1. (H) Quantificação de sinais WB em (G). Todos os dados são a média ± S.E.M. Os dados de quantificação de IF (C, F) são representados como gráficos de caixa e bigode: Para C, ****P = 8.05E-7 (shYthdf1-2 contra shCtrl), ****P = 3,83E-7 (shYthdf1-3 contra shCtrl), ns, não significativo (P = 0.76, shYthdf1-2 contra shYthdf1-3) para F, ****P = 3,35E – 6 por Aluno não pareado t teste. Dados de quantificação WB (H, n = 5 réplicas) são representados como gráficos de pontos: ****P = 1,68E – 8 por alunos emparelhados t teste. Barras de escala, 10 μm (B e E).

A placa de piso pode eliminar a proteína Robo3.1 dos axônios comissurais pós-cruzamento por meio da regulação translacional (Figura 1 e S1 suplementar). O leitor de m 6 A YTHDF1 poderia melhorar a tradução de Robo3.1 em neurônios comissurais (Figura 4A-F e Figura Suplementar S4). Esses resultados nos levaram a hipotetizar que a placa de piso pode diminuir a regulação de YTHDF1 para controlar negativamente Robo3.1 tradução. Para testar isso, nós cultivamos neurônios DSC dissociados e, em seguida, os tratamos com meio condicionado por placa de piso (FP-CM). Como mostrado na Figura 4G e H, o tratamento com FP-CM reduziu significativamente os níveis de proteína YTHDF1 em comparação com Ctrl-CM. Consistente com estes resultados, a expressão endógena de YTHDF1 mostrou queda contínua dos estágios de pré-cruzamento para pós-cruzamento (Figura Suplementar S4C e D). Estes dados suportam um mecanismo que o (s) sinal (es) derivado (s) da placa de piso regulam negativamente a expressão de YTHDF1 para inibir Robo3.1 tradução em axônios comissurais pós-cruzamento.

A proteína Robo3.1 é reduzida e a orientação do axônio é perturbada em Ythdf1- neurônios comissurais deficientes

A fim de confirmar fisiologicamente os mecanismos que YTHDF1 regula Robo3.1 tradução, nós geramos Ythdf1 Camundongos cKO (Figura 5A). Ythdf1 fl / fl mouse foi validado usando Wnt1-Cre camundongo (48) por imunocoloração anti-YTHDF1 (Figura 5B). Conforme mostrado na Figura 5B, YTHDF1 é amplamente expresso em toda a medula espinhal de Ythdf1 fl / fl embriões e é eliminado de forma eficiente na medula espinhal dorsal de Wnt1-Cre + /- Ythdf1 fl / fl embriões. No entanto, a expressão onipresente de YTHDF1 na medula espinhal e a expressão de ampla gama de Wnt1-Cre na medula espinhal dorsal levantam a possibilidade de que o desenvolvimento embrionário da medula espinhal e o padrão neural possam ser perturbados em Wnt1-Cre-derivado Ythdf1 embriões cKO. Para evitar isso, usamos Atoh1-Cre mouse para ablação específica Ythdf1 de neurônios comissurais espinhais (consulte a Figura Suplementar S1A para especificidade de Atoh1-Cre). Atoh1-Cre conduz a recombinação mediada por Cre em neurônios comissurais pós-mitóticos (49), o que torna possível determinar as funções de YTHDF1 em Robo3.1 regulação translacional e orientação do axônio comissural sem perturbar a especificação neuronal na medula espinhal. Perda de YTHDF1 de Atoh1-Cre + soma neuronal comissural que foi indicada por um Rosa26-YFP repórter foi validado (Figura 5C). O nível de proteína Robo3.1 foi significativamente reduzido em axônios comissurais crescendo a partir de Ythdf1-explantes de DSC deficientes em comparação com controles de ninhada (Figura 5D e E). Robo3.1 O nível de mRNA não foi afetado na medula espinhal de Ythdf1 Embriões cKO (Figura Suplementar S5A).Estes resultados demonstram que a proteína Robo3.1, mas não Robo3.1 mRNA é reduzido na medula espinhal de Ythdf1 embriões cKO, que são consistentes com o em vitro dados, sugerindo que YTHDF1 regula fisiologicamente Robo3.1 tradução.

Ablação específica de Ythdf1 dos neurônios comissurais dorsais resulta na diminuição do nível de proteína Robo3.1. (UMA) Desenhos esquemáticos são mostrados para a estratégia de exclusão genética para Ythdf1. O exon 4 que contém a sequência de codificação do domínio YTH é excluído após a recombinação mediada por Cre. (B) Depleção da proteína YTHDF1 na medula espinhal dorsal de Wnt1-Cre +/- Ythdf1 fl / fl embriões de camundongos cKO. A imunocoloração anti YTHDF1 de seções da medula espinhal E11.5 confirmou cKO da proteína YTHDF1 da medula espinhal dorsal e gânglios da raiz dorsal (DRG), ilustrados por asteriscos. (C) Ablação específica da proteína YTHDF1 de neurônios comissurais Atoh1-Cre +. A imunocoloração anti YTHDF1 de seções da medula espinhal E11.5 confirmou cKO da proteína YTHDF1 em YFP + neurônios comissurais em Atoh1-Cre + / - Rosa26-YFP + / - Ythdf1 fl / fl embriões de camundongos cKO, enquanto a expressão de YTHDF1 estava intacta em Atoh1-Cre + / - Rosa26-YFP + / - embriões de controle. (D) Ythdf1 cKO com Atoh1-Cre levou a uma redução dramática da proteína Robo3.1 dos axônios comissurais dorsais. Explantes DSC pré-cruzamento E10.5 foram dissecados e cultivados em vitro. Anti-Robo3.1 IF mostrou declínio significativo do nível de proteína Robo3.1 em axônios comissurais positivos para TAG1 (TSA). Imagens representativas são mostradas a partir de oito Ythdf1 fl / fl e nove Atoh1-Cre + / - Ythdf1 fl / fl embriões, respectivamente. (E) Quantificação de Robo3.1 IF em axônios comissurais de explantes cultivados de DSC de Ythdf1 Embriões de camundongos cKO e seus controles de companheiros de ninhada. Todos os dados são a média ± S.E.M. e representados como gráficos de caixa e bigode: Ythdf1 fl / fl (n = 30 campos confocais) versus Atoh1-Cre + / - Ythdf1 fl / fl (n = 47 campos confocais), **P = 0,0014 por Aluno não pareado t teste. Barras de escala, 100 μm (B e D) e 10 μm (C).

Ablação específica de Ythdf1 dos neurônios comissurais dorsais resulta na diminuição do nível de proteína Robo3.1. (UMA) Desenhos esquemáticos são mostrados para a estratégia de exclusão genética para Ythdf1. O exon 4 que contém a sequência de codificação do domínio YTH é excluído após a recombinação mediada por Cre. (B) Depleção da proteína YTHDF1 na medula espinhal dorsal de Wnt1-Cre +/- Ythdf1 fl / fl embriões de camundongos cKO. A imunocoloração anti YTHDF1 de seções da medula espinhal E11.5 confirmou cKO da proteína YTHDF1 da medula espinhal dorsal e gânglios da raiz dorsal (DRG), ilustrados por asteriscos. (C) Ablação específica da proteína YTHDF1 de neurônios comissurais Atoh1-Cre +. A imunocoloração anti YTHDF1 de seções da medula espinhal E11.5 confirmou cKO da proteína YTHDF1 em YFP + neurônios comissurais em Atoh1-Cre + / - Rosa26-YFP + / - Ythdf1 fl / fl embriões de camundongos cKO, enquanto a expressão de YTHDF1 estava intacta em Atoh1-Cre + / - Rosa26-YFP + / - embriões de controle. (D) Ythdf1 cKO com Atoh1-Cre levou a uma redução dramática da proteína Robo3.1 dos axônios comissurais dorsais. Explantes DSC pré-cruzamento E10.5 foram dissecados e cultivados em vitro. Anti-Robo3.1 IF mostrou declínio significativo do nível de proteína Robo3.1 em axônios comissurais positivos para TAG1 (TSA). Imagens representativas são mostradas a partir de oito Ythdf1 fl / fl e nove Atoh1-Cre + / - Ythdf1 fl / fl embriões, respectivamente. (E) Quantificação de Robo3.1 IF em axônios comissurais de explantes cultivados de DSC de Ythdf1 Embriões de camundongos cKO e seus controles de companheiros de ninhada. Todos os dados são a média ± S.E.M. e representados como gráficos de caixa e bigode: Ythdf1 fl / fl (n = 30 campos confocais) versus Atoh1-Cre + / - Ythdf1 fl / fl (n = 47 campos confocais), **P = 0,0014 por Aluno não pareado t teste. Barras de escala, 100 μm (B e D) e 10 μm (C).

A perda de função do Robo3.1 levou a defeitos na orientação do axônio comissural pré-cruzamento (8). O fato de que a proteína Robo3.1 é reduzida em comissural Ythdf1embriões deficientes nos levaram a testar se a orientação do axônio pré-cruzamento foi perturbada nesses embriões. A imunocoloração de TAG1, um marcador de axônio comissural pré-cruzamento em seções da medula espinhal mostrou que havia significativamente mais axônios comissurais projetando erroneamente para a coluna motora em Ythdf1 Embriões cKO comparados com seus controles de ninhada (Figura 6A e B). Uma análise mais aprofundada usando a rotulagem DiI em livro aberto da medula espinhal mostrou que a ablação de Ythdf1 de neurônios comissurais causaram defeitos de orientação de axônios pré-cruzamento, que foram indicados por muitos giros prematuros anormais e paralisação de axônios pré-cruzamento em Ythdf1 embriões cKO em comparação com seus controles de ninhada (Figura 6C-E). Como controles, confirmamos que a padronização da medula espinhal e o desenvolvimento de neurônios comissurais dI1 não foram afetados em Ythdf1 Embriões cKO (Figura Suplementar S5B-I).

