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4.7B: Mitocôndrias - Biologia

4.7B: Mitocôndrias - Biologia


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objetivos de aprendizado

  • Explique o papel das mitocôndrias.

Uma das principais características que distinguem procariotos de eucariotos é a presença de mitocôndrias. As mitocôndrias são organelas de membrana dupla que contêm seus próprios ribossomos e DNA. Cada membrana é uma bicamada fosfolipídica embutida com proteínas. As células eucarióticas podem conter de um a vários milhares de mitocôndrias, dependendo do nível de consumo de energia da célula. Cada mitocôndria mede 1 a 10 micrômetros (ou mais) de comprimento e existe na célula como uma organela que pode ser ovóide ou em forma de verme ou intrincadamente ramificada.

Estrutura da mitocôndria

A maioria das mitocôndrias é cercada por duas membranas, o que resultaria quando um organismo delimitado por membrana fosse engolfado em um vacúolo por outro organismo delimitado por membrana. A membrana mitocondrial interna é extensa e envolve envolvimentos substanciais chamados cristas que se assemelham à superfície externa texturizada de alfa-proteobactérias. A matriz e a membrana interna são ricas em enzimas necessárias para a respiração aeróbica.

As mitocôndrias têm seu próprio (geralmente) cromossomo de DNA circular que é estabilizado por ligações à membrana interna e carrega genes semelhantes aos genes expressos por alfa-proteobactérias. As mitocôndrias também têm ribossomos especiais e RNAs de transferência que se assemelham a esses componentes dos procariotos. Todas essas características apóiam a hipótese de que as mitocôndrias já foram procariontes de vida livre.

Função Mitocôndria

As mitocôndrias são frequentemente chamadas de "potências" ou "fábricas de energia" de uma célula porque são responsáveis ​​pela produção de trifosfato de adenosina (ATP), a principal molécula transportadora de energia da célula. ATP representa a energia armazenada de curto prazo da célula. A respiração celular é o processo de produção de ATP usando a energia química encontrada na glicose e outros nutrientes. Na mitocôndria, esse processo usa oxigênio e produz dióxido de carbono como produto residual. Na verdade, o dióxido de carbono que você exala a cada respiração vem das reações celulares que produzem dióxido de carbono como subproduto.

É importante ressaltar que as células musculares possuem uma concentração muito elevada de mitocôndrias produtoras de ATP. As células musculares precisam de muita energia para manter o corpo em movimento. Quando suas células não recebem oxigênio suficiente, elas não produzem muito ATP. Em vez disso, a pequena quantidade de ATP que eles produzem na ausência de oxigênio é acompanhada pela produção de ácido lático. Além da geração aeróbia de ATP, as mitocôndrias têm várias outras funções metabólicas. Uma dessas funções é gerar aglomerados de ferro e enxofre que são cofatores importantes de muitas enzimas. Essas funções são freqüentemente associadas às reduzidas organelas derivadas da mitocôndria de eucariotos anaeróbios.

Origens da Mitocôndria

Existem duas hipóteses sobre a origem das mitocôndrias: endossimbiótico e autógeno, mas a teoria mais confiável no momento é a endossimbiose. A hipótese endossimbiótica sugere que as mitocôndrias eram originalmente células procarióticas, capazes de implementar mecanismos oxidativos. Essas células procarióticas podem ter sido engolfadas por um eucariota e se tornaram endossimbiontes que vivem dentro do eucariota.

Pontos chave

  • As mitocôndrias contêm seus próprios ribossomos e DNA; combinadas com sua membrana dupla, essas características sugerem que eles podem ter sido procariotos de vida livre engolfados por uma célula maior.
  • As mitocôndrias têm um papel importante na respiração celular por meio da produção de ATP, a partir da energia química encontrada na glicose e outros nutrientes.
  • As mitocôndrias também são responsáveis ​​pela geração de aglomerados de ferro e enxofre, importantes cofatores de muitas enzimas.

Termos chave

  • alfa-proteobactéria: Uma classe taxonômica dentro do filo Proteobacteria - as proteobactérias fototrópicas.
  • trifosfato de adenosina: um trifosfato de nucleosídeo multifuncional usado nas células como uma coenzima, muitas vezes chamado de "unidade molecular da moeda de energia" na transferência de energia intracelular
  • cofator: uma molécula inorgânica necessária para o funcionamento de uma enzima

As diversas consequências da aneuploidia

A aneuploidia, ou número de cromossomos desequilibrado, tem efeitos profundos nas células eucarióticas. Em humanos, a aneuploidia está associada a várias patologias, incluindo câncer, o que sugere que ela medeia uma vantagem proliferativa nessas condições. Aqui, discutimos as mudanças fisiológicas desencadeadas pela aneuploidia, como crescimento celular alterado, alterações transcricionais, estresse proteotóxico, instabilidade genômica e resposta aos interferons e como as células cancerosas se adaptam às mudanças do genoma aneuploide.


INTRODUÇÃO

Organelas como as mitocôndrias são predominantemente herdadas da mãe em embriões metazoários (Ukeshima e Fujimoto, 1984 Pepling and Spradling, 2001 Wilding et al., 2001 Dumollard et al., 2006 Zhang et al., 2008). As mitocôndrias são organelas semiautônomas que estão envolvidas na produção de energia e no buffer de cálcio na célula. Eles produzem espécies reativas de oxigênio (ROS) como um subproduto da cadeia de transporte de elétrons e metabólitos importantes que interagem com vários processos em uma célula eucariótica.

As mitocôndrias são pequenas e fragmentadas nos embriões de vertebrados e invertebrados da blastoderme (Bavister e Squirrell, 2000 Sathananthan e Trounson, 2000 Van Blerkom et al., 2002 Dumollard et al., 2007 Chowdhary et al., 2017). O tamanho e a forma mitocondrial são regulados por máquinas de fissão e fusão dedicadas. A proteína de fissão Drp1 (proteína relacionada à dinamina 1) oligomeriza ao redor da membrana mitocondrial externa para formar mitocôndrias filhas menores. Opa1 (atrofia óptica 1) e Mfn / Mfn2 (mitofusinas) (conjunto mitocondrial - fator regulador de Marf em Drosófila) estão envolvidos na fusão das membranas interna e externa, respectivamente (van der Bliek et al., 2013). A forma mitocondrial e a arquitetura das cristas foram correlacionadas com sua produção metabólica, ROS e tampão de cálcio (Yu et al., 2006 Hom et al., 2010 Chen et al., 2012 Cogliati et al., 2013 Mishra e Chan, 2016 Toyama et al., 2016). A perda de proteínas que regulam a morfologia mitocondrial durante a embriogênese leva à anulação do desenvolvimento. Camundongos knockout Drp1, Mfn e Opa1 são embrionários letais (Chen et al., 2003 Ishihara et al., 2009 Wakabayashi et al., 2009 Moore et al., 2010).

