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Como posso manter as células HEK vivas enquanto expresso os receptores NMDA?

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Estou tentando expressar receptores NMDA funcionais em células da linha HEK293 para experimentos de registro de canal único.

As células HEK são mantidas da maneira padrão (Thomas & Smart 2005) e transfectadas com cDNAs das subunidades NR1 e NR2x e também GFP, usando lipofectamina ou precipitação com fosfato de cálcio. A expressão de GFP sugere uma transfecção bem-sucedida, mas as células que exibem fluorescência verde estão uniformemente inchadas e mortas e é mais ou menos impossível obter um patch bem-sucedido. As células não transfectadas parecem permanecer perfeitamente viáveis.

Com base no fato de que a toxicidade pode ser uma consequência do Ca2+ influxo através de NMDARs abertos, tentei incluir um coquetel de bloqueadores no meio de crescimento, incluindo AP5, ácido cinurênico e Mg2+, mas as células transfectadas continuam a morrer.

Alguém pode sugerir algo mais que eu deva fazer para manter as células vivas? Ou estou apenas me escondendo para o nada? Outros pesquisadores parecem ter conseguido isso (por exemplo, Medina et al 1995, Vicini et al 1998) e não parecem estar fazendo nada substancialmente diferente, então estou um pouco perdido.


Tente, talvez, diminuir o nível de expressão de sua construção. As células HEK são notórias por expressar grandes quantidades de sua inserção transfectada. Você o tem sob um promotor CMV? Tente um mais suave, como um promotor de ubiquitina ou similar ou, melhor ainda, um sistema indutível por doxiciclina (por exemplo, clontech's tet off) para que você possa gerenciar os níveis de expressão através da concentração de dox / tempo de indução.


Resumo

Na lesão cerebral isquêmica aguda e na neurodegeneração crônica, a principal etapa que leva à excitotoxicidade e morte celular é a ativação excessiva e / ou prolongada dos receptores de glutamato (Glu), seguida por sobrecarga de cálcio intracelular (Ca 2+). Essas etapas levam a vários efeitos: uma despolarização persistente dos neurônios, disfunção mitocondrial resultando em falha de energia, um aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), um aumento na concentração de Ca 2+ citosólico [Ca 2+]eu, aumento da captação mitocondrial de Ca 2+ e ativação de mecanismos enzimáticos autodestrutivos. Espera-se que os antagonistas dos receptores NMDA (NMDARs) apresentem efeitos neuroprotetores, mas nenhuma evidência para apoiar essa hipótese foi relatada. Uma série de ensaios clínicos usando antagonistas NMDAR não conseguiram demonstrar efeitos neuroprotetores, seja pela redução da lesão cerebral ou pela prevenção da neurodegeneração. Avanços recentes na pesquisa NMDAR forneceram uma explicação para esse fenômeno. NMDARs sinápticos e extra-sinápticos são compostos por diferentes subunidades (GluN2A e GluN2B) que demonstram efeitos opostos. NMDARs contendo GluN2A sináptico e NMDARs extrassinápticos têm diferentes co-agonistas: d-serina para NMDARs sinápticos e glicina para NMDARs extra-sinápticos. Ambos os co-agonistas são de origem glial.

Os mecanismos de destruição celular ou sobrevivência celular em resposta à ativação de receptores NMDAR dependem em parte da [Ca 2+]eu e a rota de entrada deste íon e mais significativamente na composição de subunidades e localização dos NMDARs. Enquanto a ativação NMDAR sináptica está envolvida na neuroproteção, a estimulação de NMDARs extra-sinápticos, que são compostos de subunidades GluN2B, desencadeia vias de destruição celular e pode desempenhar um papel fundamental na neurodegeneração associada à excitotoxicidade induzida por Glu. Além disso, descobriu-se que os receptores NMDA sinápticos e extra-sinápticos têm efeitos opostos na determinação do destino dos neurônios. Este resultado levou ao direcionamento de NMDARs contendo GluN2B não sinápticos como candidatos promissores para a pesquisa de drogas. Em condições de hipóxia, é provável que a falha da transmissão glutamatérgica sináptica, o comprometimento da cascata neuroprotetora ativada por GluN2A e a superativação persistente de NMDARs contendo GluN2B extra-sinápticos levem à excitotoxicidade. A fluoxetina, um medicamento amplamente utilizado na prática clínica como antidepressivo, bloqueia seletivamente os NMDARs contendo GluNR2B. Portanto, parece ser um candidato potencial para neuroproteção.

Destaques

► Papel dos receptores NMDA contendo subunidades GluN2B extra-sinápticas na excitotoxicidade. ► Papel dos receptores NMDA contendo a subunidade GluN2A sináptica na neuroproteção. ► Efeito da fluoxetina. ► Estudos clínicos com diferentes antagonistas do receptor de glutamato. ► Antagonistas seletivos do receptor NMDA contendo a subunidade GluN2B.


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Introdução

As células de mamíferos, como o rim embrionário humano 293 (HEK-293) e as células de ovário de hamster chinês (CHO), são amplamente utilizadas como hospedeiros para expressar proteínas recombinantes para estudar suas propriedades estruturais, biofísicas e farmacológicas (Baldi et al., 2007 Dalton e Barton, 2014). As células HEK-293, em particular, são um sistema heterólogo atraente para a expressão de proteínas de membrana, não apenas porque têm máquinas de modificação pós-tradução necessárias para o dobramento adequado e / ou atividade biológica ideal das proteínas alvo. Eles também exibem alta eficiência de transfecção, tradução fiel e processamento de proteínas (Wurm, 2004) que resultará em maiores rendimentos de proteína (Backliwal et al., 2008a) em comparação com outras células de mamíferos, por exemplo, células CHO (Bollin et al. , 2011). Esses atributos juntamente com o tamanho da célula, morfologia, taxa de divisão rápida, facilidade de manutenção e baixa expressão de canais nativos, bem como a capacidade de expressar proteínas receptoras transgênicas e canais iônicos com alta fidelidade (Thomas e Smart, 2005), estabeleceram células HEK-293 como um hospedeiro de escolha para a expressão heteróloga transitória de proteínas de membrana para estudos estruturais (Nettleship et al., 2008 Chaudhary et al., 2011 Andrell e Tate, 2013), biofarmacêutico (Thomas e Smart, 2005 Jager et al., 2013) e aplicações de eletrofisiologia (Lemtiri-Chlieh e Ali, 2013).

Apesar dessas vantagens, a expressão de alto nível de proteínas de membrana complexas, como canais iônicos e receptores transmembranares originários de uma espécie diferente para medições de tensão de corrente, continua sendo um desafio (Gan et al., 2006 Allen et al., 2009). Para eletrofisiologia em particular, uma alta expressão de proteínas é crítica para registros de corrente de célula única no modo de célula inteira. A biossíntese de proteínas de membrana no hospedeiro é limitada pela composição diferente de bicamadas lipídicas entre humanos e outras espécies que podem impedir o dobramento adequado de proteínas expressas em suas conformações tridimensionais nativas funcionais. Como tal, a otimização de plasmídeos, meios de cultura, condições de crescimento ou combinações dos mesmos foram realizadas no passado para aumentar a expressão de proteínas de membrana (para revisão, ver J & # x000E4ger et al., 2015). Isso inclui a introdução de hipotermia leve (Wulhfard et al., 2008 Lin et al., 2015) e a adição de inibidores da histona desacetilase aos meios de cultura (Fan et al., 2005 Backliwal et al., 2008b). Além dos elementos essenciais necessários para a expressão da proteína recombinante, os vetores também podem ser projetados sinteticamente para incluir íntrons otimizados e uso de códons (Gustafsson et al., 2004) e elementos reguladores pós-transcricionais (Mariati et al., 2010) para aumentar os rendimentos estabilizando os transcritos recombinantes.

A entrega do vetor recombinante na célula hospedeira e a detecção de proteínas expressas são as duas etapas críticas cruciais para a expressão e estudo de proteínas recombinantes em células HEK-293. As proteínas recombinantes expressas em células transfectadas transitoriamente podem ser identificadas com um método que requer a co-transfecção simultânea de um antígeno marcador de superfície de linfócito (CD8-alfa) ou um plasmídeo de proteína fluorescente, além de um segundo vetor de expressão que contém o gene de interesse ( Lemtiri-Chlieh e Ali, 2013). Este método permite a identificação visual de células individuais decoradas com esferas de poliestireno revestidas com anticorpo anti-CD8 (Jurman et al., 1994 Fortin e Hugo, 1999) sob o microscópio de luz ou detecção de fluorescência de células que co-expressam as proteínas fluorescentes (Bestvater et al. , 2002 Lin et al., 2015) e tem sido usado para o estudo de canais iônicos e proteínas receptoras, incluindo o N-metil-D-aspartato de mamífero (NMDA Ehlers et al., 1996) e & # x003B1-amino-3- receptores de ácido hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiônico (AMPA) (Swanson et al., 1997 Lin et al., 2015), o Arabidopsis thaliana canais de íons controlados por nucleotídeos cíclicos (AtCNGCs) (Leng et al., 2002 Hua et al., 2003) e transportadores Arabidopsis K & # 43 (AKTs) (Lacombe et al., 2000 Cherel et al., 2002). Embora simples, rápida e barata, a expressão do antígeno marcador CD8-alfa ou da proteína fluorescente nas células transfectadas não tem correlação direta com a eficiência de transfecção e a expressão da proteína recombinante como a taxa de sucesso da introdução de ambos, marcador e alvo os vetores de expressão gênica nas células podem ser altamente variáveis. Métodos recentes usando marcadores fluorescentes, como um epítopo sensível a corante (Tour et al., 2003 Rudner et al., 2005) ou uma fusão de proteína fluorescente (Snapp, 2005) fornecem uma correlação direta e melhor entre o sinal fluorescente e a eficiência de transfecção e proteína nível de expressão, embora os marcadores de fusão, como proteínas fluorescentes, possam causar restrições estruturais que interferem com a função da proteína. Essas abordagens de detecção fluorescente permitiram a expressão bem-sucedida de uma série de proteínas de membrana, incluindo a conexina-43 (Gaietta et al., 2002), os receptores AMPA (Ju et al., 2004), os receptores acoplados à proteína G (Hoffmann et al. ., 2005) e o canal do gene humano relacionado ao éter-a-go-go (hERG) (Claassen et al., 2008 Huang et al., 2011) que foram subsequentemente usados ​​para localização e tráfego de proteínas, bem como voltagem de corrente estudos de medição.