Ythdf1 Os embriões cKO exibem defeitos na orientação do axônio comissural pré-cruzamento. (UMA) Má projeção de axônios comissurais de pré-cruzamento em colunas motoras em Ythdf1 embriões cKO. TAG1 marca axônios comissurais em seções embrionárias E11.5 e há significativamente mais axônios de projeção incorreta em colunas motoras (pontas de seta) em Ythdf1 Embriões cKO comparados com seus controles de ninhada. Imagens representativas são mostradas a partir de três Ythdf1 fl / fl e três Atoh1-Cre +/- Ythdf1 fl / fl embriões, respectivamente. (B) Quantificação de axônios comissurais que se intrometem nas colunas motoras. Todos os dados são a média ± S.E.M. e representados como gráficos de caixa e bigode: Ythdf1 fl / fl (n = 15 seções) versus Atoh1-Cre +/- Ythdf1 fl / fl (n = 12 seções), **P = 0,0096 por Aluno não pareado t teste. (C e D) Traçado de DiI de axônios comissurais com preparações de livro aberto. Defeitos de orientação de axônio pré-cruzamento, incluindo parada (pontas de seta) e viragem pré-cruzamento (setas) foram observados em Ythdf1 embriões cKO. Imagens representativas de E10.5-11 (C) e E11.5 (D) foram mostradas. (E) Quantificação de fenótipos em (C e D). Total de 31 injeções DiI com quatro Ythdf1 fl / fl embriões e 40 injeções DII com três Atoh1-Cre +/- Ythdf1 fl / fl embriões foram analisados. A porcentagem de observações com fenótipos foi calculada. Observe que a porcentagem somada para Atoh1-Cre +/- Ythdf1 fl / fl é & gt100 porque algumas das injeções DII foram encontradas com fenótipos de viragem de parada e pré-cruzamento. Barras de escala, 50 μm (A, C e D).

Ythdf1 Os embriões cKO exibem defeitos na orientação do axônio comissural pré-cruzamento. (UMA) Má projeção de axônios comissurais de pré-cruzamento em colunas motoras em Ythdf1 embriões cKO. TAG1 marca axônios comissurais em seções embrionárias E11.5 e há significativamente mais axônios de projeção incorreta em colunas motoras (pontas de seta) em Ythdf1 Embriões cKO comparados com seus controles de ninhada. Imagens representativas são mostradas a partir de três Ythdf1 fl / fl e três Atoh1-Cre +/- Ythdf1 fl / fl embriões, respectivamente. (B) Quantificação de axônios comissurais que se intrometem nas colunas motoras. Todos os dados são a média ± S.E.M. e representados como gráficos de caixa e bigode: Ythdf1 fl / fl (n = 15 seções) versus Atoh1-Cre +/- Ythdf1 fl / fl (n = 12 seções), **P = 0,0096 por Aluno não pareado t teste. (C e D) Traçado de DiI de axônios comissurais com preparações de livro aberto. Defeitos de orientação de axônio pré-cruzamento, incluindo parada (pontas de seta) e viragem pré-cruzamento (setas) foram observados em Ythdf1 embriões cKO. Imagens representativas de E10.5-11 (C) e E11.5 (D) foram mostradas. (E) Quantificação de fenótipos em (C e D). Total de 31 injeções DiI com quatro Ythdf1 fl / fl embriões e 40 injeções DII com três Atoh1-Cre +/- Ythdf1 fl / fl embriões foram analisados. A porcentagem de observações com fenótipos foi calculada. Observe que a porcentagem somada para Atoh1-Cre +/- Ythdf1 fl / fl é & gt100 porque algumas das injeções DII foram encontradas com fenótipos de viragem de parada e pré-cruzamento. Barras de escala, 50 μm (A, C e D).

Tomados em conjunto, esses resultados sugerem que YTHDF1 pode regular fisiologicamente Robo3.1 tradução e, conseqüentemente, controle de orientação de axônios comissurais pré-cruzamento na medula espinhal embrionária.


Especificando a localização do ramo do axônio

Ramos podem se formar em terminais nervosos ou intersticialmente ao longo de eixos axonais, dependendo de onde os ramos são iniciados. Vários mecanismos que especificam a localização da ramificação surgiram de estudos recentes dos fatores extracelulares envolvidos na ramificação (Fig. 5).

Sinais derivados do alvo atuando nos terminais do axônio

A maioria dos ramos axonais se forma em terminais nervosos em suas regiões-alvo, como exemplificado pelos axônios periféricos e centrais dos neurônios sensoriais no GRD (ver Fig. 3). Os arbores terminais desses neurônios se desenvolvem depois que os axônios atingem seus alvos, como o tecido periférico da pele ou os motoneurônios centrais da medula espinhal. Vários fatores derivados do alvo foram encontrados para fornecer sinais instrutivos que especificam onde um axônio se arborizará.

Um desses sinais é o fator de crescimento do nervo (NGF), o primeiro fator neurotrófico (ver Glossário, Caixa 1) implicado por atuar como um sinal derivado do alvo da pele para promover a ramificação terminal dos axônios sensoriais no tecido periférico (Kennedy e Tessier -Lavigne, 1995). Para separar seu papel na sobrevivência celular da ramificação do axônio, uma dupla deleção de Ngf e Bax foi criado para bloquear a morte celular programada em camundongos (Patel et al., 2000). Neste mutante, as projeções periféricas atingem seus alvos de pele, mas não conseguem inervá-los e arborizar. Embora este fenótipo possa refletir a função do NGF no crescimento do axônio, estudos de Bax - / - neurônios em cultura, nos quais sobrevivem na ausência de fatores neurotróficos, mas não desenvolvem uma morfologia ramificada, indicam que o alongamento e arborização do ramo dependem do NGF e de outros fatores neurotróficos, como a neurotrofina 3 (NT3 também conhecido como NTF3) (Lentz et al. ., 1999). Esta noção é ainda apoiada pela reduzida arborização sensorial no tecido periférico em camundongos que não possuem o receptor de NGF de baixa afinidade p75 (também conhecido como NGFR) (Bentley e Lee, 2000).

Desenvolvimento de ramos axonais topográficos específicos no sistema visual. (UMA) A formação do mapa retinotópico é regulada pelas interações dos gradientes efrina A / EphA. Para preservar as informações espaciais recebidas na retina (círculo amarelo), os axônios das células ganglionares da retina (RGC) projetam-se para a zona terminal (TZ, círculo azul) de seu alvo cortical (oval roxo) de forma topográfica para formar o mapa retinotópico . Em mamíferos, o alvo é o colículo superior (SC), enquanto em Xenopus, pintinho e peixe-zebra é o tectum óptico (OT). O mapa retinotópico se forma por meio da interação repulsiva da efrina A, que é expressa na estrutura alvo, e dos receptores EphA, que são expressos nos axônios RGC em crescimento. Conforme mostrado nos gradientes à esquerda, os EphAs são expressos em um gradiente nasal-temporal crescente (N-T) na retina, enquanto os ligantes de efrina A são expressos em um gradiente anterior-posterior (A-P) crescente no alvo cortical. Outros gradientes de sinalização, incluindo a sinalização reversa efrina A / EphA (lado direito), bem como efrina B / EphB (superior e inferior), também são mostrados aqui e contribuem para a ramificação do axônio RGC. (B) O desenvolvimento da árvore terminal RGC ocorre por meio de várias etapas em embriões de pintinho e camundongo. (uma) Os axônios RGC inicialmente ultrapassam o TZ correto e os ramos intersticiais se formam ao longo do eixo A-P do axônio. (b) A formação de ramos aumenta no TZ específico topográfico correto, um processo que é regulado pelos gradientes opostos de efrina A / EphA e pela expressão global do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF). (c) Os axônios superestendidos então se retraem para o TZ correto, e os ramos são preferencialmente guiados para o TZ, possivelmente por meio de um gradiente EphB no eixo dorsal-ventral (DV) da retina e um gradiente de efrina B no eixo médio-lateral (LM) de o alvo. (d) Um processo dependente da atividade elimina então os ramos fora do TZ correto, ao mesmo tempo que mantém os ramos posicionados corretamente. As figuras são modificadas com permissão (McLaughlin e O'Leary, 2005).

Desenvolvimento de ramos axonais topográficos específicos no sistema visual. (UMA) A formação do mapa retinotópico é regulada pelas interações dos gradientes efrina A / EphA. Para preservar a informação espacial recebida na retina (círculo amarelo), os axônios das células ganglionares da retina (RGC) projetam-se para a zona terminal (TZ, círculo azul) de seu alvo cortical (oval roxo) de forma topográfica para formar o mapa retinotópico . Em mamíferos, o alvo é o colículo superior (SC), enquanto em Xenopus, pintinho e peixe-zebra é o tectum óptico (OT). O mapa retinotópico se forma por meio da interação repulsiva da efrina A, que é expressa na estrutura alvo, e dos receptores EphA, que são expressos nos axônios RGC em crescimento. Conforme mostrado nos gradientes à esquerda, os EphAs são expressos em um gradiente nasal-temporal crescente (N-T) na retina, enquanto os ligantes de efrina A são expressos em um gradiente anterior-posterior (A-P) crescente no alvo cortical. Outros gradientes de sinalização, incluindo a sinalização reversa efrina A / EphA (lado direito), bem como efrina B / EphB (superior e inferior), também são mostrados aqui e contribuem para a ramificação do axônio RGC. (B) O desenvolvimento da árvore terminal RGC ocorre por meio de várias etapas em embriões de pintinho e camundongo. (uma) Os axônios RGC inicialmente ultrapassam o TZ correto e os ramos intersticiais se formam ao longo do eixo A-P do axônio. (b) A formação de ramos aumenta no TZ específico topográfico correto, um processo que é regulado pelos gradientes opostos de efrina A / EphA e pela expressão global do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF). (c) Os axônios superestendidos então se retraem para o TZ correto, e os ramos são preferencialmente guiados para o TZ, possivelmente por meio de um gradiente EphB no eixo dorsal-ventral (DV) da retina e um gradiente de efrina B no eixo médio-lateral (LM) de o alvo. (d) Um processo dependente da atividade elimina então os ramos fora do TZ correto, ao mesmo tempo que mantém os ramos posicionados corretamente. As figuras são modificadas com permissão (McLaughlin e O'Leary, 2005).