A regulação da morfologia mitocondrial é importante para o transporte mitocondrial eficiente dentro das células. As mitocôndrias viajam em microtúbulos com a ajuda de motores específicos para locais distintos na célula (Yaffe et al., 1996, Hollenbeck e Saxton, 2005, Saxton e Hollenbeck, 2012 Schwarz, 2013). Seu transporte para locais distintos nos neurônios é necessário para o suprimento de energia local e o buffer de cálcio, que é essencial para a função da sinapse neuronal (Morris e Hollenbeck, 1993 Mironov e Symonchuk, 2006 Rice e Gelfand, 2006 Saotome et al., 2008 Wang e Schwarz, 2009). Mitocôndrias fundidas em neurônios mutantes Drp1 se acumulam no corpo celular e axônio e levam à redução da atividade sináptica (Verstreken et al., 2005 Rikhy et al., 2007).

A literatura em conjunto aponta para o envolvimento da forma e função mitocondrial nos processos morfogenéticos na embriogênese dos metazoários. No entanto, o mecanismo e a função da regulação da morfologia mitocondrial durante a embriogênese ainda precisam ser estudados. Neste estudo, pretendemos discernir a função da morfologia mitocondrial e distribuição durante a formação celular em Drosófila embriogênese. o Drosófila O embrião da blastoderme é um sincício onde os ciclos nucleares (NC) 1–13 ocorrem em um citoplasma comum. A formação de células ocorre na interfase prolongada de NC14 em um processo denominado celularização. Durante a celularização, as membranas celulares curtas de aproximadamente 3–5 µm de comprimento estendem-se basalmente de maneira síncrona em todo o embrião. Isso forma uma camada cortical de aproximadamente 6.000 células epiteliais de altura de 40-45 μm de altura em cerca de 45-50 min (Lecuit e Wieschaus, 2000 Mazumdar e Mazumdar, 2002). A extensão da membrana é acompanhada pela montagem de estruturas contráteis de actomiosina nas frentes de membrana de ingresso (Warn e Robert-Nicoud, 1990 Young et al., 1991 Schejter e Wieschaus, 1993 He et al., 2016), juntamente com proteínas de remodelação do citoesqueleto (Afshar et al., 2000 Field et al., 2005 Grosshans, 2005 Mavrakis et al., 2014) para contrair a membrana na base e encerrar o conteúdo citoplasmático dentro das células.

Nós examinamos se a morfologia e distribuição mitocondrial são reguladas durante Drosófila celularização. As mitocôndrias são pequenas, fragmentadas e abundantes no sincicial Drosófila embriões (Chowdhary et al., 2017). Descobrimos que as mitocôndrias foram fragmentadas e enriquecidas basalmente no início da celularização. Sua distribuição tornou-se pronunciada apicalmente durante a celularização por transporte baseado em microtúbulos. O transporte apical de mitocôndrias falhou após seu agrupamento em embriões mutantes da proteína de fissão mitocondrial Drp1. A depleção de Drp1 resultou em uma diminuição nas ROS citoplasmáticas e defeitos no ingresso no sulco e constrição do anel contrátil, semelhante àquela em mutantes de miosina II. Esses defeitos foram suprimidos após a fissão mitocondrial forçada e elevação de ROS citoplasmáticos em embriões mutantes Drp1. Nosso estudo propõe um papel para a morfologia mitocondrial e atividade na manutenção de um limiar de função ativa da miosina II para conduzir a formação de células e constrição do anel contrátil durante Drosófila embriogênese.


Resumo

Objetivo-

A ativação de células endoteliais (EC) induzida por hiperlipidemia é considerada um evento inicial responsável pelo recrutamento de monócitos na aterogênese. No entanto, permanece mal definido qual é o mecanismo subjacente à ativação da CE induzida por hiperlipidemia. Aqui, testamos uma nova hipótese de que as espécies reativas mitocondriais de oxigênio (mtROS) servem como mediadores de sinalização para a ativação de EC na aterosclerose inicial.

Abordagem e resultados -

Análises metabolômicas e transcriptômicas revelaram que várias espécies de lisofosfatidilcolina (LPC), como 16: 0, 18: 0 e 18: 1, e suas enzimas de processamento, incluindo Pla2g7 e Pla2g4c, foram significativamente induzidas nas aortas de camundongos knockout para apolipoproteína E durante aterosclerose precoce. Usando ressonância de spin de elétrons e citometria de fluxo, descobrimos que LPC 16: 0, 18: 0 e 18: 1 induziu mtROS em ECs primários de aorta humana, independentemente das atividades da nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidase. Mecanisticamente, usando microscopia confocal e analisador mitocondrial Seahorse XF, mostramos que o LPC induziu mtROS via aumento único mediado pela entrada de cálcio do vazamento de prótons e O mitocondrial2 redução. Além disso, descobrimos que mtROS contribuiu para a ativação de EC induzida por LPC, regulando a ligação nuclear da proteína 1 ativadora e induzindo a expressão do gene da molécula 1 de adesão intercelular in vitro. Além disso, mostramos que o inibidor de mtROS, MitoTEMPO, suprimiu a ativação de EC e o recrutamento de monócitos aórticos em camundongos knockout para apolipoproteína E usando microscopia intravital e métodos de citometria de fluxo.

Conclusões -

A síntese de ATP - desacoplada, mas acoplada ao vazamento de prótons, o aumento de mtROS medeia a ativação de EC induzida por LPC durante a aterosclerose inicial. Esses resultados indicam que os antioxidantes mitocondriais são terapias promissoras para a inflamação vascular e doenças cardiovasculares.

A aterosclerose é um processo patogênico inflamatório crônico das artérias, que leva a doenças cardiovasculares (DCVs), incluindo infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral. 1 Apesar das terapias atuais, as DCV continuam sendo a causa número um de morte nos Estados Unidos. 2 Nós e outros demonstramos anteriormente que a hiperlipidemia, juntamente com outros estressores de DCV, como a hiperglicemia e a hiper-homocisteinemia, promovem a aterosclerose por meio de vários mecanismos. Esses mecanismos incluem ativação e lesão das células endoteliais (EC) 3,4 recrutamento e diferenciação de monócitos 5,6 células T reguladoras diminuídas 7,8 e capacidade de reparo vascular prejudicada das células progenitoras derivadas da medula óssea. 9,10 A ativação da CE induzida por hiperlipidemia é considerada um evento inicial responsável pelo recrutamento de monócitos na aterogênese. 1 No entanto, o mecanismo molecular subjacente à ativação da CE induzida por hiperlipidemia permanece mal definido.