Embora a expressão de várias proteínas de membrana e canais de íons em células HEK-293 tenham sido relatados anteriormente, um protocolo oficial detalhado que descreve os estágios principais na transfecção transitória e detecção na célula de proteínas recombinantes otimizadas para aplicações de uma única célula, está atualmente em falta. Aqui, usamos a expressão transitória de um A. thaliana célula de guarda retificadora para fora do canal K & # 43, AtGORK (At5G37500) em células HEK-293 como um exemplo para avaliar os reagentes de transfecção comumente usados ​​e os métodos de detecção fluorescente, e fornecer um protocolo específico que é facilmente acessível para a expressão geral de proteínas de membrana em células HEK-293 adequadas para caracterização biológica. Como um exemplo, AtGORK representa: (1) uma proteína de membrana de múltiplas passagens difícil de expressar, (2) se origina de uma espécie diferente e (3) precisa se montar em um complexo heteromérico para atingir a funcionalidade. Essas três características podem dificultar a expressão ideal de proteínas de membrana em células HEK. Além deste protocolo passo a passo oficial, também incluímos medidas cautelares e propomos estratégias de otimização e recomendações extensíveis e alteráveis ​​para diferentes aplicações ou proteínas.


Resultados

Efeito inibidor de NPA em receptores contendo N2A.

Registramos correntes de células HEK293 que expressam transitoriamente as subunidades GluN1-1a e GluN2A com o método patch-clamp de célula inteira. As soluções extracelulares continham concentrações máximas de agonista eficazes (1 mM de glutamato e 0,1 mM de glicina cada & # x0003e100 vezes EC50) EDTA a 0,01 mM e tinha baixa concentração de prótons (pH 8, HEPBS 10 mM). A inibição foi medida como diminuição na corrente de estado estacionário induzida pelo glutamato após a adição de NPA (0 & # x0201310 mM). A solubilidade limitada do NPA nos impediu de investigar concentrações mais altas. Ajustando os dados com a equação de Hill predita & # x0223c90% de inibição máxima, com NPA 1,9 mM produzindo metade da inibição máxima (Fig. 1). Este IC50 o valor é maior do que medido anteriormente em Xenopus oócitos (Costa et al., 2010), onde NPA 0,1 mM produziu 30% de inibição. Atribuímos essa discrepância às diferenças nas condições experimentais porque essas medições anteriores foram feitas em pH = 7,4, onde os receptores 2A são tonicamente & # x0223c50% inibidos (Traynelis e Cull-Candy, 1990) e na ausência de quelantes, quando traço de zinco e Os íons de magnésio inibem ainda mais as correntes 2A (Nowak et al., 1984 Paoletti et al., 1997).

Inibição de NPA de correntes de receptor N1 / N2A induzidas por glutamato em estado estacionário. (Esquerda) Respostas de células inteiras foram registradas a partir de células 293 de rim embrionário humano que expressam receptores N1 / N2A. As barras indicam aplicações de glutamato (1 mM) (branco) e co-aplicações de NPA (cinza). (À direita) Níveis de respostas de equilíbrio medidos depois que cada concentração de NPA foi normalizada para as respostas quando apenas o glutamato foi aplicado. Os círculos representam médias de valores normalizados nas células. A linha representa o ajuste da função logística para médias de respostas normalizadas para cada concentração: 0,4 mM (n = 4), 1 mM (n = 4), 2 mM (n = 4), 4 mM (n = 5), 10 mM (n = 4). IC50 é expresso como um intervalo de confiança de 95%.

Cinética de canal único de receptores contendo N2A ligados a NPA.

Para investigar o mecanismo de inibição de NPA, registramos correntes de patches de um canal ligado a células de células HEK293 que expressam receptores N1 / N2A com solução extracelular (pipeta) contendo 4 mM de NPA (& # x0223c2 vezes IC50) Semelhante aos nossos registros de células inteiras, a solução extracelular também continha glutamato (1 mM), glicina (0,1 mM) e EDTA (1 mM) para remover vestígios de cátions divalentes. Fixamos as concentrações de prótons a 10 nM (pH 8) com HEPBS 10 mM (Fig. 2A). Como controles, utilizamos um conjunto de gravações obtidas em condições idênticas e na ausência de NPA (CTR) (Fig. 2B). Ambos os conjuntos de dados incluíram apenas registros originados de um único canal ativo, e processamos e analisamos todos os registros conforme descrito em detalhes anteriormente (Kussius et al., 2009).

Efeitos do NPA na atividade de canal único dos receptores N1 / N2A. Os traços representam fluxos de sódio para dentro em estado estacionário registrados a partir de patches ligados a células que continham na pipeta de gravação um canal N1 / N2A ativo: (A) com NPA (4 mM) e (B) sem NPA (CTR). Para cada condição, um segmento de 20 segundos é ilustrado em duas resoluções de tempo nos painéis superior e intermediário, respectivamente os painéis inferiores expandem o segmento sublinhado e são exibidos filtrados, como para análises, a 12 kHz. Todos os traços representam as correntes de Na + como deflexões para baixo de uma linha de base de corrente zero Po indica a probabilidade de abertura calculada para todo o registro pai.

Descobrimos que 4 mM NPA diminuiu a probabilidade média de abertura de equilíbrio (Po) de receptores 2A a 38% do CTR sem alteração na amplitude de canal único (Tabela 1). Assim, a concentração de NPA selecionada foi suficiente para produzir um efeito substancial na ativação do canal e não teve efeito na condutância de canal único. Além disso, fomos capazes de atribuir a diminuição em Po para um aumento de & # x0223c100% no tempo médio de fechamento e uma diminuição de & # x0223c50% no tempo médio de abertura. Em seguida, examinamos com mais detalhes o mecanismo pelo qual esses efeitos cinéticos surgiram.

TABELA 1

Efeitos do NPA nas propriedades cinéticas médias dos receptores 2A individuais

AmplitudePoMCTMOTnDuraçãoEventos & # x000d7 10 6
pA emem min
CTR10,9 e # x000b1 0,80,53 e # x000b1 0,044,7 e # x000b1 0,65,4 e # x000b1 0,751722.0
NPA10 e # x000b1 0,90,2 e # x000b1 0,3 * 9,8 e # x000b1 0,8 * 2,5 & # x000b1 0,4 * 61171.0
%Mudar & # x0221262+109& # x0221254

Os receptores ligados a NPA tinham fechamentos longos e aberturas curtas mais frequentes.

O mecanismo de passagem dos receptores NMDA do tipo 2A foi bem caracterizado cineticamente. Nas condições empregadas neste estudo, a reação de gating de estado estacionário consiste em transições entre cinco estados fechados e dois abertos e mudanças ocasionais de modo de gating. Para determinar como o NPA aumentou o tempo médio de fechamento e diminuiu o MOT, examinamos a distribuição de eventos fechados e abertos presentes em nossos registros de canal único.

Com base em um critério de log verossimilhança, todos os registros de um canal que obtivemos com NPA (n = 6) foram bem descritos com cinco componentes fechados (E1 & # x02013 E5), conforme relatado anteriormente para os receptores 2A (Kussius et al., 2009). Este resultado indica que a ligação de NPA não produziu conformações fechadas adicionais. Em vez disso, alterou áreas específicas de componentes fechados: E3 e E5 aumentou & # x0223c2 vezes e E4 aumentou & # x0223c5 vezes, às custas de uma diminuição de 2 vezes no curto E1 área de componentes. Além disso, a duração de E3 aumentou 1,6 vezes (Fig. 3, A e B). Geralmente, os componentes curtos fechados E1& # x02013E3 englobam os breves eventos fechados dentro de bursts e ocorrem ao longo da via de ativação. Portanto, esses resultados sugerem fortemente que o NPA pode influenciar a ativação do receptor. Notavelmente, o NPA não alterou a constante de tempo do componente fechado mais longo (E5), que engloba os eventos dessensibilizados mais longos (Fig. 3, A e B), mas aumentou sua área, e o aumento da abundância de eventos dessensibilizados foi acompanhado por rajadas & # x0223c50% mais curtas (0,9 segundos versus 0,4 segundos). Observe, no entanto, que o aumento observado no E5 área não significa necessariamente que o NPA afetou o (s) estado (ões) dessensibilizado (s). A dessensibilização ocorrerá com mais frequência simplesmente se as ocupações de estados adjacentes aumentarem, como será discutido mais tarde (Fig. 4A).