Um papel do NGF na ramificação do axônio também foi demonstrado em neurônios do gânglio simpático (ver Glossário, Quadro 1). Sua exclusão em um Bax O background de camundongo nulo resulta na inervação reduzida de uma variedade de alvos simpáticos devido à ramificação axonal deficiente (Glebova e Ginty, 2004). Muitos desses fenótipos são dependentes do alvo, e nem todos os alvos simpáticos têm o mesmo grau de inervação reduzida, indicando a presença de outros fatores de ramificação do axônio. Um estudo recente sugere que o WNT5A pode ser um bom candidato para mediar a ramificação induzida por NGF (Bodmer et al., 2009).

Outra proteína da família Wnt, WNT3, foi implicada na regulação da ramificação terminal central de neurônios sensoriais proprioceptivos na medula espinhal de camundongo (Krylova et al., 2002). Esses terminais fazem sinapses com motoneurônios na medula espinhal ventral, onde Wnt3 é expresso (Krylova et al., 2002). O crescimento de neurônios DRG embrionários dissociados de camundongo na presença de meio condicionado por WNT3 ou próximo a explantes da medula espinhal de camundongo ventral aumenta o número de ramos secundários e de ordem superior, revelando o papel potencial de WNT3 como um sinal derivado de alvo que especifica a localização de arborização terminal.

Além disso, fatores no tecido-alvo também podem regular a localização da bifurcação (Fig. 5A). Conforme discutido acima, o CNP é expresso na medula espinhal dorsal do camundongo no momento em que os axônios sensoriais atingem inicialmente o DREZ (Schmidt et al., 2009 Zhao e Ma, 2009) e, portanto, fornece uma pista local neste alvo intermediário para especificar o localização da bifurcação dos axônios sensoriais (Fig. 4). É interessante notar que apenas dois ramos se formam aqui, em vez dos arbores exuberantes encontrados nos terminais do axônio DRG maduro, indicando que o CNP pode atuar de forma diferente para outras pistas derivadas do alvo ou que outros fatores estão presentes para restringir o número de ramos formados.

Indução local ao longo do axônio

Fatores de tecidos locais podem fornecer uma pista instrutiva para promover a formação de ramos ao longo do axônio (Fig. 5B). Isso foi demonstrado pela primeira vez pelo estudo de axônios que se projetam da camada cinco do córtex do rato para seus alvos subcorticais por meio da formação de ramos colaterais (O'Leary e Terashima, 1988). Os tecidos-alvo parecem secretar um fator difusível atraente que promove a formação de ramos (Heffner et al., 1990 Sato et al., 1994).

Outro exemplo de ramificação induzida localmente é o desenvolvimento de colaterais sensoriais que brotam das projeções ascendentes e descendentes (ver Fig. 3B). Durante o desenvolvimento inicial da medula espinhal, esses ramos não se formam imediatamente após a bifurcação das aferências sensoriais (Mirnics e Koerber, 1995b Ozaki e Snider, 1997), em vez disso, há um atraso de 2 dias antes do surgimento das colaterais. Estudos in vitro sugerem que fatores estão presentes na medula espinhal que podem ser regulados positivamente para estimular diretamente a formação dessas colaterais (Wang et al., 1999).

Desenvolvimento da ramificação do axônio sensorial na medula espinhal. As seções transversais esquemáticas de uma medula espinhal de vertebrado em desenvolvimento ilustram três formas de ramificação dos axônios sensoriais do gânglio da raiz dorsal (DRG) (Davis et al., 1989 Mendelson et al., 1992 Mirnics e Koerber, 1995a Mirnics e Koerber, 1995b Ozaki e Snider, 1997 Ramon y Cajal, 1904). (UMA) O DRG flanqueia a medula espinhal e contém os corpos celulares (círculo vermelho) dos neurônios sensoriais que inicialmente geram dois axônios. Um axônio (o axônio periférico) se projeta para a pele ou músculo, enquanto o outro axônio (o axônio central) se projeta centralmente para a medula espinhal. (B) Mais tarde no desenvolvimento, esses dois axônios se fundem (asterisco) para formar um único axônio e estabelecer uma morfologia pseudo-unipolar (Ramon y Cajal, 1904). Os axônios periféricos se arborizam em seus alvos para formar as árvores periféricas, enquanto os axônios centrais se bifurcam quando alcançam a zona de entrada da raiz dorsal (faixa verde DREZ) da medula espinhal e continuam a se estender em direções opostas ao longo da região anterior-posterior (AP) eixo. Existem dois significados funcionais desta bifurcação: ela permite que as informações sensoriais sejam transmitidas aos neurônios de retransmissão de alta ordem na medula espinhal ou no tronco encefálico por meio de suas projeções ascendentes (crescendo anteriormente) e, tanto ascendentes quanto descendentes (crescendo anteriormente e posteriormente) axônios brotam ramos colaterais intersticiais que invadem a substância cinzenta da medula espinhal.As colaterais das aferências cutâneas e motoras terminam em diferentes lâminas no eixo dorsal-ventral (D-V) da medula espinhal e formam circuitos de reflexo monossináptico ou polissináptico. Os terminais dessas colaterais também se arborizam, como mostrado aqui para as aferências musculares.

Desenvolvimento da ramificação do axônio sensorial na medula espinhal. As seções transversais esquemáticas de uma medula espinhal de vertebrado em desenvolvimento ilustram três formas de ramificação dos axônios sensoriais do gânglio da raiz dorsal (DRG) (Davis et al., 1989 Mendelson et al., 1992 Mirnics e Koerber, 1995a Mirnics e Koerber, 1995b Ozaki e Snider, 1997 Ramon y Cajal, 1904). (UMA) O DRG flanqueia a medula espinhal e contém os corpos celulares (círculo vermelho) dos neurônios sensoriais que inicialmente geram dois axônios. Um axônio (o axônio periférico) se projeta para a pele ou músculo, enquanto o outro axônio (o axônio central) se projeta centralmente para a medula espinhal. (B) Mais tarde no desenvolvimento, esses dois axônios se fundem (asterisco) para formar um único axônio e estabelecer uma morfologia pseudo-unipolar (Ramon y Cajal, 1904). Os axônios periféricos se arborizam em seus alvos para formar as árvores periféricas, enquanto os axônios centrais se bifurcam quando alcançam a zona de entrada da raiz dorsal (faixa verde DREZ) da medula espinhal e continuam a se estender em direções opostas ao longo da região anterior-posterior (AP) eixo. Existem dois significados funcionais desta bifurcação: ela permite que as informações sensoriais sejam transmitidas aos neurônios de retransmissão de alta ordem na medula espinhal ou no tronco encefálico por meio de suas projeções ascendentes (crescendo anteriormente) e, tanto ascendentes quanto descendentes (crescendo anteriormente e posteriormente) axônios brotam ramos colaterais intersticiais que invadem a substância cinzenta da medula espinhal. As colaterais das aferências cutâneas e motoras terminam em diferentes lâminas no eixo dorsal-ventral (D-V) da medula espinhal e formam circuitos de reflexo monossináptico ou polissináptico. Os terminais dessas colaterais também se arborizam, como mostrado aqui para as aferências musculares.

Os resultados de estudos in vitro indicam que várias moléculas extracelulares podem atuar como pistas locais para promover a formação de ramos ao longo de um axônio. Um exemplo é o NGF, que inicia o surgimento colateral de axônios de neurônios DRG de pintinhos em cultura quando é apresentado localmente em grânulos revestidos (Gallo e Letourneau, 1998). Uma resposta semelhante foi observada ao fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2) em axônios de neurônios piramidais de hamster embrionário, mas, neste caso, o fator atua em estreita proximidade com o cone de crescimento (ver Glossário, Caixa 1) (Szebenyi et al., 2001) .

A molécula de orientação netrina 1 também pode estimular a formação de ramos de axônios corticais de hamster cultivados quando aplicada localmente através de uma ponta de pipeta (Dent et al., 2004). As protrusões filopodiais foram iniciadas em segmentos lisos desses axônios na vizinhança da ponta da pipeta, seguidas pela extensão filopodial em direção à ponta. O efeito da netrina 1 na ramificação é possivelmente mediado pela sinalização do cálcio, pois o tratamento com netrina 1 induz transientes de cálcio espacialmente restritos no axônio que coincidem espaço-temporalmente com a formação de novos ramos (Tang e Kalil, 2005). Além disso, a aplicação local de netrina 1 induz um transiente local de Ca 2+ que é acompanhado pelo crescimento do ramo estimulado (Hutchins e Kalil, 2008).