As lisofosfatidilcolinas (LPCs) são um grupo de lipídios pró-inflamatórios que estão criticamente envolvidos na patogênese da aterosclerose. 11 Múltiplas linhas de evidência indicam que os LPCs aórticos são induzidos na aterosclerose avançada. Já em 1969, foi relatado que a concentração de LPCs aórticos de macacos alimentados com uma dieta aterogênica por 3 a 6 meses era quase 8 vezes maior do que a do grupo de controle. 12 Além disso, porcos diabéticos e hipercolesterolêmicos com aterosclerose coronariana avançada apresentaram um aumento de 305% no conteúdo arterial de LPC. 13 Além disso, diferentes espécies de LPC, incluindo palmitoil-LPC (16: 0), estearoil-LPC (18: 0) e oleoil-LPC (18: 1), foram ≈2 vezes maiores em placas ateroscleróticas associadas a sintomas do que aquelas em placas assintomáticas em humanos. 14 No entanto, se o LPC é induzido durante a aterogênese inicial permanece desconhecido.

Foi demonstrado há 30 anos que quando a lipoproteína de baixa densidade foi incubada com ECs, a lipoproteína de baixa densidade foi oxidada e até 40% do fosfolipídio da lipoproteína de baixa densidade foi hidrolisado em LPC pela ação enzimática da fosfolipase. 15 Posteriormente, foi descoberto que o LPC poderia ativar de forma potente os ECs e induzir a adesão de monócitos ao regular positivamente a expressão do gene da molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) em ECs da veia umbilical humana (HUVECs). 16 Além disso, tanto o inibidor de espécies reativas de oxigênio (ROS) quanto o inibidor de cálcio intracelular poderiam bloquear a expressão do gene ICAM-1 induzida por LPC em HUVECs. 17 Além disso, o LPC também ativou fatores de transcrição pró-inflamatórios, como o fator nuclear-κB (NF-κB) e a proteína ativadora-1 (AP-1), em HUVECs. 18 No entanto, a fonte de ROS que contribui para a ativação de EC induzida por LPC e as ligações mecanísticas entre esses eventos de sinalização celular permanecem obscuras.

Existem várias fontes celulares de ROS, incluindo a cadeia de transporte de elétrons mitocondrial, nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidase (NADPH oxidase), xantina oxidase, óxido nítrico sintase desacoplado e citocromo P450. Como um dos principais contribuintes para as ROS celulares, as ROS mitocondriais (mtROS) são geradas a partir da redução parcial do oxigênio para formar superóxido no complexo I e complexo III na cadeia de transporte de elétrons mitocondrial. 19 Embora os mtROS sejam historicamente considerados subprodutos tóxicos do metabolismo mitocondrial, foi descoberto recentemente que os mtROS são, de fato, moléculas sinalizadoras que contribuem diretamente para a produção de citocinas pró-inflamatórias, 19 independentemente do gerador citosólico de ROS, NADPH oxidase. 20 Além disso, a produção de mtROS é regulada por vários fatores, como potencial de membrana mitocondrial, Ca 2+ mitocondrial e vazamento de próton mitocondrial. 19 No entanto, como os mtROS e a produção de ATP estão acoplados à atividade da cadeia de transporte de elétrons, ainda não se sabe como os mtROS podem ser induzidos independentemente da síntese de ATP.

Assim, apesar do progresso recente, existem 2 lacunas de conhecimento importantes: primeiro, permanece desconhecido se a expressão de LPC é aumentada durante a aterosclerose inicial, segundo, a fonte intracelular de ROS, que contribui para a ativação de EC aórtica induzida por LPC, não é clara. Neste estudo, testamos uma nova hipótese de que os mtROS servem como mediadores de sinalização para a ativação de EC induzida por LPC. Usando análise metabolômica e perfil de microarray, bem como abordagens de bioquímica e biologia molecular, descobrimos que os LPCs foram induzidos na aorta durante a aterosclerose inicial e que o mtROS media a ativação de EC induzida por LPC. Além disso, descobrimos um novo mecanismo desacoplado de síntese de ATP, mas acoplado a vazamento de prótons, que impulsiona a produção de mtROS na célula. Assim, mtROS pode servir como um novo alvo para intervenção terapêutica na inflamação vascular e DCVs.

Materiais e métodos

Materiais e métodos estão disponíveis no suplemento de dados apenas online.

Resultados

LPCs são induzidos na aorta durante a aterosclerose inicial em camundongos

Para determinar se LPC está envolvido no desenvolvimento inicial da aterosclerose, examinamos os níveis de LPC nas aortas de camundongos knockout para apolipoproteína E (ApoE - / -) (um modelo de camundongo aterosclerótico) em comparação com os de camundongos de controle do tipo selvagem. Realizamos uma análise metabolômica não direcionada nas aortas desses camundongos alimentados com dieta rica em gordura por 3 semanas (Figura I no suplemento de dados apenas online). Digno de nota, dieta rica em gordura do tipo ocidental foi usada para acelerar a aterosclerose, e nós e outros demonstramos anteriormente que em camundongos ApoE - / - alimentados com dieta rica em gordura por 3 semanas, o nível de colesterol plasmático triplicou, mas o mínimo de placa se desenvolveu na aorta. 3,21 Assim, ele serve bem como um modelo de camundongo com aterosclerose precoce. Fomos capazes de detectar 8 espécies diferentes de LPC nas aortas de camundongos do tipo selvagem e ApoE - / -. As 3 espécies mais abundantes na aorta incluem palmitoil-LPC (16: 0), estearoil-LPC (18: 0) e oleoil-LPC (18: 1). Surpreendentemente, todas as espécies LPC detectadas foram significativamente induzidas nas aortas de camundongos ApoE - / -, com exceção de linoleoil-LPC (18: 2) (Figura 1A). O LPC é produzido pela ação enzimática da fosfolipase A2 (PLA2) na fosfatidilcolina e o PLA2 membros de enzimas da superfamília estão criticamente envolvidos na aterosclerose. 11,22 Por essas razões, examinamos também as alterações de expressão gênica de todos os PLA2 enzimas da superfamília entre camundongos ApoE - / - e camundongos do tipo selvagem usando análise de microarray. Os resultados mostraram que Pla2g7 (também conhecido como PLA associado à lipoproteína2) e Pla2g4c foram significativamente induzidos nas aortas de camundongos ApoE - / - na aterosclerose precoce (Figura 1B Tabela I no Suplemento de Dados apenas online). Notavelmente, os níveis de expressão de 3 genes de manutenção estavam dentro da faixa de 0,97 a 1,06, sugerindo a alta qualidade de nossa análise de microarray e a especificidade de PLA2 regulação positiva. É possível que o LPC aórtico possa estar aumentado devido ao aumento da disponibilidade de substrato em camundongos ApoE - / -. No entanto, é improvável que seja o caso porque vários ácidos graxos de cadeia longa, incluindo palmitato (16: 0), estearato (18: 0) e oleato (18: 1n9), não foram significativamente aumentados nas aortas de ApoE - / - ratos (Figura I no suplemento de dados apenas online). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que o LPC é induzido durante a aterosclerose inicial, presumivelmente devido à indução da expressão das enzimas Pla2g7 e Pla2g4c (Figura I no suplemento de dados apenas online).