NPA aumentou as áreas de componentes fechados específicos. (A) Intervalos fechados observados em dois registros obtidos de receptores N1 / N2A na ausência (CTR, 416.413 eventos) e presença de NPA (4 mM, 1.347.473 eventos). As funções de densidade de probabilidade (linhas cinzas) foram calculadas ajustando modelos de estado 5C4O cinéticos (ver Fig. 4) para os dados exibidos, as linhas escuras representam componentes exponenciais individuais e suas constantes de tempo [& # x003c4, milissegundos (ms)] e áreas (a,%) são fornecidos como inserções. (B) Resumo das constantes de tempo fechadas e áreas nas duas condições (CTR, n = 5 NPA, n = 6). Os valores médios de CTR são fornecidos abaixo de cada componente (em ms). *P & # x0003c 0,05 (Aluno & # x02019s t teste).

Em contraste com os efeitos específicos e robustos descritos acima para eventos fechados, a ligação de NPA não teve efeitos significativos nas durações de qualquer um dos quatro componentes abertos. Isso causou um aumento de 3 vezes na frequência do componente aberto mais curto, levando a uma diminuição geral no MOT (Fig. 3, C e D).Durante a ativação, os receptores NMDA visitam dois tipos de estados abertos: primeiro um estado curto & # x0223c0.2 milissegundo e, em seguida, um estado mais longo cuja duração define o modo de abertura: 2 milissegundos para baixo, 6 milissegundos para médio e 11 milissegundos para modos altos, respectivamente (Popescu e Auerbach, 2003). Uma vez que nem as durações nem as áreas relativas dos estados abertos baixo, médio ou alto mudaram com NPA (Fig. 3D), concluímos que a ligação de NPA não afetou as transições modais do receptor & # x02019s. Em vez disso, as durações médias de abertura mais curtas gerais refletem uma propensão para permanecer mais frequentemente no mais curto dos dois estados abertos, independentemente do modo.

Juntamente com a observação de que o NPA não alterou a condutância do canal, esses resultados excluem a possibilidade de que o NPA reduz as correntes do receptor NMDA bloqueando o poro ou alongando os eventos dessensibilizados e sugerem fortemente o NPA como um modulador alostérico, que afeta principalmente a ativação do receptor NMDA.

Modelos cinéticos de ações de NPA em receptores 2A.

Para interpretar as mudanças cinéticas descritas acima, usamos um esquema cinético 5C2O estabelecido para ajustar a sequência de eventos detectados em cada registro de canal único e calcular a média das constantes de taxa otimizadas dentro de cada conjunto de dados. Embora este modelo seja uma simplificação dos rearranjos complexos que ocorrem durante o gating do receptor NMDA, foi demonstrado anteriormente que ele reproduz com precisão as principais características de seus comportamentos microscópicos e macroscópicos (Popescu et al., 2004 Zhang et al., 2008 Kussius et al. , 2009). Os resultados do ajuste mostraram que o NPA mudou significativamente apenas três das 12 constantes de taxa incluídas no modelo: kC1-C2, kO1-C1, e kC1-O1. Dessas três constantes de taxa, kC1-C2 e kO1-C1 aumentou 1,4 e 2 vezes, respectivamente, enquanto kC1-O1 diminuiu 2 vezes (Fig. 4A). Assim, esse mecanismo explica a diminuição da corrente conforme o aumento das ocupações dos estados C3 e C2, que residem ao longo da via de ativação (Fig. 4B). Em seguida, usamos os mecanismos de reação deduzidos para as condições de CTR e NPA para comparar as flutuações de energia livre relativas experimentadas pelos receptores NMDA na ausência e presença de NPA. Alinhamos os dois perfis arbitrariamente no nível de energia livre do estado aberto longo O2, com base na observação de que as aberturas tiveram durações semelhantes nas duas condições. De acordo com esta representação, quando o NPA está presente, embora em concentrações subsaturantes, a barreira de energia livre para a ativação do receptor é maior, devido a estados pré-abertos mais estáveis ​​(Fig. 4C). Em outras palavras, quando o NPA está presente, os receptores requerem mais energia para se abrir e, como permanecem mais tempo nos estados de pré-abertura, também têm mais chances de dessensibilizar.

A descrição acima apresenta uma imagem média do comportamento do receptor na presença de concentrações subsaturantes de NPA e reflete uma mistura dinâmica de receptores livres de NPA e ligados a NPA. Para descrever mais precisamente o gating de receptores ligados a NPA, expandimos o modelo 5C2O para conter duas camadas, uma para estados livres de NPA (topo) e ligados a NPA (parte inferior). Como uma primeira aproximação, conectamos as camadas por meio de apenas uma etapa de associação / dissociação NPA, que posicionamos por sua vez entre cada um dos estados semelhantes ao longo da via de ativação. Essencialmente, a modelagem foi conduzida conforme descrito anteriormente (Amico-Ruvio et al., 2012). Ao longo do braço livre de NPA, fixamos todas as constantes de taxa para os valores obtidos para o conjunto de dados CTR, enquanto ao longo do braço vinculado a NPA, fixamos apenas as constantes de taxa que eram não mudou significativamente nos dados NPA, para os mesmos valores que o braço CTR (Fig. 4A). Ajustamos separadamente cada um dos modelos de cinco camadas, que diferiam na localização da etapa de conexão (C3, C2, C1, O1, e O2), para registros individuais de canal único no conjunto de dados NPA. Observamos que as constantes de taxa de dissociação de NPA estimadas com esses modelos caíram em duas categorias: eram lentas quando as camadas eram conectadas por meio de C3 para C2, e eles eram & # x0223c5 vezes mais rápidos quando as camadas eram conectadas C1 através de O2. Os modelos com conexão única em diferentes estados foram classificados usando um critério LL (O1& # x0003eO2& # x0003eC1& # x0003eC2& # x0003eC3) O O1 o modelo conectado retornou o LL mais alto (Fig. 5A), que é 41 unidades maior do que o modelo do segundo classificado, onde a conexão estava em O2. Estes resultados sugeriram que a ligação de NPA pode ser dependente do estado, com a ligação e a dissociação ocorrendo preferencialmente a partir de estados abertos. Como esse modelo não permite a ligação do NPA a estados fechados, ele prevê que o receptor deve ser insensível ao NPA, se a droga for aplicada imediatamente antes, mas não durante a estimulação com glutamato.

Cinética de ligação a NPA. (A) O modelo em camadas foi usado para representar os receptores livres de NPA (superior) e ligados a NPA (inferior). As transições entre os braços eram permitidas apenas entre o O1 estados. Este modelo foi ajustado aos dados obtidos em 4 mM NPA (n = 6), e produziu a maior probabilidade de log. As constantes de taxa (cor escura) foram fixadas aos valores de CTR obtidos como mostrado na Fig. 4, enquanto as constantes de taxa em vermelho foram permitidas para variar. A constante de taxa de associação (ksobre) e constante de dissociação de equilíbrio (KD) são indicados. As etapas de ligação do glutamato usadas para simulação são mostradas (cinza). (B) As respostas macroscópicas a um pulso longo (5 segundos) de 1 mM Glu (linha preta) foram simuladas e foram comparadas com as correntes de células inteiras na ausência (preto) ou presença (vermelho) de 4 mM de pré-aplicação de NPA ( 5 segundos).

Para testar essa previsão, medimos as respostas do glutamato de células que foram perfundidas com solução contendo NPA (4 mM) antes da aplicação do glutamato, mas não durante a exposição ao glutamato. Os resultados mostraram que o NPA reduziu as correntes de células inteiras do receptor NMDA, mesmo quando aplicado exclusivamente antes do glutamato (Fig. 5B, célula inteira), sugerindo fortemente que: 1) o NPA pode se ligar a receptores NMDA livres de glutamato em repouso e 2) que o NPA permanece ligado e pode impedir a ativação do receptor induzida pelo glutamato, mesmo após o excesso de NPA ter sido eliminado. Da mesma forma, nossos resultados apresentados na Fig. 1 mostram que o NPA também pode se ligar a receptores ativamente ativados, uma vez que a aplicação de NPA inibe as correntes em estado estacionário produzidas por concentrações saturantes de glutamato.

Para reunir todas essas informações em um modelo abrangente, postulamos um mecanismo onde o NPA pode se ligar e dissociar dos receptores em qualquer ponto durante o gating, mas a cinética de ligação e dissociação será diferente para cada estado. Com base nos resultados apresentados acima, pretendemos limitar o número de parâmetros livres calculados durante os ajustes estatísticos, propondo ainda que: 1) as conformações do receptor podem ser atribuídas a apenas duas classes de afinidade de NPA: baixa ou alta 2) ocorre a mudança na afinidade de NPA simultaneamente com o C2& # x02013C1 transição e 3) é principalmente devido a uma mudança & # x0223c5 vezes na taxa de dissociação. Com essas suposições e depois de fixar taxas invariantes de NPA para valores de CTR conforme descrito para o modelo anterior, ajustamos este modelo estendido individualmente para registros de canal único obtidos com NPA. As constantes de taxa resultantes são fornecidas na Fig. 6A.