Finalmente, a proteína anosmina secretada (também conhecida como KAL1) pode promover a formação de ramos colaterais locais de neurônios de projeção no bulbo olfatório dos mamíferos. Anosmin é defeituoso na síndrome de Kallman, uma doença humana associada à anosmia e ligada à ausência do trato olfatório. Em cultura, a anosmina demonstrou estimular a formação de ramos em neurônios olfatórios de ratos (Soussi-Yanicostas et al., 2002).

Inibição local combinada com promoção global

Outro mecanismo que restringe a formação de ramos a certas regiões do axônio foi sugerido a partir de estudos de desenvolvimento do mapa retinotópico (ver Glossário, Caixa 1) no SC de pintinhos e roedores (ver Fig. 2), onde ramos intersticiais se formam ao longo do axônio perto a zona terminal apropriada (Luo e Flanagan, 2007 McLaughlin e O'Leary, 2005). Um estudo de axônios RGC de pintinhos indicou que os mesmos gradientes de efrina / Eph usados ​​para a formação do mapa também podem participar na geração de árvores topográficas específicas (Yates et al., 2001). Em cultura, os axônios de RGCs de pintinhos derivados do lado temporal da retina mostram uma preferência distinta para formar ramos em faixas de membrana que são derivadas do tectum anterior, sua zona terminal apropriada, enquanto os axônios RGC nasais não mostram nenhuma preferência. A adição de receptores EPHA3 solúveis à cultura para sequestrar ligantes de efrina A nas faixas de membrana aboliu completamente essa formação de ramificação enviesada, sugerindo que a inibição mediada por efrina A pode restringir a ramificação localmente. Esta noção é consistente com a observação in vivo de zonas terminais ectópicas no SC posterior de camundongos sem efrina A2, efrina A5 ou ambos (Feldheim et al., 2000).

No entanto, este mecanismo de efrina A / EphA sozinho não é suficiente para gerar ramificação específica posterior pelos axônios RGC nasais. Uma investigação recente em camundongos sugere que existe um gradiente complementar de EPHA7 na estrutura do alvo para regular esse fenômeno (Rashid et al., 2005). Epha7 é expressa em um gradiente decrescente ao longo do eixo collicular ântero-posterior (A-P), enquanto a efrina A é mais altamente expressa nos axônios RGC nasais do que nos axônios temporais, formando um gradiente decrescente ao longo do eixo naso-temporal da retina (Fig. 2A). Perda de Epha7 em camundongos, leva à formação de uma zona terminal ectópica densamente ramificada na porção anterior do CS, além da zona terminal posterior normal (Rashid et al., 2005). Assim, em contraste com a sinalização direta da efrina A (ver Glossário, Caixa 1), que é empregada na restrição da ramificação do axônio RGC temporal, a sinalização reversa da efrina A (ver Glossário, Caixa 1) serve como um regulador negativo da ramificação do axônio RGC nasal. Assim, uma característica comum da ramificação do axônio RGC é que a inibição fornece um mecanismo chave para a geração de ramificações específicas da topografia.

Uma ilustração da bifurcação do axônio sensorial. Um esquema da bifurcação do axônio sensorial na zona de entrada da raiz dorsal (DREZ) da medula espinhal do camundongo. (UMA) Em embriões de camundongo do tipo selvagem, o axônio central (vermelho) do gânglio da raiz dorsal (DRG) bifurca na DREZ (faixa verde) da medula espinhal. Os dois ramos resultantes (azul) se estendem em direções opostas ao longo do eixo anterior-posterior (A-P), perpendicular ao axônio primário (vermelho). (B) Resumo dos defeitos de bifurcação em mutantes de camundongo. Os camundongos que carecem de sinalização de peptídeo natriurético tipo C (CNP, também conhecido como NPPC) incluem: um Nppc mutante [lbab (anormalidade de osso longo)] um alvo Nppc nocaute um receptor de peptídeo natriurético espontâneo 2 (Npr2) mutante e uma deleção direcionada da proteína quinase GI dependente de cGMP (Prkg1) (Schmidt et al., 2009 Schmidt et al., 2007 Zhao e Ma, 2009 Zhao et al., 2009). Nestes mutantes, os axônios DRG não conseguem bifurcar no DREZ, resultando na perda do segundo ramo. Em mutantes com sinalização SLIT prejudicada, como em Slit1Slit2 ou Robo1Robo2 mutantes duplos, os axônios DRG ainda se bifurcam, mas uma ramificação filha está mal orientada e entra na medula espinhal (Ma e Tessier-Lavigne, 2007). (C) Um modelo de formação colateral de repulsão acoplada que descreve as etapas sequenciais necessárias para a bifurcação do axônio sensorial na medula espinhal. Depois que o axônio sensorial primário (vermelho) atinge o DREZ (faixa verde), ele encontra as proteínas SLIT, que estão presentes ao lado do DREZ. Essas dicas param o axônio e o orientam para fazer uma curva aleatoriamente para a trilha A-P do DREZ. Imediatamente após a virada, o axônio recebe um sinal instrutivo do CNP e faz um novo ramo (azul), que brota como colateral do local de viragem e é bioquimicamente diferente do outro ramo (vermelho).

Uma ilustração da bifurcação do axônio sensorial. Um esquema da bifurcação do axônio sensorial na zona de entrada da raiz dorsal (DREZ) da medula espinhal do camundongo. (UMA) Em embriões de camundongo do tipo selvagem, o axônio central (vermelho) do gânglio da raiz dorsal (DRG) bifurca na DREZ (faixa verde) da medula espinhal. Os dois ramos resultantes (azul) se estendem em direções opostas ao longo do eixo anterior-posterior (A-P), perpendicular ao axônio primário (vermelho). (B) Resumo dos defeitos de bifurcação em mutantes de camundongo. Camundongos sem sinalização de peptídeo natriurético tipo C (CNP também conhecido como NPPC) incluem: um Nppc mutante [lbab (anormalidade de osso longo)] um alvo Nppc nocaute um receptor de peptídeo natriurético espontâneo 2 (Npr2) mutante e uma deleção direcionada da proteína quinase GI dependente de cGMP (Prkg1) (Schmidt et al., 2009 Schmidt et al., 2007 Zhao e Ma, 2009 Zhao et al., 2009). Nestes mutantes, os axônios DRG não conseguem bifurcar no DREZ, resultando na perda do segundo ramo. Em mutantes com sinalização SLIT prejudicada, como em Slit1Slit2 ou Robo1Robo2 mutantes duplos, os axônios DRG ainda se bifurcam, mas uma ramificação filha está mal orientada e entra na medula espinhal (Ma e Tessier-Lavigne, 2007). (C) Um modelo de formação colateral de repulsão acoplada que descreve as etapas sequenciais necessárias para a bifurcação do axônio sensorial na medula espinhal. Depois que o axônio sensorial primário (vermelho) atinge o DREZ (faixa verde), ele encontra as proteínas SLIT, que estão presentes ao lado do DREZ. Essas dicas param o axônio e o orientam para fazer uma curva aleatoriamente para a trilha A-P do DREZ. Imediatamente após a virada, o axônio recebe um sinal instrutivo do CNP e faz um novo ramo (azul), que brota como colateral do local de viragem e é bioquimicamente diferente do outro ramo (vermelho).

Tal mecanismo também pode se aplicar à arborização axonal topográfica de células granulares do giro dentado na formação do hipocampo de camundongo (Galimberti et al., 2010). Os axônios das células granulares do giro dentado, denominadas 'fibras musgosas', projetam-se na região CA3 do hipocampo, onde formam uma ou mais arborizações terminais em locais em CA3, com base na posição do soma da célula granular no giro dentado. O giro denteado exibe um gradiente de expressão do receptor EPHA4, o que sugere que ele poderia participar da especificação topográfica de arborizações terminais de fibras musgosas. De fato, interromper a sinalização de EPHA4 em culturas de fatias de hipocampo de camundongos aumenta o número de arborizações terminais de fibra musgosa, além de abolir a especificidade topográfica (Galimberti et al., 2010).

No entanto, a inibição de ramificação apenas restringe onde os ramos se formam, mas não garante a eventual formação de ramos. É possível que os axônios sejam intrinsecamente capazes de fazer ramos, conforme demonstrado pela formação de ramos de RGCs de pintinhos em cultura (Yates et al., 2001). Além disso, estudos do Xenopus tectum óptico descobriu que um sinal promotor de ramificação fornecido pelo fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) pode complementar a restrição de ramificação mediada por efrina A / EphA (Cohen-Cory e Fraser, 1994 Cohen-Cory e Fraser, 1995). O BDNF é expresso uniformemente no tectum, e seu receptor de alta afinidade TrkB é expresso uniformemente na retina (Cohen-Cory e Fraser, 1994). A injeção de BDNF no tectum aumenta a ramificação e a complexidade das árvores terminais de RGC, enquanto a injeção de anticorpos neutralizantes específicos para o BDNF reduz a arborização e a complexidade dos axônios (Cohen-Cory e Fraser, 1995). Além disso, um estudo recente in vitro de neurônios de galinha sugere que esta atividade promotora de ramificação é mediada por uma interação entre TrkB e efrina A na superfície celular (Marler et al., 2008). TrkB interage com a efrina A5 por meio de um domínio rico em cisteína, e a superexpressão desse domínio em RGCs de pinto resulta em um efeito negativo dominante na formação de ramificação induzida por BDNF. Da mesma forma, a adição de EPHA7 solúvel à cultura de RGC inibe essa atividade, assim como as listras de membrana cravejadas de EPHA7 (Marler et al., 2008). Esses experimentos sugerem que uma sugestão global de promoção de ramificação, como o BDNF, se coordena com os gradientes de efrina / Eph para controlar a ramificação do axônio RGC. Assim, o acoplamento da promoção de ramo global com um sistema de restrição de ramo complexo fornece um mecanismo molecular geral para restringir a ramificação a um local específico no sistema nervoso em desenvolvimento (Fig. 5C).