Figura 1. As espécies de lisofosatidilcolina aórtica (LPC) são induzidas durante a aterogênese inicial em camundongos. Camundongos do tipo selvagem (WT) de oito semanas de idade e camundongos knockout para apolipoproteína E (ApoE - / -) foram alimentados com dieta rica em gordura por 3 semanas antes de serem sacrificados. Aortas foram coletadas desses camundongos para análise metabolômica (UMA) e análise de microarray (B). UMA, Espécies LPC aórticas foram induzidas durante a aterosclerose inicial. Mudanças relativas de LPC aórtica entre WT e ApoE - / - foram mostradas (n = 8 por grupo). B, Enzimas geradoras de LPC, incluindo Pla2g4c e Pla2g7, foram induzidas nas aortas durante a aterosclerose inicial. O gráfico do vulcão foi apresentado, o qual mostrou mudança de dobra e estatísticas P valor das mudanças de expressão da fosfolipase A2 membros da superfamília e 3 genes de manutenção (Actb, Gapdh, e Não não) entre camundongos ApoE - / - e camundongos WT (n = 5 por grupo de triângulo sólido, fosfolipase A significativamente aumentada2 [PLA2] genes diamante cinza, PLA inalterado2 genes círculo vazio, controle de genes de manutenção). Para todos os painéis, os valores representam a média ± SEM. NS indica não significativo. *P& lt0,05 **P& lt0.01 ***P& lt0.001.

LPC induz mtROS independentemente de NADPH Oxidase, em ECs de aorta humana

Em seguida, hipotetizamos que a indução de LPC aórtica poderia contribuir para o desenvolvimento de aterosclerose, promovendo a ativação do CE aórtico. Deve-se notar que macrófagos lesionais também estão presentes na aterosclerose inicial, mas nosso estudo atual se concentra na investigação do papel do LPC na ativação da CE aórtica. Foi demonstrado anteriormente que a ativação de EC induzida por LPC em HUVECs. 16 Além disso, a ativação de EC induzida por LPC em HUVECs poderia ser bloqueada por difenilenoiodônio, 17 que inibe a geração de ROS a partir da mitocôndria, bem como a NADPH oxidase, esta última sendo um importante gerador de ROS citosólico. Assim, a fonte intracelular de ROS que contribui para a ativação de ECs aórticos humanos induzida por LPC (HAEC) permanece para ser especificada. Para examinar esta questão, primeiro comparamos os efeitos do LPC na produção de mtROS e ROS citosólicos em HAECs simultaneamente usando o método de ressonância de spin de elétrons. Descobrimos que 10 µmol / L palmitoyl-LPC (16: 0) induziu rapidamente a produção de mtROS em 30 minutos, que durou pelo menos 6 horas e diminuiu após 24 horas (Figura 2A e 2B). Além disso, o LPC induziu ROS citosólicas de maneira semelhante, mas em menor grau (Figura 2B). É importante notar que um inibidor específico da NADPH oxidase, VAS-2870, não evitou os mtROS induzidos por LPC em HAECs, mas sim aumentou ainda mais (Figura 2C). Digno de nota, o tratamento com VAS-2870 sozinho também induziu significativamente mtROS em HAEC, sugerindo que mtROS pode ser induzido para compensar a perda de ROS citosólicas na célula. É possível que o próprio VAS-2870 possa ter estimulado a produção de mtROS, além de inibir a NADPH oxidase. No entanto, é improvável que seja o caso porque outro inibidor específico da NADPH oxidase, VAS3947, induziu mtROS de forma semelhante (dados não mostrados). Além disso, o indutor de mtROS, Antimicina A, induziu mtROS e ROS citosólicas, enquanto o ativador de NADPH oxidase, acetato de miristato de forbol, induziu apenas ROS citosólicas (Figura 2D). Tomados em conjunto, esses resultados demonstraram que os mtROS induzidos por LPC estão localizados a montante do pipeline na geração de ROS citosólicas.

Figura 2. A lisofosatidilcolina (LPC) induz espécies reativas mitocondriais de oxigênio (mtROS) em células endoteliais da aorta humana (HAECs). UMA, MtROS induzidos de forma dependente do tempo de LPC. HAECs foram tratados com LPC (16: 0, 10 μmol / L) para diferentes pontos de tempo, e alíquotas de células foram incubadas com MitoTEMPO-H (1 mmol / L) a 37 ° C por 20 min antes da análise de ressonância spin eletrônica (ESR) (n = 4 P valores vs controle). B, MtROS mais elevados do que as espécies reativas de oxigênio citosólico (ROS) foram induzidos por LPC. HAECs foram tratados com LPC (16: 0, 10 μmol / L) para diferentes pontos de tempo, e alíquotas de células foram incubadas com sonda giratória mtROS MitoTEMPO-H (1 mmol / L, linha vermelha) ou sonda giratória ROS citosólica CP-H (1-hidroxi-3-carboxi-pirrolidina 1 mmol / L, linha verde) a 37 ° C por 20 min antes da medição por ESR. C, O efeito da inibição da nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase em mtROS induzidos por LPC. Após o carregamento com MitoSOX (5 μmol / L) por 10 min, HAECs foram tratados com LPC (16: 0, 10 μmol / L) com ou sem inibidor de NADPH oxidase VAS-2870 (5 μmol / L) por 1 h antes da citometria de fluxo análise (n = 6). Foi mostrada a alteração de vezes da população de células MitoSOX +. D, O efeito da ativação de NADPH oxidase em mtROS. HAECs foram tratados com Antimicina A (5 μmol / L) ou acetato de miristato de forbol (5 μmol / L) por 1 h, e as células foram incubadas com a sonda mtROS MitoTEMPO-H (1 mmol / L) e a sonda ROS citosólica CP-H ( 1 mmol / L) antes da medição por ESR. Os sinais de ESR foram mostrados e as alterações de dobra foram quantificadas medindo a diferença entre o sinal da sonda de rotação máximo e mínimo. E, MtROS induzidos de forma dependente da dose de LPC. Após o carregamento com MitoSOX (5 μmol / L) por 10 min, HAECs foram tratados com diferentes doses de LPC (16: 0) variando de 2,5 a 40 μmol / L por 1 h antes da análise de citometria de fluxo (n = 8 P valores vs controle). F, Maior concentração de citotoxicidade induzida por LPC. HAECs foram tratados com diferentes doses de LPC (16: 0) por 1 h, e os meios celulares foram coletados para a medição da liberação de lactato desidrogenase (LDH) como um indicador de citotoxicidade (n = 15 P valores vs controle). G, Três espécies principais de LPC, todas induziram mtROS. Três espécies principais de LPC (10 μmol / L), incluindo LPC (16: 0), LPC (18: 0) e LPC (18: 1), todas induziram significativamente mtROS em HAEC após 1 h de tratamento, conforme medido por MitoSOX usando citometria de fluxo método (n = 6 P valores vs controle). H, Visualização da indução de mtROS por LPC. Após o tratamento de HAEC com controle de veículo ou LPC (16: 0, 10 μmol / L) por 1 h, a coloração com MitoSOX foi visualizada por microscopia de fluorescência. Os dados são representativos de 3 campos escolhidos aleatoriamente. Para todos os painéis, os valores representam a média ± SEM e os dados são representativos de pelo menos 2 experimentos independentes. NS indica não significativo. *P& lt0,05 **P& lt0.01 ***P& lt0.001.