Mecanismo cinético de inibição de N1 / N2A por NPA. (A) Modelo em camadas com transições permitidas em todos os estados, exceto C4 e C5. As constantes de taxa mostradas em azul podem variar. As taxas de entrada para todos os estados fechados foram fixadas para os valores mostrados, enquanto as taxas de desconto de C1, O1, e O2 (azul) foram dimensionados como 5 vezes em relação aos de C2 e C3 (verde). Este modelo foi ajustado aos dados obtidos em 4 mM NPA (n = 6) e também usado para simulações. As etapas de ligação do glutamato usadas para simulação são mostradas (cinza). (B) As respostas macroscópicas a um pulso longo (5 segundos) de 1 mM Glu (linha preta) foram simuladas e concordaram bem com as correntes de células inteiras, como mostrado na Fig. 5B. (C) A curva de inibição de dose simulada (vermelho) foi comparada com os dados de células inteiras (IC50 é expresso como intervalo de confiança de 95%). A inclinação da colina foi de 1,0 para simulações e 1,2 para traços experimentais.

Validação experimental para o mecanismo proposto de ação NPA.

Em seguida, perguntamos se o modelo na Fig. 6A pode prever corretamente a inibição observada das correntes eliciadas pelo glutamato quando aplicado a receptores ativos (Fig. 1) ou quando aplicado a receptores em repouso (Fig. 5B). O modelo replicou fielmente a inibição das correntes de estado estacionário ilustradas na Fig. 1 e previu uma curva de dose-resposta que era indistinguível daquela calculada a partir de correntes de células inteiras registradas experimentalmente (1,5 mM versus 1,9 & # x000b1 0,8 mM) (Fig. . 6C). Além disso, as correntes simuladas do receptor NMDA pré-exposto ao NPA também reproduziram com sucesso os comportamentos macroscópicos observados experimentalmente (Fig. 5B). Com base nesses resultados, propomos que um modelo em camadas que inclui duas afinidades NPA (Fig. 6A), embora derivado com base em várias suposições simplificadoras, captura os detalhes necessários para explicar comportamentos de canal único e macroscópicos experimentalmente observados. Por último, usamos este modelo para prever como o NPA pode afetar as respostas dos receptores sinápticos e extra-sinápticos.

Efeitos preditos do NPA nos receptores sinápticos e extra-sinápticos.

Avaliamos o efeito do NPA nas respostas sinápticas do receptor NMDA comparando os traços simulados com o CTR e o modelo de NPA em camadas na Fig. 6B após breves (1 milissegundo) pulsos de glutamato (1 mM). Os traços resultantes mostraram que o NPA (4 mM) inibiria as respostas do tipo sináptico de receptores contendo N2A, diminuindo a amplitude da corrente de pico em 2 vezes e também diminuindo o tempo de desativação & # x0223c2 vezes (400 milissegundos versus 200 milissegundos) . Juntas, essas mudanças produziriam uma redução de & # x0223c80% na transferência de carga total em resposta a um único evento sináptico (Fig. 7A).

Efeitos NPA previstos nas respostas macroscópicas N1 / N2A sinápticas e extra-sinápticas. (A) Simulações de respostas macroscópicas a um pulso breve (1 milissegundo) de 1 mM Glu (seta preta) (esquerda), os traços simulados são normalizados para o pico e são sobrepostos para comparação do curso do tempo de desativação (direita). A seta vermelha indica o pico da resposta do receptor NMDA na presença de NPA 4 mM. (B) As respostas macroscópicas a um pulso longo (5 segundos) de 1 mM Glu (linha preta) foram simuladas com os modelos na Fig. 4B e foram registradas como correntes de células inteiras na ausência (preto) ou na presença (vermelho ) de 4 mM ambiente NPA (direita) inserções mostram os mesmos traços normalizados para o pico para comparação do curso do tempo de dessensibilização (esquerda) e normalizados para o nível de estado estacionário para comparação do curso do tempo de desativação (direita).

Nós imitamos os efeitos do NPA em receptores extra-sinápticos com o modelo em camadas na Fig. 6B, iniciando todos os receptores em estados livres de glutamato (C0) e definir a concentração de NPA para 4 mM. A ativação foi iniciada mudando a concentração de glutamato de zero para 0,1 mM, após o que os receptores foram autorizados a se equilibrar por 5 segundos em todos os 18 estados. Os resultados mostraram que 4 mM NPA atenuaria tanto o pico quanto as correntes de estado estacionário e que o efeito seria ligeiramente maior na corrente de estado estacionário (Fig. 7B, simulação), mas o curso de tempo para dessensibilização macroscópica seria amplamente inalterado ( CTR versus NPA: 2,5 segundos versus 2,0 segundos) (Fig. 7B, simulação, inserção). Além disso, os resultados previram uma desativação & # x0223c2 vezes mais rápida na presença de NPA 4 mM (CTR versus NPA: 430 milissegundos versus 190 milissegundos) (Fig. 7B, simulação, inserção). Esses resultados corresponderam estreitamente às correntes de células inteiras registradas com um protocolo semelhante: para dessensibilização, as constantes de tempo para receptores na presença e presença de NPA 4 mM são 1,1 & # x000b1 0,1 segundo e 1,2 & # x000b1 0,1 segundo (P = 0,54), respectivamente para desativação, as constantes de tempo são 720 & # x000b1 50 milissegundos e 350 & # x000b1 20 milissegundos, respectivamente (P & # x0003c 0,01) (Fig. 7B). Com base em todos os resultados apresentados, sugerimos que o NPA inibiria substancialmente os receptores N2A sinápticos e extra-sinápticos, com um efeito maior nas respostas a breves estímulos semelhantes aos sinápticos.


Análise de dados

As correntes registradas foram analisadas conforme descrito anteriormente em detalhes (Kussius et al. 2009). As gravações microscópicas que continham mais de um canal ativo, conforme indicado por aberturas simultâneas, foram descartadas e os arquivos de um canal selecionados foram processados, idealizados e ajustados a modelos cinéticos no QUB. Picos ocasionais de ruído foram apagados definindo a região correspondente para um nível de corrente aberto ou fechado. O desvio da linha de base foi corrigido redefinindo a linha de base para o nível de corrente zero. Os dados pré-processados ​​foram então idealizados com o k- algoritmo médio, com resolução de 150 μs, e modelado com um algoritmo de probabilidade logarítmica de intervalo máximo. O número de estados fechados e abertos no modelo final foi determinado incrementalmente adicionando estados fechados e abertos a um modelo 1C1O inicial (onde C é fechado e O é aberto) e definindo o aumento na probabilidade de log para um limite arbitrário de 10 unidades / adicionado estado (duas constantes de taxa adicionais). Os valores calculados para os parâmetros cinéticos em cada registro foram calculados em média para cada conjunto de dados e são relatados como médias ± SE.

Traços macroscópicos (3-10 traços / célula) foram calculados e avaliados medindo a corrente de pico (eupk) e equilíbrio [corrente de estado estacionário (euWL)] amplitudes e ajustando uma função monoexponencial à fase de decaimento da corrente (software Clampfit 10.2, Molecular Devices). Essas análises forneceram métricas para dessensibilização macroscópica como uma constante de tempo (τD) e como o euWL-para-eupk proporção (IWL/EUpk) Os valores são apresentados como médias ± SE e foram obtidos para 6–15 células / condição.

Respostas macroscópicas simuladas foram geradas no QUB conforme descrito anteriormente (Kussius et al. 2009). Os modelos derivados de gravações de canal único estacionárias foram expandidos para incluir duas etapas sequenciais de ligação ao glutamato que conduzem ao C3 estado de cada modelo de associação de glutamato e constantes de taxa de dissociação foram considerados iguais aos relatados para receptores N1 / 2A recombinantes (Popescu et al. 2004) e N1 / 2B (Amico-Ruvio e Popescu 2010). Aplicações longas (5 s) de glutamato foram modeladas como concentrações instantâneas que variam entre 0 e 1 mM de glutamato.

A significância das diferenças observadas entre as médias foi avaliada com um Student bicaudal t-teste a significância das diferenças observadas na variância foi avaliada com um bicaudal F-teste. As diferenças foram consideradas significativas para P valores de & lt0,05.


Receptores NMDA contendo subunidades GluN2A e GluN2B na plasticidade hipocampal

NA plasticidade sináptica dependente do receptor de -metil-d -aspartato (NMDAR) é uma forte candidata para mediar os processos de aprendizagem e memória que requerem o hipocampo. Essa plasticidade é bidirecional, e como o mesmo receptor pode mediar mudanças opostas nos pesos sinápticos permanece um enigma. Foi sugerido que a composição da subunidade NMDAR poderia estar envolvida. Especificamente, uma composição de subunidade de NMDARs seria responsável pela indução de potenciação de longo prazo (LTP), enquanto NMDARs com uma composição de subunidade diferente estariam envolvidos na indução de depressão de longo prazo (LTD). Infelizmente, os resultados dos estudos que investigaram essa hipótese são contraditórios, principalmente em relação ao LTD. No entanto, a evidência atual sugere que a subunidade GluN2B pode ser particularmente importante para a plasticidade e pode tornar uma sinapse bidirecionalmente maleável. Em particular, concluímos que a presença de NMDARs contendo subunidades GluN2B na densidade pós-sináptica pode ser uma condição necessária, embora não suficiente, para o fortalecimento das sinapses individuais. Isso se deve à interação de GluN2B com a proteína quinase dependente de cálcio / calmodulina II (CaMKII) e é diferente de sua contribuição como canal iônico.