Importância

O terminal do axônio é a parte do axônio que libera os neurotransmissores que transmitem sinais através de uma sinapse. Por exemplo, em uma junção neuromuscular, o terminal do axônio libera neurotransmissores para retransmitir os impulsos nervosos do neurônio para a célula-alvo, que pode ser outro neurônio, uma célula muscular ou uma célula da glândula. A acetilcolina, por exemplo, é o neurotransmissor liberado por um neurônio para estimular uma célula muscular. Se o terminal do axônio não liberar acetilcolina, não haverá nenhum produto químico para ativar o músculo alvo. Como tal, isso pode levar à paralisia. Além da acetilcolina, outros neurotransmissores principais que o terminal do axônio fornece um caminho através da sinapse são dopamina, norepinefrina, epinefrina, serotonina, oxitocina, somatostatina, etc. Esses produtos químicos são reguladores químicos importantes de muitas atividades biológicas. Sem um terminal de axônio para mediar sua liberação do neurônio, esses produtos químicos, semelhantes à acetilcolina, não serão capazes de exercer seu papel crucial. Assim, a comunicação entre as células será obstruída por um terminal axônio disfuncional. Além disso, a recaptação de neurotransmissores não utilizados da fenda sináptica de volta ao neurônio pré-sináptico seria afetada se não houvesse um terminal axonal funcional.


Conclusão

O princípio do tipo arquitetônico conceitua conexões estruturais entre áreas do cérebro em termos de sua diferenciação arquitetônica relativa, fornecendo um princípio mamífero-geral para a organização das conexões cortico-corticais [2–4]. Como a relação observada empiricamente entre a arquitetura cortical e as características de conectividade emerge ainda não foi elucidada por estudos de desenvolvimento, mas foi sugerido que resultasse de interações espaço-temporais durante a neurogênese [1,2,7,15]. No que diz respeito à existência de conexões, esta explicação mecanicista é suportada por resultados de experimentos de simulação [22,23]. Aqui, nós expandimos um em sílico modelo da folha cortical em desenvolvimento para incluir compartimentos laminares e sondou quais fatores podem moldar os padrões laminares de origens de projeção. Nossos resultados indicam que, embora o surgimento de padrões laminares típicos seja de fato afetado por interações espaço-temporais durante a neurogênese, as especificações de onde e quando os neurônios são formados não são os determinantes exclusivos dos padrões laminares. Uma especificação adicional da identidade do neurônio, variando uma propriedade intrínseca da célula ao longo do gradiente de diferenciação arquitetônica, foi suficiente para permitir a nossa em sílico modelo para gerar padrões laminares realistas de origens de projeção. Isso sugere que pesquisas futuras devem considerar os meandros de como a identidade do neurônio é especificada no desenvolvimento, para identificar as bases mecanicistas do princípio do tipo arquitetônico e, assim, avançar nossa compreensão de como a conectividade no córtex dos mamíferos é organizada.


Reciclagem L1 / NgCAM local e sinalização no cone de crescimento

A localização, os níveis e o tempo de residência dos receptores de adesão e orientação influenciam de maneira crucial sua atividade funcional 46 e, portanto, a orientação e o crescimento dos axônios. Nos neurônios, muitos eventos de tráfego não são constitutivos, mas regulados por sinais extracelulares ou atividade elétrica. A regulação da fusão e da endocitose dos receptores de orientação é provavelmente importante para controlar localmente os níveis de receptores de orientação nos cones de crescimento. Esses mecanismos locais operam além dos eventos de tráfico de longo alcance para direcionamento para o axônio, conforme descrito acima. A ocorrência de regulação local de exocitose, endocitose e tethering foi demonstrada para L1 / NgCAM em cones de crescimento axonal, mas estamos apenas no início de desvendar as vias moleculares pelas quais a sinalização por meio de receptores de orientação e por outras vias regulam a inserção, difusão e remoção de receptores de orientação localmente 1.

O crescimento de axônio mediado por L1 / NgCAM, pelo menos em cultura, depende da endocitose em cones de crescimento, o que leva à ativação da via de proteína quinase ativada por mitogênio (MAPK), PI3-quinase e Rac para rearranjos do citoesqueleto no cone de crescimento 47 , 48. A internalização de L1 / NgCAM ocorre preferencialmente no domínio central dos cones de crescimento em migração, seguida pelo transporte anterógrado de vesículas contendo L1 / NgCAM e subsequente reciclagem próximo à borda frontal 48, 49. A forma neuronal de L1 / NgCAM se liga a AP2, provavelmente mediando a endocitose mediada por clatrina de L1 / NgCAM. Um estudo de Nishimura 50 mostrou que o adaptador monomérico Numb colocaliza com L1 / NgCAM na região central dos cones de crescimento e co-imunoprecipita com L1 / NgCAM e AP2 do cérebro. CRMP-2, que é crítico para regular o crescimento do axônio, regula a endotose mediada por Numb de L1 / NgCAM e o crescimento axonal mediado por L1 / NgCAM. Estes resultados sugerem que L1 / NgCAM pode utilizar uma via endocítica específica localmente em cones de crescimento axonal. Curiosamente, CRMP-2 não é co-imunoprecipitado com L1 / NgCAM, sugerindo que CRMP-2 interage com Numb – AP2, mas não com o complexo Numb – AP2 – L1 / NgCAM. Este achado levanta a questão de se a dissociação de CRMP-2 de Numb pode ser uma etapa chave para regular a internalização L1 / NgCAM local para o avanço do cone de crescimento 50.

A remoção de um receptor da superfície não é a única consequência da endocitose, mas cascatas de sinalização elaboradas são ativadas a jusante da endocitose 51. Pouco se sabe sobre os endossomos a partir dos quais os receptores de adesão sinalizam, mas os resultados de sinalização podem diferir de maneiras importantes, dependendo da rota endocítica seguida (dependente ou independente de clatrina) e o subsequente tráfico pós-endocítico (endossomo de reciclagem, endossomo tardio, etc. ) (por exemplo, ver 52, 53). Para crescimento de axônio mediado por L1 / NgCAM em vitro, a classificação e a reciclagem adequadas de L1 / NgCAM após a endocitose são críticas. A reciclagem de L1 / NgCAM em cones de crescimento é regulada por fosforilação para garantir que L1 / NgCAM endocitosado seja classificado em endossomos de reciclagem, mas não em lisossomas / endossomos tardios.A inibição da caseína-quinase II ou mutação da serina 1181 causa a localização incorreta de L1 / NgCAM endocitada em endossomos negativos para transferrina não identificados e leva a um defeito no crescimento do axônio no substrato L1 / NgCAM, mas não em outros substratos 54. Além disso, o tempo de residência nos endossomos também pode ser regulado e influenciar muito os resultados de sinalização 55. Esses eventos a jusante do evento de endocitose per se portanto, serão tópicos importantes de estudo no futuro.


Publicações de autores chamados "Esther Stoeckli"

Departamento de Ciências da Vida Molecular e Centro de Neurociências de Zurique, Universidade de Zurique, Winterthurerstrasse 190, 8057 Zurique, Suíça.

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O endoglicano desempenha um papel na orientação dos axônios, modulando a adesão celular.

Autores:

Elife 2021 março de 210. Epub 2021 2 de março.

Departamento de Ciências da Vida Molecular e Centro de Neurociências de Zurique, Universidade de Zurique, Zurique, Suíça.

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Orientação do axônio na perspectiva de imagem ao vivo da linha média-A da medula espinhal.

Autores:

J Comp Neurol 2021 Jul 22529 (10): 2517-2538. Epub 2021, 22 de janeiro.

Departamento de Ciências da Vida Molecular, Universidade de Zurique, Zurique, Suíça.

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Silenciamento de genes no desenvolvimento do cérebro de frango.

Autores:

Métodos Mol Biol 2020 2047: 439-456

Centro de Neurociências de Zurique, Instituto de Ciências da Vida Molecular, Universidade de Zurique, Zurique, Suíça.

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A iniciativa mesoSPIM: microscópios de folha de luz de código aberto para imagens de tecido limpo.

Autores:

Métodos Nat 2019 11 1616 (11): 1105-1108. Epub 2019, 16 de setembro.

Brain Research Institute, University of Zurich, Zurich, Suíça.

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Diversidade morfológica de características tegumentares na domesticação de aves: Insights da análise de disparidade e desenvolvimento embrionário.

Autores:

Dev Dyn 2019 11 13248 (11): 1044-1058. Epub 2019, 13 de setembro.

Paläontologisches Institut und Museum, Universität Zürich, Zürich, Suíça.

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Um papel conservado para a Sintaxina-1 na orientação axonal da linha média pré e pós-comissural em mosca, pintinho e camundongo.

Autores:

PLoS Genet 2018 06 1814 (6): e1007432. Epub 2018, 18 de junho.

Departamento de Biologia Celular, Fisiologia e Imunologia, Faculdade de Biologia e Instituto de Neurociências, Universidade de Barcelona, ​​Barcelona, ​​Espanha.

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Compreendendo a orientação do axônio: ainda estamos quase lá?

Autores:

Desenvolvimento 2018 05 14145 (10). Epub 2018, 14 de maio.

Universidade de Zurique, Instituto de Ciências da Vida Molecular, Centro de Neurociências de Zurique, Winterthurerstrasse 190, 8057 Zurique, Suíça

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Evidências clínicas e experimentais sugerem uma ligação entre as ciliopatias relacionadas ao KIF7 e C5orf42 por meio da sinalização Sonic Hedgehog.