Para confirmar os resultados da ressonância de spin eletrônico, usamos outra sonda de fluorescência mtROS específica, MitoSOX, combinada com o uso de citometria de fluxo e descobrimos que LPC aumentou de forma dependente da dose a produção de mtROS em HAECs (Figura 2E). A dosagem mais alta de LPC (40 μmol / L), no entanto, não induziu mais mtROS, mas foi citotóxica (Figura 2E e 2F). Além disso, descobrimos que a indução de mtROS é uma característica comum compartilhada pelos membros da família LPC porque todas as 3 espécies principais de LPC, incluindo LPC (16: 0), LPC (18: 0) e LPC (18: 1) , produção de mtROS induzida de forma semelhante em HAECs (Figura 2G). Como o LPC (16: 0) foi a espécie de LPC aórtica mais abundantemente expressa (Figura 1A), 10 μmol / L LPC (16: 0) foi usado a seguir neste estudo. Finalmente, usamos um terceiro método, microscopia de fluorescência, e confirmamos que o LPC induziu mtROS em HAECs (Figura 2H). Coletivamente, esses resultados indicam que três espécies principais de LPC, reguladas positivamente em aortas ateroscleróticas iniciais (Figura 1A), podem induzir mtROS em HAECs. Embora altos níveis de mtROS induzidos por uma alta concentração de LPC estejam associados à morte de EC, níveis moderados de mtROS estimulados por 10 µmol / LPC de LPC podem servir como moléculas de sinalização para ativação de EC.

A entrada de Ca 2+ mitocondrial media a produção de mtROS induzida por LPC aumentando o vazamento de prótons mitocondrial e a redução de oxigênio em HAECs

A produção de mtROS é regulada por vários fatores, como o estado metabólico da mitocôndria, o potencial de membrana mitocondrial e o influxo de Ca 2+ mitocondrial. 19,23 Porque estudos anteriores relataram que o LPC poderia induzir níveis citosólicos de Ca 2+ 24 e que o influxo de Ca 2+ na mitocôndria é um regulador positivo do O mitocondrial2 taxas de redução, 25 hipotetizamos que a entrada de Ca 2+ induzida por LPC na mitocôndria poderia levar ao aumento da produção de mtROS. Primeiro, examinamos os efeitos do LPC nos níveis citosólico e mitocondrial de Ca 2+ simultaneamente usando microscopia confocal. Os resultados mostraram que o LPC induziu Ca 2+ citosólico de forma dramática, o que foi rapidamente seguido pela indução de Ca 2+ mitocondrial (Figura 3A e 3B). O pico de resposta da entrada de Ca 2+ mitocondrial foi semelhante ao do Ca 2+ citosólico, e ambos os sinais duraram pelo menos 5 minutos (Figura 3B e 3C). Estes resultados indicam que o LPC induz a entrada mitocondrial de Ca 2+ do citosol.

Figura 3. A lisofosatidilcolina (LPC) induz a entrada de Ca 2+ mitocondrial em HAECs. UMA, LPC induziu Ca 2+ citosólico e Ca 2+ mitocondrial em HAEC. HAECs carregados com Ca 2+ citosólico (cytoCa 2+) indicador Fluo-4 / AM (verde) e Ca 2+ mitocondrial (mitoCa 2+) indicador Rhod-2 (vermelho) foram estimulados por 10 μmol / LPC LPC e analisados ​​por confocal microscopia. As imagens foram tiradas antes e depois da estimulação do LPC. B, O Ca 2+ mitocondrial induzido por LPC seguiu rapidamente após o aumento do Ca 2+ citosólico. O rastreamento em tempo real da mobilização citosólica e mitocondrial de Ca 2+ em resposta ao LPC a partir da análise de microscopia confocal foi mostrado. Cada linha representa o valor médio de 3 células. C, LPC induziu níveis semelhantes de Ca 2+ mitocondrial e Ca 2+ citosólico. A quantificação do pico de resposta de Ca 2+ citosólico e Ca 2+ mitocondrial a partir da análise de microscopia confocal foi mostrada (n = 9). Para todos os painéis, os valores representam a média ± SEM e os dados são representativos de pelo menos 3 experimentos independentes. ***P& lt0.001. CytoCa 2+ indica Ca 2+ F / F citosólico0, razões de intensidade de fluorescência e mitoCa 2+, Ca 2+ mitocondrial.

Em seguida, formulamos a hipótese de que a entrada de Ca 2+ mitocondrial induzida por LPC poderia levar à produção de mtROS em HAECs. Para examinar isso, usamos vermelho de rutênio (RR), que é um inibidor uniporter de cálcio mitocondrial (MCU) que pode bloquear a entrada de Ca 2+ na mitocôndria. Descobrimos que RR aboliu completamente a produção de mtROS induzida por LPC (Figura 4A), indicando que a entrada de Ca 2+ mitocondrial medeia mtROS induzidos por LPC em HAECs. Para determinar como a entrada de Ca 2+ mitocondrial induzida por LPC acelerou a produção de mtROS, utilizamos o Seahorse XF96 Analyzer para avaliar as funções mitocondriais. O analisador Seahorse XF pode medir 6 parâmetros mitocondriais diferentes, incluindo O mitocondrial2 taxa de redução, O não mitocondrial2 taxa de redução, vazamento de prótons, produção de ATP, respiração máxima e capacidade respiratória sobressalente (Figura II no suplemento de dados somente online). Descobrimos que o LPC induziu significativamente O mitocondrial2 taxa de redução, mas não afetou O não mitocondrial2 taxa de redução (Figura 4B e 4C), que se correlacionou com nossos achados anteriores de que as ROS estimuladas por LPC se originaram da mitocôndria, mas não do citosol (Figura 2). Além disso, o inibidor de MCU, RR, inibiu significativamente o O mitocondrial induzido por LPC2 taxas de redução (Figura 4C), correlacionando-se com as descobertas anteriores de que a entrada de Ca 2+ mitocondrial medeia mtROS induzidos por LPC em HAECs (Figura 4A). LPC também aumentou significativamente as taxas de respiração máxima, mas não alterou a capacidade respiratória de reserva das mitocôndrias (Figura 4C), o que sugeriu que O máximo induzido por LPC2 o aumento da redução foi principalmente devido ao aumento de O basal2 redução. A taxa de O mitocondrial2 a redução está associada às taxas de produção de ATP e vazamento de prótons (Figura II no suplemento de dados somente online). O vazamento de prótons mitocondrial é a reentrada de prótons do espaço intermembranar na matriz mitocondrial independente da síntese de ATP, que geralmente leva a uma diminuição no potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm). 25 Curiosamente, descobrimos que o LPC induziu significativamente o vazamento de prótons, mas não a produção de ATP, e que o vazamento de prótons induzido por LPC poderia ser bloqueado pelo inibidor de MCU, RR (Figura 4C). Além disso, LPC não alterou ΔΨm em HAECs (Figura 4D), enquanto o desacoplador químico de membrana mitocondrial, FCCP (cianeto de carbonila-p-trifluorometoxifenilhidrazona), diminuiu significativamente ΔΨm. Estes resultados sugerem o seguinte: primeiro, a entrada de Ca 2+ mitocondrial induzida por LPC estimula preferencialmente o vazamento de prótons, mas não a síntese de ATP, sugerindo que LPC em dose baixa não é um estímulo gerador de energia em ECs, segundo, o vazamento de prótons induzido por LPC é usado por CE para a indução de O2 redução na cadeia de transporte de elétrons terceiro, mtROS são aumentados em resposta à estimulação LPC e revertidos pelo inibidor de MCU RR, e quarto, o vazamento de prótons induzido por LPC é equivalente ao efluxo de prótons no espaço intermembrana, de modo que o potencial da membrana mitocondrial não seja afetado. Tomados em conjunto, esses resultados indicam que o LPC induz a entrada mitocondrial de Ca 2+, o que aumenta a síntese de ATP - desacoplado, mas acoplado ao vazamento de prótons, mtROS (Figura 4E).