1. Introdução

Decifrar como as redes neuronais podem armazenar informações de maneira robusta, mesmo depois de um único episódio de aprendizado, provou ser um dos maiores desafios da neurociência. O modelo celular com melhor suporte para aprendizagem e memória propõe que a atividade neuronal pertinente leva a mudanças duradouras nos pesos sinápticos distribuídos por toda a rede [1]. Tal "plasticidade sináptica" foi extensivamente estudada nas sinapses excitatórias do hipocampo, onde a maioria das formas de plasticidade requer a ativação de um tipo particular de receptor de glutamato conhecido como Nreceptor -metil-d-aspartato (NMDAR) para sua indução [2]. Os NMDARs são particularmente atraentes como mediadores moleculares de plasticidade devido à sua permeabilidade ao Ca 2+ e também às suas propriedades de detecção de coincidência que resultam de um bloco de Mg 2+ dependente da voltagem [3]. A plasticidade abrange aumentos (potenciação de longo prazo, LTP) e diminuições (depressão de longo prazo, LTD) na força sináptica e é expressa por alterações nos receptores de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiônico (AMPARs ) no elemento pós-sináptico e / ou mudanças na liberação do transmissor pré-sináptico. Em última análise, tais mudanças parecem ser consolidadas por alterações estruturais. No entanto, como a atividade neuronal relevante desencadeia plasticidade significativa na Vivo permanece incerto. Além disso, se a plasticidade oferece suporte ao aprendizado e à memória, ainda não está claro se um episódio de aprendizado desencadeia tanto a potenciação quanto a depressão em paralelo em diferentes conjuntos de sinapses ou, alternativamente, principalmente uma ou outra.

Esta revisão aborda o campo controverso em torno da hipótese de que NMDARs com composições de subunidades distintas são responsáveis ​​pela indução das duas formas opostas de plasticidade, e que alterar esse equilíbrio de subunidades é um mecanismo importante para ajustar a força sináptica. Em primeiro lugar, ele descreve como diferentes composições de subunidades afetam as propriedades funcionais e dinâmicas do NMDAR e as implicações para seu papel na transmissão do sinal. Em segundo lugar, avalia se essas subunidades NMDAR contribuem para formas distintas de plasticidade. Finalmente, como se pensa que a plasticidade mediada por NMDAR está envolvida na aprendizagem e na memória [4,5], ela resume a evidência de que diferentes tipos de aprendizagem e memória podem ser suportados por NMDARs com composições de subunidades distintas. Vários mecanismos podem contribuir para a plasticidade em diferentes regiões do cérebro, e alguns deles são independentes do NMDAR, como LTP na sinapse da fibra musgosa em CA3 [6] e LTD dependente do receptor metabotrópico de glutamato em CA1 [7]. Além disso, mudanças plásticas na sinapse podem ter componentes de curto e longo prazo [8], e estes podem ser suportados por processos distintos e ter dependência de subunidade NMDAR diferente para sua indução [9].Esta revisão enfoca as formas dependentes de NMDAR de plasticidade de longo prazo no hipocampo, em particular na sinapse CA3-CA1, para facilitar a comparação entre experimentos e porque esta sinapse em particular foi implicada na aprendizagem associativa dependente do hipocampo.

2. A hipótese

Uma série de teorias foram propostas para explicar como diferentes padrões de atividade neuronal podem levar a efeitos opostos na força sináptica quando ambas as formas de plasticidade dependem do mesmo tipo de receptor. Um aspecto unificador das teorias de expressão pós-sináptica é que o influxo de Ca 2+ mediado por NMDAR no elemento pós-sináptico, a "coluna", deve, em última análise, ser acoplado às diferentes cascatas de sinalização intracelular que medeiam mudanças nos pesos sinápticos.

Foi rapidamente identificado que a magnitude do influxo de Ca 2+ através de NMDARs nos paradigmas tradicionais de alta frequência usados ​​para induzir LTP era muito maior do que durante os paradigmas LTD de baixa frequência. Portanto, foi proposto que diferentes níveis de influxo de Ca 2+ poderiam se acoplar a distintas vias de sinalização intracelular para causar as alterações moleculares e, em última instância, estruturais na sinapse que fundamenta as duas direções de plasticidade [10]. Isso também foi estendido para a indução de plasticidade por spike timing preciso [11]. No entanto, parecia que um mecanismo baseado nos níveis de Ca 2+ por si só pode não ser suficientemente robusto, e também não poderia ser responsável por algumas observações experimentais, portanto, o curso do Ca 2+ foi sugerido como importante [12,13]. A dinâmica pós-sináptica do Ca 2+ é rigidamente regulada por canais de K + ativados por Ca 2+ de pequena condutância [14,15], canais de Ca 2+ dependentes de voltagem [16,17] e liberação de Ca 2+ intracelular [18] e o Ca 2 + microdomínios gerados por eles poderiam fornecer um nível mais refinado de controle na regulação da plasticidade bidirecional.

Em paralelo aos refinamentos na teoria que liga a dinâmica do Ca 2+ e a plasticidade bidirecional, surgiu a sugestão de que o próprio NMDAR poderia dissociar intrinsecamente o fortalecimento e o enfraquecimento sinápticos em resposta aos padrões de atividade. As propriedades cinéticas distintas conferidas pelas subunidades NMDAR podem permitir que a composição NMDAR exerça um nível mais preciso de controle sobre a dinâmica pós-sináptica do Ca 2+. Eles também fazem associações moleculares distintas e, portanto, podem acoplar-se independentemente às vias da quinase e da fosfatase a jusante que foram estabelecidas para regular cada direção da plasticidade (para revisão, consulte [19]). Além disso, a abundância relativa dessas subunidades em locais sinápticos é rigidamente regulada ao longo do desenvolvimento, e uma transição na dominância da subunidade se correlaciona com mudanças na facilidade de indução de plasticidade [20]. Todas essas evidências convergiram na sugestão atraente de que o tipo de plasticidade induzida poderia ser determinado pelo tipo de subunidade NMDAR ativada, talvez permitindo a transmissão de sinais distintos e acoplando-os firmemente a diferentes moléculas de sinalização a jusante. No entanto, os resultados dos estudos que se propuseram a investigar esta hipótese foram inconclusivos.

3. Receptores NMDA

NMDARs são encontrados tanto pré quanto pós-sinápticamente (figura 1uma), e as evidências de áreas neocorticais estabeleceram um precedente de que essas populações distintas de NMDARs podem apoiar diferentes mecanismos de plasticidade [21-23]. Isso também pode se aplicar no hipocampo, porque a plasticidade pode ser mediada por mudanças na probabilidade de liberação pré-sináptica sob algumas condições experimentais [24-26] para uma discussão mais aprofundada de LTP pré-sináptico do hipocampo, os leitores são direcionados a uma revisão recente de Bliss & amp Collingridge [27 ] Nossa revisão se concentra em NMDARs pós-sinápticos, que podem ser encontrados sináptica, perissináptica e extra-sináptica. Essas três populações de receptores são recrutadas diferencialmente por padrões de atividade neuronal, sugerindo que eles podem desempenhar papéis funcionais distintos; no entanto, permanece controverso a respeito de como a composição das subunidades e a localização sináptica se relacionam.

Figura 1. Localização do receptor NMDA e subunidades na plasticidade sináptica. (uma) NMDARs são encontrados pré e pós-sinápticos, e essas duas populações NMDAR podem desempenhar papéis diferentes na plasticidade sináptica. Na membrana pós-sináptica, NMDARs são encontrados sináptica, perissináptica e extra-sináptica, onde também podem desempenhar funções diferentes. (b) Durante a indução de LTP dependente do tempo de pico, o influxo de Ca 2+ através de NMDARs contendo subunidade GluN2B (seta laranja) ativa diretamente CaMKII para desencadear LTP. A ativação tetânica elicia um influxo maior de Ca 2+ através de NMDARs contendo subunidade GluN2A (setas cinza), que atinge e ativa CaMKII ancorado na densidade pós-sináptica (PSD) pelo terminal C da subunidade GluN2B. Em ambos os casos, é a ativação de CaMKII que desencadeia cascatas de sinalização a jusante que medeiam a expressão de LTP, sugerindo que a presença da subunidade GluN2B no PSD é importante para a indução de LTP, independentemente de ela suportar a maioria do influxo de Ca 2+.

NMDARs consistem em duas subunidades GluN1 obrigatórias e duas subunidades GluN2 ou GluN3 adicionais que conferem as propriedades particulares do receptor. Cada subunidade consiste em quatro domínios principais: o domínio N-terminal contendo locais de ligação para moduladores alostéricos, como Zn 2+ e ifenprodil, o domínio de ligação do agonista, onde os locais de ligação para glicina / d-serina (em GluN1) e glutamato ( em GluN2) estão localizados e onde antagonistas competitivos atuam no domínio de poro, acessível a bloqueadores de poro, como feniciclidina (PCP) e MK801, e, por último, o domínio C-terminal (CTD), que se liga a diferentes mediadores intracelulares. As duas subunidades GluN2 predominantes no hipocampo são GluN2A e GluN2B, embora GluN2C e GluN2D também estejam presentes, em particular no início do desenvolvimento, mas também em pequenas quantidades na idade adulta [28]. NMDARs de hipocampo podem ser dieteroméricos (GluN1 / GluN2A e GluN1 / GluN2B) ou tri-heteroméricos (GluN1 / GluN2A / GluN2B). A expressão de GluN2B é alta no nascimento, mas diminui na idade adulta, enquanto a expressão de GluN2A aumenta com a idade [20,28-30]. A população tri-heteromérica é cada vez mais reconhecida por formar uma grande proporção dos NMDARs sinápticos no cérebro adulto [9,31-33], mas, como esses receptores não podem ser seletivamente interrogados farmacologicamente, as características dos receptores tri-heteroméricos só podem ser inferidas. Assim, seu papel preciso permanece enigmático, embora provavelmente importante.