Autores:

Eur J Hum Genet 2018 02 1026 (2): 197-209. Epub 2018, 10 de janeiro.

Instituto de Genética Médica, Universidade de Zurique, Schlieren-Zurique, Suíça.

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As calsinteninas são expressas de maneira dinâmica e parcialmente sobreposta durante o desenvolvimento neural.

Autores:

Front Neuroanat 2017 3011: 76. Epub 2017, 30 de agosto.

Departamento de Ciências da Vida Molecular e Centro de Neurociências de Zurique, Universidade de ZuriqueZurich, Suíça.

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Os neurônios motores controlam a padronização dos vasos sanguíneos na medula espinhal em desenvolvimento.

Autores:

Nat Commun 2017 03 68: 14583. Epub 2017, 6 de março.

Biochemistry Center, Heidelberg University, 69120 Heidelberg, Germany.

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Sonic -'Jack-of-All-Trades 'na formação do circuito neural.

Autores:

J Dev Biol 2017, 85 (1) de fevereiro. Epub 2017, 8 de fevereiro.

Departamento de Ciências da Vida Molecular e Centro de Neurociências de Zurique, Universidade de Zurique, Winterthurerstrasse 190, 8057 Zurique, Suíça.

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Onde a orientação do axônio nos leva?

Autores:

F1000Res 2017 256: 78. Epub 2017, 25 de janeiro.

Departamento de Ciências da Vida Molecular e Centro de Neurociências de Zurique, Universidade de Zurique, Zurique, Suíça.

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As proteínas SNARE desempenham um papel na orientação do axônio motor em vertebrados e invertebrados.

Autores:

Dev Neurobiol 2017 09 1277 (8): 963-974. Epub 2017, 12 de fevereiro.

Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRB Barcelona), Instituto de Ciência e Tecnologia de Barcelona, ​​Barcelona, ​​08028, Espanha.

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A medula espinhal mostra o caminho - como os axônios navegam em alvos intermediários.

Autores:

Dev Biol 2017 12 10432 (1): 43-52. Epub 2016, 10 de dezembro.

Universidade de Zurique, Departamento de Ciências da Vida Molecular e Centro de Neurociências de Zurique, Winterthurerstrasse 190, 8057 Zurique, Suíça. Endereço eletrônico:

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SynCAMs - da orientação do axônio aos distúrbios do neurodesenvolvimento.

Autores:

Mol Cell Neurosci 2017 06 181: 41-48. Epub 2016, 1º de setembro.

Departamento de Ciências da Vida Molecular e Centro de Neurociências de Zurique, Universidade de Zurique, Winterthurerstrasse 190, 8057 Zurique, Suíça. Endereço eletrônico:

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A semaforina 3A derivada de células endoteliais inibe a formação de filópodes pelas células da extremidade vascular do sangue.

Autores:

Desenvolvimento 2016 Fev143 (4): 589-94

Instituto de Ciências Farmacêuticas, Instituto Federal Suíço de Tecnologia, ETH Zurique, Zurique 8093, Suíça

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O tráfego mediado pela calsyntenin 1 de receptores de orientação de axônio regula a mudança na responsividade axonal em um ponto de escolha.

Autores:

Desenvolvimento 2016 março 2143 (6): 994-1004. Epub 2016, 2 de fevereiro.

Instituto de Ciências da Vida Molecular e Centro de Neurociências de Zurique, Universidade de Zurique, Winterthurerstrasse 190, Zurique CH-8057, Suíça

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A sinalização wnt canônica é necessária para a orientação do axônio comissural.

Autores:

Dev Neurobiol 2016 Fev 376 (2): 190-208. Epub 2015, 3 de julho.

Instituto de Ciências da Vida Molecular e Centro de Neurociências de Zurique, Universidade de Zurique, Winterthurerstrasse 190, 8057, Zurique, Suíça.

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Mecanismos de fiação para olfato e visão - não completamente diferentes, afinal.

Autores:

Neuron 2014, novembro de 1984 (4): 655-7. Epub 2014, 19 de novembro.

Instituto de Ciências da Vida Molecular, Universidade de Zurique, Winterthurerstrasse 190, 8057 Zurique, Suíça. Endereço eletrônico:

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As moléculas de adesão de células sinápticas SynCAM estão envolvidas na detecção de caminhos do axônio sensorial, regulando os contatos axônio-axônio.

Autores:

J Cell Sci 2014, dezembro 21127 (Pt 24): 5288-302. Epub 2014, 21 de outubro.

Instituto de Ciências da Vida Molecular e Centro de Neurociências de Zurique, Universidade de Zurique, Winterthurerstrasse 190, 8057 Zurique, Suíça

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Protocaderinas: não apenas cola de neurônios, mais também!

Autores:

Instituto de Ciências da Vida Molecular, Universidade de Zurique, Winterthurerstrasse 190, 8057 Zurique, Suíça. Endereço eletrônico:

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A semaforina 6B atua como um receptor na orientação dos axônios comissurais pós-cruzamento.

Autores:

Desenvolvimento 2014 outubro 10141 (19): 3709-20. Epub 2014, 10 de setembro.

Instituto de Ciências da Vida Molecular e Centro de Neurociências de Zurique, Winterthurerstrasse 190, Zurique 8057, Suíça

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SynCAMs estendem suas funções além da sinapse.

Autores:

Eur J Neurosci 2014 junho 1539 (11): 1752-60. Epub 2014, 15 de março.

Instituto de Ciências da Vida Molecular e Centro de Neurociências de Zurique, Universidade de Zurique, Winterthurerstrasse 190, 8057, Zurique, Suíça.

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Análise do contato célula-célula mediado por moléculas de adesão celular da superfamília de Ig.

Autores:

Curr Protoc Cell Biol 2013, dezembro 261: 9.5.1-9.5.85. Epub 2013, 2 de dezembro.

Instituto de Ciências da Vida Molecular, Universidade de Zurique, Zurique, Suíça.

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Eletroporação in ovo de plasmídeos baseados em miRNA para investigar a função do gene no tubo neural em desenvolvimento.

Autores:

Methods Mol Biol 2014 1101: 353-68

Instituto de Ciências da Vida Molecular e Centro de Neurociências de Zurique, Zurique, Suíça.

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Silenciamento de genes baseados em RNAi no desenvolvimento do cérebro de galinhas.

Autores:

Methods Mol Biol 2014 1082: 253-66

Instituto de Ciências da Vida Molecular e Centro de Neurociências de Zurique, Universidade de Zurique, Zurique, Suíça.

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O hedgehog sônico regula seu próprio receptor nos axônios comissurais pós-cruzamento de uma maneira dependente do glypican1.

Autores:

Instituto de Ciências da Vida Molecular, Centro de Neurociências de Zurique, Universidade de Zurique, CH-8057 Zurique, Suíça.

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Sonic hedgehog e Wnt: antagonistas na morfogênese, mas colaboradores na orientação do axônio.

Autores:

Front Cell Neurosci 2013 107: 86. Epub 2013, 10 de junho.

Instituto de Ciências da Vida Molecular, Universidade de Zurique, Zurique, Suíça.

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RabGDI controla o cruzamento da linha média axonal regulando a expressão da superfície Robo1.

Autores:

Neural Dev 2012 nov 97:36. Epub 2012, 9 de novembro.

Instituto de Ciências da Vida Molecular, Universidade de Zurique, Winterthurerstrasse 190, Zurique, CH 8057, Suíça.

Fundo: Os axônios navegam para seus alvos sinápticos futuros com a ajuda de pontos de escolha, alvos intermediários que expressam pistas de orientação dos axônios. Assim que alcançam um ponto de escolha, os axônios precisam mudar sua resposta de atração para repulsão, a fim de seguir em frente com o próximo estágio de sua jornada. Os mecanismos subjacentes à mudança na responsividade axonal são mal compreendidos. Os axônios comissurais tornam-se sensíveis à atividade repulsiva das fendas quando eles cruzam a linha média ventral do SNC. A capacidade de resposta às fendas depende da expressão de superfície dos receptores Robo. Em Drosophila, Commissureless (Comm) desempenha um papel regulador crucial no cruzamento da linha média, mantendo os níveis de Robo baixos nos axônios pré-comissurais. Curiosamente, até à data, nenhum homólogo de vertebrado de comm foi identificado. Foi demonstrado que o Robo3 / Rig1 controla a sensibilidade da fenda antes da linha média, mas sem afetar a expressão da superfície do Robo1.

Resultados: Nós identificamos RabGDI, um gene ligado ao retardo mental humano e um componente essencial da maquinaria de fusão de vesículas, em uma triagem para genes de placa de piso expressos diferencialmente. A regulação negativa de RabGDI por RNAi in ovo fez com que os axônios comissurais parassem na placa de piso, copiando o efeito observado após a regulação negativa de Robo1. Por outro lado, a expressão prematura de RabGDI evitou que os axônios comissurais entrassem na placa do assoalho. Além disso, RabGDI desencadeou a expressão de superfície Robo1 em neurônios comissurais em cultura. Tomados em conjunto, nossos resultados identificam RabGDI como um componente do mecanismo de comutação que é necessário para os axônios comissurais mudarem sua resposta de atração para repulsão no alvo intermediário.

Conclusão: RabGDI assume o papel funcional da mosca Comm, regulando a expressão de superfície de Robo1 em axônios comissurais em vertebrados. Isso, por sua vez, permite que os axônios comissurais mudem de atração para repulsão na linha média da medula espinhal.