Figura 4. A entrada mitocondrial de Ca 2+ medeia espécies de oxigênio reativo mitocondrial induzidas por lisofosatidilcolina (LPC) (mtROS) aumentando o O mitocondrial2 redução e vazamento de prótons em células endoteliais da aorta humana (HAECs). UMA, LPC induziu mtROS via entrada de Ca 2+ mitocondrial. Após o carregamento com MitoSOX (5 μmol / L) por 10 min, HAECs foram tratados com controle de veículo, LPC (10 μmol / L) ou LPC (10 μmol / L) mais vermelho de rutênio (RR) (10 μmol / L) para 1 h, e mtROS foram medidos por citômetro de fluxo (n = 8). B e C, O mitocondrial induzido por LPC2 redução e vazamento de prótons via entrada mitocondrial de Ca 2+. Após a adição do controle de veículo, LPC (10 μmol / L) e LPC (10 μmol / L) mais RR (10 μmol / L), a taxa de consumo de oxigênio (OCR) foi medida a cada 20 min por 1 h. Posteriormente, o Teste de Estresse XF Mito foi realizado pela adição sequencial de Oligomicina (1 μmol / L), cianeto de carbonila-p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP 1 μmol / L) e rotenona (1 μmol / L). Curva de experimento (B) e quantificação de 6 parâmetros mitocondriais (C) foram mostrados (n = 6). D, LPC não afetou o potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm). After HAECs were treated with vehicle control, LPC (10 μmol/L), or FCCP (1 μmol/L) for 1 h, they were loaded with ΔΨm probe tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM 30 nmol/L) for 20 min, and ΔΨm was measured by flow cytometer (n=4 P values vs control). E, Schematic representation of how LPC induced mtROS. For all panels, values represent mean±SEM, and data are representative of at least 2 independent experiments. MFI indicates mean fluorescence intensity and NS, not significant. *P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001.

Because ROS production in mitochondria is determined by the rates of both mtROS production and disposal, 19 we also investigated the effects of LPC on regulating the expression of mitochondrial antioxidant superoxide dismutase 2 and uncoupling molecules including uncoupling protein 3 and adenine nucleotide translocator. We found that LPC did not regulate the expression of superoxide dismutase 2 and uncoupling protein 3, although there was a trend of adenine nucleotide translocator induction after LPC stimulation (Figure III in the online-only Data Supplement). Adenine nucleotide translocator, also known as the ADP/ATP translocator, exports ATP from the mitochondrial matrix, imports ADP into the matrix, and also mediates both basal and inducible proton conductance. The induction of adenine nucleotide translocator by LPC correlated with the findings that LPC induced mitochondrial proton leak in HAECs (Figure 4C).

MtROS Contribute to LPC-Induced Upregulation of ICAM-1 and Other EC Activation–Related Genes by Regulating Nuclear Binding of AP-1

To determine the downstream effects of LPC-induced mtROS in ECs, we determined the effects of LPC in regulating EC-related gene expressions by performing Human Endothelial Cell Biology polymerase chain reaction (PCR) array profiling. HAECs were stimulated by LPC with or without a specific mtROS scavenger, MitoTEMPO. PCR array was performed afterward to screen for the changes of 84 genes related to EC functions, including vessel tone, angiogenesis, EC activation, and EC injury. We were able to detect the expressions of 57 genes in both control and LPC-treated HAECs. Among these 57 expressed genes, we found that 34 genes were induced >1.2-fold by LPC, and 3 genes were decreased >1.2-fold (Table II in the online-only Data Supplement). More importantly, we found that 14 out of these 34 LPC-induced genes (41.2%), such as ICAM-1, plasminogen activator, tissue, interleukin 6, and matrix metalloproteinase-2, could be blocked by cotreatment of mtROS inhibitor, MitoTEMPO. Importantly, the expression of EC adhesion molecule, ICAM-1, was the most sensitive gene in response to mtROS scavenging (Figure 5A). By using real-time polymerase chain reaction and Western blots, we confirmed that LPC increased ICAM-1 RNA and protein expression, which could be inhibited by MitoTEMPO cotreatment (Figure 5B and 5C). Furthermore, we performed monocyte adhesion assay and showed that LPC-treated HAECs had increased their adhesion to untreated monocytes, which was inhibited by MitoTEMPO (Figure 5D). Taken together, these results demonstrate that mtROS are required for LPC-induced EC activation by regulating the mRNA and protein expressions of certain EC biology–related genes, including ICAM-1.

Figura 5. Lysophoshatidylcholine (LPC)-induced mitochondrial reactive oxygen species (mtROS) are required for intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) upregulation in human aortic endothelial cells (HAECs). UMA, LPC induced ICAM-1 and other endothelial cell (EC) function–related genes via mtROS. HAECs were treated with vehicle control, LPC (10 μmol/L), and LPC (10 μmol/L) plus MitoTEMPO (1 μmol/L) for 6 h, and RNA was collected for Human EC Biology polymerase chain reaction (PCR) array (QIAGEN) analysis. Nonsupervised hierarchical clustering of genes was used to generate heat map to show the genes that were regulated by LPC-induced mtROS. Three samples were pooled in each group. B, Confirmation by real-time PCR. HAECs were treated with LPC (10 μmol/L) with/without MitoTEMPO (1 μmol/L) for 18 h before RNA was collected for real-time PCR analysis. Quantification of ICAM-1 RNA expression normalized by β-actin was shown (n=6). C, Confirmation by Western blot. HAECs were treated with LPC (10 μmol/L) with/without MitoTEMPO (1 μmol/L) for 18 h before proteins were collected for ICAM-1 expression. Representative Western blots from 3 independent experiments were shown. D, Effects of mtROS inhibition on LPC-induced monocyte adhesion to HAECs. HAECs were treated with LPC (10 μmol/L) with/without MitoTEMPO (1 μmol/L) for 4 h, after which the adhesion of nonstimulated, fluorescence-labeled human peripheral blood mononuclear cells to stimulated HAECs was quantified (n=5). For all panels, values represent mean±SEM, and data are representative of at least 2 independent experiments. *P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001.