(a) Propriedades funcionais e dinâmicas

Medições de correntes de canal ou respostas pós-sinápticas a estímulos únicos revelaram diferenças notáveis ​​na cinética de NMDARs contendo subunidades GluN2A e GluN2B, e esta é uma maneira pela qual esses subtipos de canal podem influenciar a indução de plasticidade. Registros de canal único em células de rim embrionário humano (HEK) mostraram que os receptores GluN1 / GluN2A têm uma maior probabilidade de abertura em resposta ao glutamato e também uma maior probabilidade de pico de abertura do que os receptores GluN1 / GluN2B [34]. Essas descobertas foram apoiadas por medições de células inteiras em células HEK [35] e também fatias agudas do hipocampo [31], onde a probabilidade de abertura do canal foi estimada pelo bloqueio dependente do uso de NMDARs com MK801. As taxas de ativação e desativação mais rápidas de NMDARs individuais compreendendo GluN1 / GluN2A resultam em correntes de células inteiras que aumentam e decaem mais rapidamente do que aquelas suportadas por GluN1 / GluN2B, e uma população tri-heteromérica aparentemente tem uma constante de tempo de decadência intermediária [36].

A resposta de NMDARs a estímulos múltiplos em uma faixa de frequências em durações diferentes é particularmente importante no contexto da plasticidade sináptica. Medições de gravações de canal único foram usadas para simular as respostas de NMDARs contendo subunidades GluN2A e GluN2B para trens de atividade pré-sináptica e isso mostrou uma relação entre a frequência de estimulação e a transferência de carga total que diferia entre as duas subunidades [34]. Foi descoberto que nas frequências muito baixas (0,1–0,3 Hz) usadas em alguns protocolos de plasticidade, os canais GluN1 / GluN2B suportaram duas vezes mais transferência de carga devido à sua taxa de desativação mais lenta. Na estimulação de 1 Hz favorecida para indução de LTD, a transferência de carga através dos canais GluN1 / GluN2B ainda excedeu aquela através dos canais GluN1 / GluN2A, mas em menor extensão, e era equivalente entre os canais a 2 Hz. A modelagem também revelou que a duração da atividade é importante em altas frequências de estimulação para a frequência de 100 Hz frequentemente usada em protocolos de indução de alta frequência, a duração do trem de estímulo mudou drasticamente a transferência de carga através de NMDARs contendo subunidades GluN2A e GluN2B. Os dois subtipos de canal permitiram transferência de carga equivalente para 100 ms de estimulação, no entanto, para um trem de estímulo de 1000 ms, a duração típica usada para induzir LTP, GluN1 / GluN2A suportou duas vezes a transferência de carga de GluN1 / GluN2B [34]. A dessensibilização de NMDARs contendo subunidades GluN2A e GluN2B também contribuirá para sua capacidade de mediar a transferência de carga, mas o efeito será altamente influenciado pela composição da subunidade na modelagem da coluna pós-sináptica sugeriu que uma fração maior de NMDARs contendo subunidades GluN2A será dessensibilizado em frequências de estimulação de 5 a 100 Hz, mas que a diferença entre GluN2A e GluN2B será a mais baixa em 100 Hz por 1000 ms [37]. Embora esses estudos de modelagem forneçam informações úteis para prever como a composição de subunidades e os protocolos de plasticidade podem interagir, uma investigação experimental adicional é essencial para testar suas previsões em condições fisiológicas.

É geralmente assumido que a magnitude do influxo de Ca 2+ está relacionada à transferência de carga, o que sugere que as diferenças na transferência de carga entre os subtipos de canal seriam importantes em sua capacidade de desencadear formas distintas de plasticidade que requerem diferentes dinâmicas pós-sinápticas de Ca 2+. No entanto, a relação pode ser mais complexa, porque a imagem de Ca 2+ das espinhas revelou que a magnitude do influxo de Ca 2+ em resposta à aplicação de glutamato não se correlaciona necessariamente com a transferência de carga mediada por NMDAR [38]. Além disso, um antagonista seletivo da subunidade GluN2B causou uma maior redução no influxo de Ca 2+ naqueles espinhos que suportaram uma mudança mais elevada em Ca 2+ por corrente pós-sináptica excitatória evocada por desencadeamento (EPSC), o que levou os autores a concluir que a subunidade contendo GluN2B NMDARs suportam um influxo maior de Ca 2+ por unidade de corrente [38]. Isso não tinha sido observado anteriormente em NMDARs contendo subunidades GluN2A ou GluN2B recombinantes em sistemas heterólogos [28], o que pode ser devido a diferenças metodológicas, a presença de NMDARs tri-heteroméricos e / ou modificações pós-traducionais de NMDARs em fatias cerebrais agudas, e assim mais é necessária investigação. No entanto, se este influxo mais alto de Ca 2+ através dos NMDARs contendo a subunidade GluN2B se mantiver, então ele sugere que esta subunidade poderia exercer uma influência desproporcional na plasticidade.

(b) Associações intracelulares de receptores NMDA

Outras maneiras pelas quais as subunidades NMDAR podem influenciar a direção da plasticidade estão relacionadas aos seus longos CTDs, uma vez que permitem muitas interações intracelulares e modificações por fosforilação. Muitas dessas associações moleculares diretas e indiretas são únicas, pois o CTD mostra um alto nível de divergência de sequência entre GluN2A e GluN2B. Isso permite a regulação separada de sua presença ou ausência na sinapse e também pode acoplar cada subunidade a diferentes cascatas de sinalização a jusante que suportam LTP ou LTD. Alguns exemplos-chave dessas interações com relevância para a plasticidade são descritos abaixo.

A presença de NMDARs contendo subunidades GluN2A e GluN2B na sinapse é estabilizada por sua interação com a subfamília de densidade pós-sináptica (PSD) de guanilato quinases associadas à membrana, que inclui PSD-95, PSD-93, SAP102 e SAP97 [39]. Modificações pós-traducionais podem alterar o quão fortemente as subunidades GluN2A e GluN2B se ligam a essas proteínas PSD, e este é um mecanismo que regula a disponibilidade dessas subunidades na sinapse: por sua vez, isso poderia influenciar a indução de plasticidade. Por exemplo, Cdk2 fosforila GluN2B em Ser1480, o que interrompe sua interação com PSD-95 e SAP102 e leva a uma redução no GluN2B sináptico [40,41]. Este evento de fosforilação não é apenas exclusivo do GluN2B [41], mas também é regulado pela atividade sináptica [40]. Os níveis de superfície de GluN2B também podem ser regulados por fosforilação em Tyr1472 por Fyn e Src. A fosforilação evita que a proteína adaptadora de clatrina AP-2 se ligue ao motivo de internalização de GluN2B YEKL e, assim, inibe a endocitose. É provável que o Cdk5 seja um componente adicional nesta cascata regulatória, pois inibi-lo estimula a interação entre Src e PSD-95 e, consequentemente, aumenta a fosforilação de Tyr1472 [42]. Outro exemplo é a endocitose de GluN2A, que é controlada por um motivo de dileucina em um local diferente (Leu1319 e Leu1320) [43] e, portanto, sua expressão de superfície pode ser regulada de forma independente. É notável que as subunidades GluN2B também sofrem endocitose mais frequente do que GluN2A, e que essas duas subunidades entram em diferentes vias intracelulares, com GluN2B entrando em endossomos de reciclagem e GluN2A em endossomos tardios [43]. Isso sugere que a regulação dependente da atividade ou neuromodulatória de GluN2B pode ser uma maneira mais rápida ou mais sensível de alterar o estado de uma sinapse.

Além de vias regulatórias separadas para controlar os níveis sinápticos de GluN2A e GluN2B, associações únicas com diferentes enzimas também podem permitir que as subunidades contribuam para formas opostas de plasticidade. O exemplo mais importante é provavelmente a ligação de alta afinidade entre o CTD GluN2B e o domínio catalítico da proteína quinase dependente de Ca 2+ / calmodulina II (CaMKII) [44]. Há um nível basal de CaMKII presente no PSD ligado aos NMDARs [45], mas este é suplementado por CaMKII fosforilado ativo que se transloca para o PSD após a indução de LTP [46,47]. A interação entre CaMKII e GluN2B ancora CaMKII na sinapse em sua conformação ativa [48]. LTP requer CaMKII ativo (revisado em [49]), mais especificamente, a associação entre GluN2B e CaMKII ativo [50,51]. Portanto, a capacidade do GluN2B de mediar o acoplamento estreito entre o influxo de Ca 2+ e CaMKII, e manter CaMKII extra ativo na vizinhança de seus substratos, como AMPARs, para iniciar os eventos de fosforilação que suportam o fortalecimento sináptico, sugere que esta subunidade pode jogar um papel crucial na LTP. Outra interação de proteína notável na coluna pós-sináptica é aquela entre GluN2B e Ras-GRF1, um fator de troca de difosfato de guanosina / trifosfato de guanosina específico de Ras, sensível a Ca 2+ / calmodulina [52,53]. Existem também proteínas que se associam indiretamente com NMDARs, mas ainda mantêm uma preferência de subunidade, permitindo um nível extra de complexidade na modulação da função NMDAR por sua composição de subunidades.