Comunicação, homeostase e energia-2

Para que os organismos multicelulares sobrevivam e funcionem, as condições precisam ser adequadas para sobreviver, incluindo: - Uma temperatura adequada (37 graus) - Um pH adequado (varia ao redor do corpo) - Um ambiente aquoso que mantém substratos e produtos em solução - Liberdade de toxinas e inibidores em excesso

As células sofrem várias atividades metabólicas, usam substratos e produzem produtos. Alguns produtos são indesejáveis ​​ou tóxicos, portanto, a atividade celular altera seu próprio ambiente.

Sinalização celular Dois sistemas principais de sinalização celular:

Sistema neuronal - uma rede interconectada de neurônios que sinalizam uns para os outros através das junções de sinapses, os efeitos dos neurônios são rápidos e de curta duração

Efeito do neurônio motor do coordenador do neurônio sensorial receptor

Sistema hormonal - usa sangue para transportar sinais químicos. As glândulas endócrinas liberam hormônios no sangue, que são transportados por todo o corpo e são reconhecidos apenas pelas células-alvo. O efeito dos hormônios é lento e duradouro

Homeostase

Homeostase - manutenção do ambiente interno constante apesar das mudanças externas.

Condições mantidas sob controle pela homeostase: - Temperatura corporal - as enzimas desnaturariam se a temperatura fosse muito alta - Concentração de glicose no sangue - Concentração de sal no sangue - isso alteraria o potencial da água fazendo com que as células se plasmolisem / crenem - Potencial da água - podem fazer as células plasmolisar / crenata - pressão arterial - pode causar arteriosclerose e aterosclerose - concentração de dióxido de carbono - pode fazer com que o oxigênio se dissocie da hemoglobina. O CO2 na água forma ácido carbônico, que altera o pH.

Loops de feedback negativo Feedback negativo - um processo que traz a reversão de qualquer mudança nas condições, garante que um estado ótimo possa ser mantido, é essencial para a homeostase.

As respostas do receptor de mudança ambiental de temperatura ideal se comunicam com o coordenador se comunicam com os efetores realizam uma resposta e retorna ao normal

Feedback positivo - é um processo que aumenta qualquer mudança detectada pelos receptores. Os loops de feedback positivo são menos comuns e ocorrem durante o parto ou na resposta de luta ou fuga

Mudança de condição ideal no receptor de condição detecta a mudança e se comunica com o coordenador efetor reage para aumentar a mudança

Termorregulação

Ectotérmicos - organismos que dependem de fontes externas de calor para regular a temperatura corporal

Os ectotérmicos não são capazes de aumentar a respiração para gerar calor; se um ectotérmico estiver frio, ele mudará seu comportamento ou fisiologia para absorver o calor do ambiente, por exemplo, deitar ao sol ou mudar de cor. Quando um ectotérmico está quente, ele muda seu comportamento ou fisiologia para esfriar, por exemplo, fica na sombra ou muda de cor para refletir o sol.

Vantagens de ser um ectotérmico: - Usar menos alimentos para respirar - Precisa de menos comida para sobreviver - Uma proporção maior de energia pode ser usada para o crescimento - Desvantagens de ser um ectotérmico: - Menos ativo em temperaturas mais frias - Não é capaz de se mover ou caça o suficiente, o que significa que eles têm que armazenar energia para sobreviver no inverno.

Endotérmicos - são organismos que podem usar fontes internas de calor, como o calor gerado pelo metabolismo do fígado para manter a temperatura corporal.

Regulação da temperatura em endotérmicos:

Retire informações do corpo celular. Superfície lisa Geralmente, apenas 1 axônio por célula. Nenhum ribossomo pode ter ramificação de mielina mais distante do corpo celular.

Traga informações para o corpo celular Superfície áspera (espinhos dendríticos) Normalmente, muitos dendritos por célula Têm ribossomos Sem isolamento de mielina Ramo próximo ao corpo celular

As células de Schwanns secretam mielina para envolver a célula

Caminho de um sinal 1. Receptor 2. Neurônio sensorial 3. Através da rota dorsal (cérebro) 4. Saída pela rota ventral (cérebro) 5. para o neurônio motor 6. para o efetor

Potenciais de repouso e potenciais de ação (bomba NA / K) - a bomba na / k requer energia - a energia é fornecida pelo ATP, ela se liga aos átomos formando ADP: - (A-P-P-P A-P-P + P +) a quebra da ligação fornece energia y

3Na + estão liberado para fora 2K + mover dentro

O estado de repouso - O estado de repouso é mantido pela bomba Na / K e canais de membrana específicos - É polarizado (tem uma diferença de potencial) a -70mv (em comparação com o exterior) - Durante o estado de repouso, o canal k + está aberto, o canal na + está canais fechados e canais por tensão são fechados.

Potenciais de ação Um potencial de ação é quando a célula é despolarizada (perda de polarização). Canais controlados por voltagem são canais que permitem a passagem de íons específicos e têm mecanismos que reagem a receptores ou mudanças na diferença de potencial

** Potencial de limite acontece por aí -50mv , se isso não for alcançado, um potencial de ação não é alcançado **

O potencial de ação consiste em um conjunto de movimentos iônicos: 1. a membrana está em estado de repouso (polarizada em -70mv) 2. canais de sódio abertos ao estímulo, íons de sódio se difundem na célula, causa despolarização local 3. valor limite de -50mv é atingido e o canal de sódio controlado por voltagem abre, causando uma corrente local 4. O sódio se difunde através da célula e mais canais abertos por voltagem se abrem 5. a diferença de potencial atinge + 40mv 6. Os canais de sódio se fecham e os canais de potássio se abrem

  1. íons de potássio se difundem, chamados de repolarização
  2. a diferença de potencial ultrapassa -70 este é o período refratário
  3. de volta ao estado de repouso

(o período refratário garante que o potencial de ação seja enviado apenas em uma direção. É conhecido como o resposta tudo ou nada pois só atinge um potencial de ação se o potencial limite é alcançado )

  1. As vesículas migram para a membrana plasmática
  2. Acetilcolina liberada por exocitose
  3. Moléculas de acetilcolina se difundem através da fenda sináptica
  4. A acetilcolina se liga aos canais de sódio bloqueados pelo ligante na membrana pós-sináptica
  5. Canais de íon de sódio abertos
  6. Um potencial gerador é criado
  7. Se os potenciais geradores atingirem o limiar, um potencial de ação será criado no neurônio pós-sináptico.

Remoção de acetilcolina para interromper um sinal

  • acetilcolinesterase (uma enzima) pode quebrar a acetilcolina em ácido etanóico e colina
  • eles reentram no botão pré-sináptico por difusão e recombina-se usando ATP da respiração na mitocôndria

Soma de integração neuronal - a soma ocorre quando um potencial de ação é alcançado pela soma total de muitos potenciais geradores

Somatório espacial - é quando muitos receptores são estimulados por um pequeno estímulo, mas a soma total é suficiente para iniciar um potencial de ação

Somatório temporal - quando a soma total de uma série de potenciais de ação individuais na membrana pré-sináptica causa uma despolarização da membrana pós-sináptica.

Hiperpolarização - causado pelo movimento de íons K + para fora através de canais acionados por tensão

(Os sinais de saída hipopolarizam e os sinais inibitórios hiper-polarizam)

Sistema endócrino - O glândula endócrina é uma glândula que secreta hormônios diretamente no sangue - Hormônios são moléculas que são liberadas pelas glândulas endócrinas. Eles agem como mensageiros que transportam um sinal da glândula endócrina para uma célula ou tecido específico. - um e glândula xócrina secreta moléculas em um duto naquela carrega as moléculas para onde eles são usados

Hormônios à base de esteróides (à base de lipídios) Estrogênio e testosterona são baseados em esteróides 1. difusão no citoplasma da célula 2. eles se ligam a receptores no citoplasma 3. formam um complexo hormônio-receptor 4.eles se ligam ao DNA que inicia a síntese de proteínas

hormônios à base de proteína A adrenalina e a insulina são baseadas em proteínas 1. elas se ligam a um receptor na membrana plasmática (glicoproteínas) 2. ativa a proteína G dentro da célula

  1. isso torna o GTP (energia)
  2. o GTP ativa a adenilil ciclase
  3. adenil ciclase converte ATP em AMP cíclico (cAMP)
  4. cAMP é o mensageiro secundário e causa um efeito ao ativar a ação da enzima

Glândula adrenal adrenalina é feito no Mineralocorticoides da medula adrenal e glicocorticóides Feito em córtex adrenal

Efeitos da adrenalina - relaxa o músculo liso (maior taxa de respiração) - relaxa o coração (volumes maiores de sangue) - aumenta a pressão arterial (vasoconstrição) - aumenta a consciência mental - estimula a glicogenólise - faz com que os pelos do corpo fiquem eretos - inibe as ações intestinais (diminui o metabolismo)

O pâncreas o pâncreas é um pequeno órgão situado abaixo do estômago, tem ambos exócrino e endócrino funções - a maioria das células do pâncreas produz enzimas , eles são encontrados em túbulos minúsculos que se conectam a um duto pancreático (Isto é o função exócrina ) As enzimas feitas incluem lipase , maltase , sacarase, amilase e tripsinogênio.

✶Outra função do pâncreas é secretar hormônios. o ilhotas de Langerhans têm dois tipos de células: alfa células e beta células.

Controle da secreção de insulina 1. Os canais de potássio estão abertos e os canais de cálcio normalmente. Os íons de potássio se difundem para fora da célula tornando-a mais negativa (-70v em comparação com o exterior) 2. quando as concentrações de glicose são muito altas, a glicose se difunde para a célula 3. a glicose é usada no metabolismo para produzir ATP 4. o ATP extra causa canais de potássio se fecham 5. isso altera a diferença de potencial (torna-se menos negativo) 6. canais de cálcio se abrem 7. íons de cálcio se difundem ao se ligar a vesículas contendo insulina e causam a secreção por exocitose.