Transcription factor–binding sites of NF-κB and AP-1 have been previously identified in the promoter region of ICAM-1 26 (Figure 6A). In addition, LPC has been shown to increase the nuclear translocation of NF-κB and AP-1 in HUVECs. 18 Thus, we hypothesized that LPC-induced mtROS contribute to the nuclear bindings of proinflammatory transcription factors to the promoter of ICAM-1 in HAECs, which leads to ICAM-1 upregulation. Using electrophoretic mobility shift assay, we showed that LPC potently induced nuclear translocation of AP-1 but weakly induced NF-κB in HAECs (Figure 6B and 6C). In addition, cotreatment of MitoTEMPO almost completely abolished LPC-induced AP-1 but not NF-κB nuclear binding. These results correlated well with our previous finding that AP-1 mediated LPC-induced EC activation. 3 Moreover, by performing a literature search, we found that out of the 14 upregulated genes that were the targets of LPC-induced mtROS (Figure 5A), 12 genes, including ICAM-1, were also previously proposed to be the downstream targets of AP-1 or ROS pathway (Table III in the online-only Data Supplement). Taken together, these results suggest that mtROS contributes to upregulated expressions of ICAM-1 and other genes involved in EC activation by upregulating AP-1–targeted gene transcription.

Figura 6. Mitochondrial reactive oxygen species (mtROS) contribute to lysophosphatidylcholine (LPC)-induced endothelial activation by upregulating nuclear binding of activator protein-1 (AP-1) on the promoter of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1). UMA, Putative AP-1 and nuclear factor-κB (NF-κB)–binding site in the promoter of ICAM-1. B e C, mtROS inhibitor MitoTEMPO blocked LPC-induced nuclear AP-1 binding. HAECs were treated with vehicle or LPC (10 μmol/L) for 1 h with or without MitoTEMPO (1 μmol/L) 1-h preincubation, and nuclear proteins were collected afterward for electrophoretic mobility shift assay (EMSA). Two micrograms of nuclear proteins were used for AP-1 EMSA (B) and 5 μg nuclear proteins were used for NF-κB EMSA (C) Representative images from 3 independent experiments were shown.

MtROS Inhibition Suppresses EC Activation and Monocyte Recruitment Into the Aorta During Early Atherosclerosis In Vivo

To examine whether mtROS contribute to EC activation during early atherosclerosis in vivo, we implanted the ALZET osmotic minipumps containing either saline control or MitoTEMPO (1500 μg/kg/d) subcutaneously into 8-week-old ApoE −/− mice before they were put on a high-fat diet for another 3 weeks. We determined their EC activation status afterward by examining leukocyte rolling and adhesion to the endothelium in cremaster muscle vessels using intravital microscopy. We found that MitoTEMPO significantly inhibited leukocyte rolling and adhesion to the endothelium on the postcapillary venule wall (Figure 7A and 7B). Of note, there was no difference in the venule diameters between the 2 groups (Figure 7C), suggesting that MitoTEMPO did not significantly change the venule diameters. In addition, we did not detect any leukocyte rolling or adhesion in the arterioles of the cremaster muscle (data not shown) because of the rapid movement of blood cells within these vessels, as shown previously. 27 Similarly, the high blood flow speeds and high pulse vibrations in middle and aortic arteries make the current technology of intravital microscope unsuitable in determining in vivo leukocyte rolling and adhesion to the endothelium in aortic arteries. 28 To determine whether MitoTEMPO could decrease the recruitment of monocytes into the aortas of ApoE −/− mice, we prepared aortic single cell suspensions from these mice and performed flow cytometric analysis with fluorescence-conjugated antibodies staining for Indo-1 (dead cell), CD45 (leukocyte), CD11b (monocyte), and Ly6c (inflammatory or resident monocyte), as we reported previously 6 (Figure 7D). The results showed that MitoTEMPO significantly decreased the recruitment of CD45 + CD11b + total monocytes as well as CD45 + CD11b + Ly6c + inflammatory monocytes into the aortas of ApoE −/− mice (Figure 7E and 7F), whereas MitoTEMPO did not significantly affect the recruitment of CD45 + CD11b + Ly6c − resident monocytes (Figure 7G). We further determined whether aortic monocyte composition changes resulted from the global changes in the peripheral blood monocyte composition. The results showed that MitoTEMPO did not significantly affect the populations of CD45 + CD11b + monocytes and CD45 + CD11b + Ly6C + monocytes in the blood (Figure IV in the online-only Data Supplement). Taken together, these results demonstrate that MitoTEMPO treatment suppresses aortic EC activation in ApoE −/− mice but do not rule out the potential beneficial effects of MitoTEMPO on lesional macrophages.

Figura 7. MitoTEMPO treatment decreases in vivo endothelial activation during early atherosclerosis. At 8 wk of age, minipumps containing saline or MitoTEMPO (1500 μg/kg/d) were implanted in ApoE −/− mice before they were fed with a high-fat diet for 3 wk. Afterward, intravital microscopy (A – C, n=4–6 mice per group, 3 vein vessels per mouse were recorded) and flow cytometry analyses (DG, n=7–9 mice per group) were performed to determine the endothelial activation status in vivo. UMA, MitoTEMPO treatment decreased leukocyte rolling to endothelium. Number of leukocytes that rolled past an imaginary line that was perpendicular to the vessels during a 1-min period observed. B, MitoTEMPO decreased leukocyte adhesion to endothelium. Number of cells adhered to the endothelium for 1 min, 100-µm length observed. C, MitoTEMPO did not change mean vessel diameter of venule. D, Gating strategy of aortic monocyte by flow cytometry. Total monocytes were gated as Indo-1 − CD45 + CD11b + , and inflammatory monocytes were gated as Indo-1 − CD45 + CD11b + Ly6c + . E, MitoTEMPO decreased aortic monocyte infiltration. Percentages of CD11b + monocytes (Gate A+B in C) in total aortic leukocyte cell population (Indo-1 − CD45 + ) were shown in each group. F, MitoTEMPO decreased aortic inflammatory monocyte infiltration. Percentages of CD11b + Ly6c + inflammatory monocytes (Gate B in C) in total aortic leukocyte cell population were shown in each group. G, MitoTEMPO did not significantly affect aortic resident monocyte infiltration. Percentages of CD11b + Ly6c − resident monocytes (Gate A in C) in total aortic leukocyte cell population were shown in each group. For all panels, values represent mean±SEM. NS indicates not significant. *P<0.05 ***P<0.001.