4. Subunidades do receptor GluN2A e GluN2B NMDA em plasticidade

Conforme ilustrado até agora, existem três maneiras principais pelas quais a composição diferencial da subunidade pode afetar o tipo de plasticidade induzida. Em primeiro lugar, as diferentes propriedades de canal conferidas por essas duas subunidades poderiam encorajar uma dinâmica de Ca 2+ pós-sináptica suficientemente distinta para desencadear vias de plasticidade a jusante separadas. Em segundo lugar, as associações exclusivas feitas pelos CTDs das subunidades GluN2A e GluN2B fornecem um mecanismo direto pelo qual as subunidades poderiam se acoplar a cascatas de sinalização intracelular independentes e, assim, desempenhar papéis diferentes na plasticidade sináptica. Finalmente, mudanças na quantidade ou localização subcelular dessas subunidades podem alterar o estado basal de uma coluna vertebral e, assim, afetar a futura indução de plasticidade. Dadas essas possibilidades, é interessante perguntar até que ponto as evidências experimentais apóiam a hipótese de que diferentes composições de subunidades NMDAR determinam o resultado de um protocolo de plasticidade.

(a) Protocolos de plasticidade sináptica

Uma ampla variedade de protocolos de indução pode ser usada para induzir mudanças sinápticas no hipocampo e os principais paradigmas são ilustrados na tabela 1. Existem diferenças consideráveis ​​nos padrões de atividade usados ​​para induzir até mesmo uma direção de plasticidade, portanto, é possível que a sináptica mudanças induzidas por paradigmas tão diversos têm fundamentos mecanicistas distintos. É importante considerar isso ao delinear as subunidades NMDAR envolvidas na plasticidade, pois os resultados só são verdadeiramente comparáveis ​​quando o mesmo protocolo é aplicado.

Tabela 1. Diferentes protocolos usados ​​para induzir LTP e LTD.

Vários protocolos de plasticidade foram usados ​​em combinação com manipulações farmacológicas e genéticas para investigar o papel potencial de diferentes subunidades NMDAR em LTP e LTD. A primeira investigação sobre os papéis de subpopulações distintas de NMDAR na plasticidade bidirecional comparou as possíveis contribuições das subunidades GluN2A / B e GluN2C / D usando antagonistas de amplo espectro [54,55]. Os estudos subsequentes se concentraram em dissecar se existem diferenças entre GluN2A e GluN2B, uma vez que essas são as subunidades predominantes presentes na sinapse CA3-CA1 juvenil e adulta. Atualmente, existem ferramentas farmacológicas altamente seletivas para bloquear os receptores GluN1 / GluN2B, principalmente ifenprodil e seu derivado mais potente Ro 25-6981 [56]. No entanto, estes são bloqueadores dependentes de atividade, e a concentração de agonista afeta a extensão em que esses antagonistas inibem NMDARs contendo subunidades GluN2B, por exemplo, 3 µM de Ro 25-6981 atinge 93% de inibição na presença de 100 µM de NMDA, mas apenas 62% em NMDA 10 µM [57]. O estudo do GluN2A é ainda mais limitado pela falta de antagonistas seletivos para essa subunidade. NVP-AAM077 (doravante referido como NVP) é comumente usado como um antagonista que prefere GluN2A, mas agora é conhecido por ser menos seletivo em roedores do que foi assumido a partir de proteínas humanas recombinantes e na verdade mostra apenas uma preferência de 10 vezes por GluN2A sobre GluN2B [56,58]. Portanto, os dados coletados usando NVP invariavelmente têm algum bloqueio de GluN2B também, mas a magnitude desse bloqueio varia consideravelmente com a concentração usada.

As manipulações farmacológicas e genéticas permitem a investigação de diferentes aspectos da função NMDAR. As abordagens farmacológicas são informativas sobre o papel do NMDAR como um canal iônico e não abordam diretamente a importância das associações intracelulares. Eles também afetarão indiscriminadamente um subtipo NMDAR específico em todos os tipos de células, por exemplo interneurônios e neurônios piramidais, onde podem desempenhar papéis diferentes. Por sua vez, isso poderia ter repercussões para a rede que se manifestam em um circuito, bem como em um nível comportamental [59].Por outro lado, nocautes genéticos constitutivos e induzíveis fornecem informações sobre o papel combinado das propriedades do canal NMDAR e presença sináptica e podem ser direcionados a um tipo de célula específico, no entanto, dadas as mudanças na composição do subtipo ao longo do desenvolvimento, e mesmo no curto As escalas de tempo da metaplasticidade, perturbando o equilíbrio dos receptores, podem causar outras mudanças na rede ou recrutar processos compensatórios a longo prazo. Além disso, as manipulações farmacológicas foram frequentemente realizadas em ratos, enquanto quase todas as manipulações genéticas discutidas abaixo usaram camundongos, e as diferenças entre as espécies não foram excluídas.

(b) Potenciação de longo prazo

Um estudo inicial frequentemente citado para argumentar o envolvimento diferencial das subunidades NMDAR na indução de LTP e LTD descobriu que o bloqueio farmacológico de GluN2A por NVP preveniu LTP induzido por tétano e emparelhamento em ratos de três a quatro semanas, mas o antagonismo de GluN2B por ifenprodil / Ro 25-6981 não, mas em vez disso bloqueou a indução de LTD [60]. Outro estudo, usando as mesmas concentrações farmacológicas e idade dos ratos, também descobriu que a NVP bloqueou completamente a LTP induzida por tétano, embora neste estudo o ifenprodil e o Ro 25-6981 tenham bloqueado parcialmente esta forma de LTP [61]. No entanto, os dados em ambos os estudos foram coletados usando uma concentração de NVP relativamente alta, portanto, além da falta mencionada de especificidade de NVP, o bloqueio de corrente mediado por NMDAR resultante foi muito maior com NVP (redução de corrente: 53 ± 3,0% em [60] e 81 ± 3% em [61]) em comparação com as pequenas reduções causadas por Ro 25-6981 (36 ± 5% em [60] e 32 ± 3% em [61]). Portanto, esse papel aparentemente seletivo da subunidade GluN2A pode, em vez disso, surgir de um efeito de limiar, pelo qual inibir mais corrente mediada por NMDAR total poderia bloquear LTP, especialmente dado que um alto nível de influxo de Ca 2+ é tradicionalmente considerado necessário para a indução de LTP . De fato, quando um estudo em camundongos controlou para isso selecionando concentrações de antagonista para reduzir a corrente mediada por NMDAR igualmente (redução de 40% para corresponder ao possível por Ro 25-6981), LTP induzido por emparelhamento não foi prejudicado, independentemente do antagonista usado (NVP , Ro 25-6981 ou o antagonista de NMDAR de amplo espectro 2-amino-5-fosfonopentanoato (AP5)) [62]. As mesmas concentrações de antagonista, conforme tituladas para sua redução de corrente NMDAR no estudo acima mencionado, também não prejudicaram a LTP induzida por um paradigma de explosão teta em camundongos adultos [63], embora esta baixa concentração de NVP bloqueou parcialmente a LTP induzida por tétano, enquanto ifenprodil não [64]. Isso sugere que a LTP induzida por tétano é a mais sensível ao bloqueio de GluN2A. Além da extensão da redução atual, o estágio de desenvolvimento também é responsável por alguns dos diferentes resultados relatados. Em um estudo usando ratos de duas semanas de idade, LTP foi prejudicado por ambos GluN2A e GluN2B antagonismo [65], provavelmente porque a transição de desenvolvimento na composição de subunidades ainda não está completa nesta idade em ratos, pois o antagonismo de GluN2B reduziu LTP em dois ratos com uma semana de idade, mas não naqueles com mais de seis semanas [66]. Alguns estudos farmacológicos também foram realizados na Vivo, onde, embora seja mais difícil determinar as concentrações exatas às quais a sinapse CA3-CA1 está exposta, a variabilidade introduzida por diferentes ângulos de corte, técnicas e soluções de incubação é evitada. Infusões intra-hipocampais de Ro 25-6981 ou NVP bloquearam LTP induzida por tétano na Vivo em ratos de quatro a seis semanas de idade [67], ao passo que, quando as drogas foram administradas por via intraperitoneal, apenas NVP bloqueou LTP com Ro 25-6981 não tendo nenhum efeito [67,68] esta aparente discrepância é provavelmente o resultado de diferentes níveis de Bloco NMDAR. Portanto, mesmo na Vivo estudos não produziram uma conclusão clara.