O diabetes é uma doença em que as concentrações de glicose no sangue não podem ser controladas de forma eficaz. Isso pode levar a hiperglicemia (altas concentrações) ou hipoglicemia (baixas concentrações)

Diabetes tipo um O diabetes tipo um também é conhecido como diabetes insulino-dependente. Acredita-se que seja o resultado de uma resposta autoimune na qual o sistema imunológico do corpo ataca as células B e as destrói, o resultado é que a insulina não é mais produzida e o corpo não pode armazenar o excesso de glicose como glicogênio.

Diabetes tipo dois O diabetes tipo dois também é conhecido como diabetes não insulino-dependente. Uma pessoa com diabetes tipo dois ainda pode produzir insulina, mas sua eficácia diminui com o tempo. Os fatores que afetam o início do tipo dois incluem: obesidade, dieta rica em açúcar ou histórico familiar.

Tratamento O tipo dois é tratado monitorando a dieta, monitorando a ingestão de carboidratos e, eventualmente, complementado com injeções de insulina. O tipo dois é tratado com injeções de insulina.

O coração humano O coração se adapta para fornecer mais oxigênio e glicose por meio de: - aumento dos batimentos por minuto - aumento da força das contrações - aumento do volume sistólico

o músculo cardíaco é miogênico (bate sozinho), ele tem seu próprio marca-passo , a nó sinoatrial (SAN) que é uma região de tecido que pode iniciar um potencial de ação. O potencial de ação viaja como um onda de excitação sobre o paredes do átrio através de nó atrioventricular (AVN) e para baixo o fibras de purkinje para os ventrículos causando um contração.

o coração é conectado por nervos à medula oblongata (no cérebro) eles não iniciam uma resposta, mas pode afetar a frequência das contrações. o o coração também responde à presença de adrenalina no sangue.

Perguntas e respostas (comunicação, homeostase e energia)

Descreva a estrutura e função dos neurônios sensoriais • transmitir impulsos nervosos de receptores para o SNC • dendritos curtos, um dendro longo para transportar impulsos para o corpo celular, um axônio curto para transportar impulsos para o SNC

Descreva a estrutura e função dos neurônios motores • transmitir impulsos nervosos do SNC para os efetores • muitos dendritos curtos para transportar os impulsos do SNC para o corpo celular, um longo axônio para transportar os impulsos do corpo celular para as células efetoras

Descreva a estrutura e função dos neurônios de retransmissão • transmitir impulsos nervosos entre neurônios sensoriais e motores • muitos dendritos curtos para transportar impulsos de neurônios sensoriais para o corpo celular, axônios curtos para transportar impulsos do corpo celular para neurônios motores

Descreva a via de comunicação nervosa

• impede que o cérebro fique superestimulado por não responder a estímulos muito pequenos

Qual é o papel da bainha de mielina? • atua como um isolante elétrico • composto de células de Schwann • tem pequenas lacunas chamadas de nódulos de Ranvier, onde os canais de Na + estão concentrados

Descreva a condução saltatória • em um neurônio mielinizado, a despolarização ocorre apenas nos nódulos de Ranvier • o citoplasma dos neurônios conduz carga elétrica suficiente para despolarizar o próximo nodo • o impulso salta de nodo para nodo rapidamente

Como o diâmetro do axônio afeta a velocidade de condução? • maior diâmetro = condução mais rápida • há menos resistência ao fluxo de íons

Como a temperatura afeta a velocidade de condução? • maior temperatura = íons difundem mais rápido • acima de 40 graus - desnaturação de proteínas, velocidade diminui

Como um impulso nervoso é transmitido através de uma sinapse colinérgica • AP chega ao botão pré-sináptico e faz com que os canais de Ca2 + se abram • o influxo de Ca2 + faz com que as vesículas sinápticas se fundam com a membrana pré-sináptica e liberem acetilcolina (ACh) • ACh se difunde através da fenda sináptica e se liga a receptores colinérgicos na membrana pós-sináptica • isso faz com que o Na + se abra, o influxo causa despolarização e se o limiar for atingido, um PA é gerado • A ACh é removida dos receptores pela acetilcolinesterase, os produtos são reabsorvidos pelo neurônio pré-sináptico e usados ​​para produzir mais ACh

Como os antagonistas interrompem a transmissão sináptica • eles imitam a ação dos neurotransmissores, pois têm a mesma forma - mais AP • exemplo - a nicotina imita a acetilcolina

Como os inibidores enzimáticos interrompem a transmissão sináptica? • evitar que os neurotransmissores sejam quebrados - à esquerda nos receptores • exemplo - gases nervosos inibem a acetilcolina e resultam na perda de controle muscular

Como os opioides interrompem a transmissão sináptica? • bloquear os canais de Ca2 + para que menos vesículas se fundam com a membrana e menos neurotransmissor seja liberado • menos AP

O que é divergência sináptica? um neurônio libera neurotransmissor para muitos neurônios

O que é convergência sináptica?

muitos neurônios liberam neurotransmissor para um neurônio

O que é soma espacial? • vários neurônios pré-sinápticos convergem e liberam seu neurotransmissor ao mesmo tempo para o mesmo neurônio pós-sináptico • atinge o limiar mais cedo • permite que os sinais de vários estímulos sejam coordenados em uma resposta

O que é soma temporal? • múltiplos impulsos chegam em rápida sucessão do mesmo neurônio pré-sináptico • AP é mais provável, pois há mais neurotransmissor na fenda

Por que os hormônios são chamados de primeiros mensageiros? eles carregam a mensagem química na primeira parte do caminho - da glândula endócrina ao receptor na célula-alvo

Como são feitas as moléculas de sinalização? • quando um hormônio se liga aos seus receptores, ele ativa uma enzima na membrana • a enzima catalisa a produção de uma molécula sinalizadora que diz às partes da célula para mudar a forma como funcionam

Por que as moléculas de sinalização são chamadas de segundos mensageiros? • eles carregam a mensagem química na segunda parte do caminho - do receptor para outras partes da célula • eles ativam a cascata (uma cadeia de reações dentro de uma célula)

Como a adrenalina atua como primeiro mensageiro? • liga-se a receptores na membrana celular (por exemplo, células do fígado) • ativa a enzima adenilil ciclase que catalisa a produção do mensageiro secundário cAMP do ATP • cAMP ativa uma cascata de reações que tornam a glicose mais facilmente disponível

Descreva o córtex e sua função • parte externa do rim • secreta hormônios esteróides, por exemplo, cortisol quando você está estressado, o que pode suprimir o sistema imunológico, aumenta a captação de Na + e água pelos rins, estimula a quebra de gorduras / proteínas em glicose

Descreva a medula e sua função • parte média do rim • secreta hormônios catecolaminas (aminoácidos modificados), por exemplo, adrenalina / noradrenalina • eles disponibilizam mais energia a curto prazo - aumentam a frequência cardíaca / respiratória

O que é homeostase? • Manter um ambiente interno constante

Onde é detectada a temperatura no corpo? • temperatura corporal interna - hipotálamo • temperatura externa - termorreceptores na pele

Qual é a concentração normal de glicose no sangue? • 90mg por 100cm

De onde a insulina é secretada? • células beta de ilhotas de Langerhans no pâncreas

De onde é secretado o glucagon? • células alfa das ilhotas de Langerhans no pâncreas

Como a insulina regula a concentração de glicose no sangue? • reduz as concentrações de glicose no sangue • liga-se a receptores nas células hepáticas / musculares para aumentar a permeabilidade à glicose • ativa enzimas envolvidas na glicogênese (glicose em glicogênio) • aumenta a taxa de respiração

Como o glucagon regula a concentração de glicose no sangue? • liga-se a receptores na membrana das células hepáticas / musculares, ativando enzimas envolvidas na glicogenólise • promove a formação de glicose a partir de ácidos graxos e aminoácidos - gliconeogênese • diminui a taxa de respiração nas células

O que acontece quando uma célula beta detecta uma alta concentração de glicose no sangue?

  1. BGC alto significa que mais glicose se move para a célula beta, aumentando a taxa de respiração - mais canais de ATP 2 K + fechados devido ao aumento de ATP- K + acumulado dentro da célula despolarizando a membrana plasmática
  2. a despolarização faz com que os canais de Ca2 + se abram, o influxo de Ca2 + faz com que as vesículas contendo insulina se fundam com a membrana

Descreva o diabetes tipo 1 • o corpo ataca as células beta, o que significa que menos insulina é secretada - depois de comer, a glicose no sangue aumenta e permanece alta, resultando em morte se não for tratada

Como o diabetes tipo 1 é tratado? • injeções de insulina • transplante de ilhotas de Langerhans • alimentação saudável e exercícios

Descreva o diabetes tipo 2 • as células beta não produzem insulina suficiente ou as células do corpo não respondem adequadamente à insulina • os receptores de insulina nas membranas não funcionam corretamente - menos glicose é absorvida

Como o diabetes tipo 2 é tratado?

• dieta balanceada e exercícios • medicação para aumentar a produção / sensibilidade à insulina • terapia com insulina - último recurso

Por que usar insulina de bactérias GM é melhor do que extraí-la de animais? • mais barato • produzir maiores quantidades • menos probabilidade de desencadear uma reação alérgica • algumas pessoas não querem usar insulina animal por razões éticas / religiosas

Como as células-tronco podem ser usadas para curar o diabetes? • eles podem ser cultivados em células beta e implantados no pâncreas de um diabético


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