Discussão

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease that is a major pathogenic process underlying the development of coronary heart disease, stroke, and peripheral vascular disease. In spite of recent progress, novel anti-inflammatory strategies are still in urgent need for prevention and treatment of atherosclerotic CVD. 29 LPCs are a group of endogenous proinflammatory lipids considered to be a causative factor for atherosclerosis. For this reason, inhibitors of sPLA2 and Lp-PLA2, the key enzymes responsible for the generation of LPC, have been developed in the hope of developing novel anti-inflammatory therapies against atherosclerosis. 29 The beneficial effects of sPLA2 inhibitor (Varespladib) and Lp-PLA2 inhibitor (Darapladib) have been demonstrated in atherosclerotic animal models 13,30 and human phase 2 clinical trials. 31,32 However, 3 recent phase 3 clinical trials failed to show their therapeutic efficacy. 33–35 One possibility that may explain these failures is related to the fact that LPC also plays important physiological roles, such as stimulating insulin release from pancreatic β cells 36 and transporting essential fatty acids. 37 For this reason, targeting the pathogenic downstream effects of LPC, instead of blocking the production of LPC itself, may lead to the development of better therapeutics. Along this line, our approaches using metabolomics and transcriptomics in this study demonstrated that 7 out of 8 detected LPC species were induced in the aorta of early atherosclerotic mice, presumably because of increased expression of PLA2 in the aorta. More importantly, we found that proatherogenic lipid, LPC, via a mtROS-mediated mechanism, induced EC activation, which is an initiation step of atherogenesis. Therefore, blocking excessive mtROS production downstream of LPC might protect arteries against atherogenesis. This idea is supported by previous findings reporting that various other vascular stressors, including oxidized low-density lipoprotein, glucose, angiotensin II, hypoxia, and proinflammatory cytokines, also induced mtROS production in ECs. 19 In addition, pharmacological drugs, such as statins, metformin, resveratrol, and cannabidiol, could inhibit glucose-induced mtROS production in ECs. 19 Moreover, it has been shown previously that ApoE −/− mice deficient in superoxide dismutase 2 gene, which scavenges mtROS, displayed accelerated atherogenesis. 38 EC-specific overexpression of thioredoxin 2, another mitochondrial antioxidant enzyme, improved endothelial function and reduced atherosclerosis development in ApoE −/− mice. 39 Collectively, we and others have demonstrated a critical proatherogenic role for mtROS in EC activation during early atherosclerosis. Notably, LPC could also activate macrophages besides promoting EC activation 11 and diminishing mtROS in macrophages reduced lesion development in atherosclerotic mice. 40 Further study is needed to determine the role of LPC-induced mtROS in lesional macrophages during the development of atherosclerosis.

Previous studies have reported that LPC could induce nicotinamide adenine dinucleotide oxidase (mitochondrial)/NADPH oxidase (cytosolic)–related ROS in ECs. 41 In addition, it was found that LPC-induced ROS was more prominent in mitochondria and much less abundant in cytosol. 24 It has also been shown that mitochondria, rather than NADPH oxidase, was the major source of inflammatory ROS in monocytes. 20 Along the same line, we identified that LPC-induced mtROS production was independent of NADPH oxidase in ECs.

Even when there is ample oxygen, ECs rely heavily on glycolysis for their ATP demand, yet ECs contain functional mitochondria and little is known about the role of mitochondria in endothelium. 42 By using the novel, state-of-art mitochondrial Seahorse XF96 analyzer for assaying mitochondrial functions, we demonstrate that when ECs are activated, LPC induces mtROS by accelerating electron transport chain and proton efflux, which is uncoupled from ATP synthesis by simultaneously accelerating proton leak. Thus, we propose that one of the major functions of mitochondrial proton leak in ECs may be fine-tuning mtROS generation for cell-signaling purpose, such as endothelial activation. By doing this, in response to proatherogenic/proinflammatory stimuli including LPC, ECs could upregulate mtROS production without affecting ATP level and EC survival (Figure 8). This hypothesis is supported by the findings that mtROS were involved in regulating important physiological endothelial functions, such as hypoxia adaptation and angiogenesis effects, and in activating proinflammatory signaling pathways in response to various vascular stressors. 19

Figura 8. A new working model. Deixou, during early atherosclerosis, lysophosphatidylcholines (LPCs) are induced in the aorta, presumably because of increased expression of Pla2g4c and Pla2g7. LPC then induces cytosolic Ca 2+ , which then enters into the mitochondria of aortic endothelial cells. LPC-induced mitochondrial Ca 2+ then stimulates mitochondrial electron transport chain and proton leak without affecting ATP synthesis and mitochondrial membrane potential. As a result, mitochondrial reactive oxygen species (mtROS) are specifically induced without causing mitochondria injury. LPC-induced mtROS could then be released to the cytosol, where they regulate nuclear binding of activator protein-1 (AP-1) to the promoter of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and other genes, contributing to endothelial activation. Anterograde signaling describes signal transduction from cytosol to mitochondria, and retrograde signaling describes signal transduction from mitochondria to cytosol and nucleus. Direito, LPC induces ATP-uncoupled, but proton leak-coupled, mtROS. ΔΨm indicates mitochondrial membrane potential.

Although controversies exist regarding what the real LPC receptor(s) is in the cell, LPC has been shown to stimulate cytosolic Ca 2+ in different cell types. 11 In addition, it has been shown that LPC induced cellular Ca 2+ uptake from an extracellular source via transient receptor potential vanilloid 2 channel. 43 Interestingly, RR, which was used in this study for inhibiting MCU for mitochondrial Ca 2+ entry, could also potently inhibit transient receptor potential vanilloid 2 for cytosolic Ca 2+ entry. Future studies are needed to determine the roles of MCU and transient receptor potential vanilloid 2 in LPC-induced mtROS production.

To summarize (Figure 8), our study suggests that during early atherosclerosis, aortic LPCs are induced, presumably because of increased enzyme expression of Pla2g4c and Pla2g7. LPC then induces Ca 2+ entry from cytosol to mitochondria, where it drives ATP synthesis–uncoupled, but proton leak-coupled, mtROS. LPC-induced mtROS then regulate nuclear binding of AP-1 to the promoters of ICAM-1 and other EC activation–related genes, contributing to endothelial activation, monocyte adhesion to ECs, and monocyte recruitment into aorta. These findings are important, as they have improved our understanding of the molecular mechanisms of hyperlipidemia stimuli–induced EC activation in early atherogenesis. Such findings may, in turn, lead to the development of novel therapies, such as mitochondria-targeting antioxidant, which might greatly improve the outcome of CVDs.