Como esses estudos farmacológicos forneceram pouca evidência convincente para um papel altamente seletivo de qualquer subunidade na indução de LTP, uma hipótese alternativa deve ser considerada, em que qualquer subunidade pode suportar LTP, desde que permita a entrada de Ca 2+ suficiente, mas a subunidade que medeia a maior parte do O influxo de Ca 2+ terá uma importância maior. Este viés de subunidade será afetado por padrões de atividade neuronal em animais que se comportam, enquanto o protocolo de indução irá influenciar o viés de subunidade em estudos de plasticidade sináptica. A modelagem de transferência de carga de Erreger et al. [34] sugere que a frequência de estimulação afeta qual subunidade predomina especificamente, GluN2A deve transportar a maioria da corrente em LTP induzida tetanicamente, enquanto GluN2B pode transportar mais corrente em protocolos de frequência mais baixa [34]. De fato, Ro 25-6981 bloqueou a indução de LTP dependente do tempo de pico (t-LTP) em fatias agudas do hipocampo de camundongos adultos [69,70], que é induzida por um paradigma de baixa frequência, embora não prejudique o tétano LTP induzida por ele [70]. No entanto, complicando essa interpretação, Zhang et al. [70] descobriram, embora com uma concentração alta e, portanto, menos seletiva, que a NVP também bloqueou o t-LTP. Além disso, Gerkin et al. [71] descobriram que uma concentração equivalente de Ro 25-6981 não bloqueou t-LTP em neurônios de cultura do hipocampo, mas NVP o fez realizando emparelhamentos pré-pós a 1 Hz, em vez de 0,1–0,2 Hz, e o uso de neurônios em cultura, pode ser responsável por este resultado diferente. Outros estudos forneceram evidências adicionais de um viés de subunidade devido à transferência de carga. Por exemplo, um protocolo de emparelhamento deve limitar a importância da cinética da subunidade, uma vez que o neurônio pós-sináptico é mantido em um potencial despolarizado para remover o bloco de Mg 2+. Portanto, nenhuma subunidade seria predita a dominar, e qualquer tendência seria determinada pelo número de cada subunidade presente na sinapse. Na verdade, Berberich et al. [72] descobriram que LTP induzido por emparelhamento não foi bloqueado por NVP, Ro 25-6891 ou AP5 quando usado em concentrações suficientemente baixas para ter um impacto mínimo na transferência de carga durante a indução, no entanto, quando as concentrações de antagonista foram aumentadas para um nível que reduziu significativamente transferência de carga, ambos os antagonistas de GluN2A e GluN2B causaram uma redução equivalente na magnitude de LTP. Também é importante considerar a complicação introduzida pela grande população tri-heteromérica de NMDARs. Um estudo recente descobriu que apenas altas concentrações de Ro 25-6981 poderiam prejudicar a LTP induzida por teta-burst, possivelmente porque o antagonista começa a inibir esses tri-heterômeros [9].

Em geral, portanto, a conclusão dos dados farmacológicos atuais, com a ressalva de que não existe nenhum antagonista de GluN2A seletivo para subunidades, é que qualquer uma das subunidades é capaz de suportar a indução de LTP, desde que possam mediar a transferência de carga suficiente (e o influxo de Ca 2+ associado) . Qual subunidade medeia a maior parte da transferência de carga será influenciada pela idade, porque a abundância relativa dessas duas subunidades muda ao longo do desenvolvimento [20,28,30]. Dentro de uma determinada faixa etária, o protocolo de indução usado pode enviesar qual subunidade dá uma contribuição maior devido às diferentes cinéticas das duas subunidades. Especificamente, nos dois extremos de frequência, t-LTP pode ter uma contribuição maior de NMDARs contendo subunidade GluN2B, enquanto LTP induzido por tétano poderia ter uma contribuição maior de NMDARs contendo subunidade GluN2A [34] a maior capacidade da subunidade GluN2A- contendo NMDARs para conduzir a indução de LTP tetânico recebeu suporte adicional do trabalho de modelagem [73]. A importância potencial da frequência de estimulação durante a indução significa que, a fim de explorar completamente o papel de GluN2A e GluN2B na plasticidade, é vital investigar mais a fundo os tipos de padrões de atividade que impulsionam as mudanças sinápticas no comportamento dos animais.

No entanto, os antagonistas farmacológicos apenas bloqueiam a ligação ao ligante e as propriedades do canal do NMDAR e, portanto, os estudos farmacológicos não abordam diretamente se a presença física de subunidades NMDAR na sinapse poderia desempenhar um papel adicional àquele na mediação do influxo de Ca 2+. A outra função mais importante na plasticidade provavelmente está relacionada às associações intracelulares diretas e indiretas feitas pelo CTD GluN2. Manipulações genéticas que removem ou alteram as subunidades GluN2 podem lançar alguma luz sobre se a seletividade da subunidade na indução LTP poderia surgir por meio dessas interações de interesse particular se a subunidade GluN2B desempenha um papel crucial devido à sua associação com CaMKII.

Um knock-out genético condicional de subunidades GluN2B no subcampo CA3 aboliu LTP induzida por tétano nas sinapses CA3 comissural e CA3 comissural / associacional [74]. Em camundongos sem GluN2B no CA1 e no neocórtex, a LTP induzida por dois tetanis foi prejudicada, mas esse déficit pode ser superado administrando vários tetanis [75]. Um efeito menor na LTP foi visto em outro camundongo knock-out GluN2B específico para o prosencéfalo, onde a LTP era deficiente apenas quando induzida por um protocolo de emparelhamento e não por um protocolo mais forte usando dois tetanis [76]. Outras manipulações genéticas que afetam indiretamente os níveis de GluN2B também mostraram prejuízos LTP consideráveis. Por exemplo, a proteína semelhante à cinesina KIF17 transporta NMDARs contendo subunidade GluN2B para a sinapse, e camundongos knock-out KIF17 [77], ou camundongos portadores de mutações em KIF17 que interrompem seu carregamento ou descarregamento de GluN2B [78], mostram GluN2B sináptico reduzido e também aboliu (KIF17 knock-out) ou diminuiu (KIF17 mutante) LTP induzida por um único tétano. No entanto, ao interpretar os resultados de manipulações genéticas como evidência para um papel de GluN2B em LTP, deve ser lembrado que tais manipulações de longo prazo podem desencadear mudanças compensatórias no nível celular, como aumento do recrutamento de CaMKII por outros componentes do PSD, ou mesmo no nível da rede, por meio de mudanças na inibição, por exemplo. De nota particular, as linhas de eliminação de GluN2B também mostram pequenas reduções em GluN2A [77,78], GluN1 [74] ou densidade da coluna [74,75]. Dado que as subunidades de GluN2B devem, portanto, contribuir para a regulação dos níveis de NMDAR e integridade estrutural pós-sináptica, é difícil atribuir totalmente as deficiências de LTP encontradas após a redução crônica de GluN2B a um papel estrutural / de interação único do CTD de GluN2B em LTP.

Portanto, é interessante que manipulações de prazo mais curto, apesar de apenas reduzirem o conteúdo de GluN2B, produziram efeitos mais fortes do que nocautes genéticos completos. Por exemplo, o knockdown de GluN2B com interferência de RNA (RNAi) causou uma redução profunda na magnitude da LTP induzida em ratos de dois meses de idade, embora um protocolo LTP muito forte (quatro tetani) tenha sido usado [79]. LTP também foi abolido em fatias incubadas por 2 h com um peptídeo C-terminal GluN2B permeável à membrana que interrompeu a interação GluN2B-PSD e causou uma diminuição consequente no conteúdo de GluN2B sináptico [80]. No entanto, como camundongos com redução sináptica GluN2A [81] ou GluN2A knock-out [82] também exibem LTP reduzido, que pode ser recuperado por um protocolo de indução mais forte com múltiplos tetanis [83], esses experimentos por si só não fornecem evidências convincentes de um papel único das interações intracelulares feitas por GluN2B.

Os experimentos inversos, usando a superexpressão seletiva de subunidade, mostram que a LTP é aumentada em camundongos adultos [84] e idosos [85] e ratos adultos [86], aumentando o GluN2B. Camundongos knock-out para Cdk5 com níveis elevados de GluN2B sináptica também mostram LTP aumentada [87]. Por outro lado, camundongos com superexpressão de GluN2A não mostram LTP aumentada [88], sugerindo que GluN2B pode desempenhar um papel único. No entanto, LTP elevado foi observado em camundongos nocaute de disbindina que aumentaram as correntes mediadas por GluN2A [89], portanto, não está completamente claro se o LTP aumentado em roedores com superexpressão de GluN2B surge de níveis mais elevados de influxo de Ca 2+ devido ao aumento de NMDAR -corrente mediada ou devido a uma importante contribuição da própria subunidade GluN2B. Portanto, os dados de estudos de nocaute e superexpressão sugerem que a subunidade GluN2B é importante para a indução de LTP, mas não distinguem de forma convincente entre um papel único de GluN2B na sinapse ou um efeito de limiar geral. No último caso, a redução ou aumento no conteúdo de NMDAR sináptico produzido por essas manipulações genéticas alteraria a magnitude da LTP simplesmente por causa de mudanças não específicas na quantidade de influxo de Ca 2+ durante a indução.

Em vez de tentar demonstrar um papel único para GluN2B, excluindo essa possibilidade limite, os estudos se concentraram em manipular as características distintivas da subunidade GluN2B, em particular suas interações intracelulares. A evidência mais convincente de um papel exclusivamente importante para a interação entre GluN2B e CaMKII em LTP vem de experimentos que perturbam diretamente esta associação. Os primeiros dados vieram do trabalho de Barria & amp Malinow [50], eles mostraram que LTP foi bloqueado em fatias organotípicas do hipocampo transfectadas com uma construção GluN2B prejudicada na ligação a CaMKII. Além disso, a deficiência de LTP causada pela transfecção de GluN2A recombinante, que conduz uma mudança no conteúdo de NMDAR sináptico de GluN2B para GluN2A, pode ser melhorada pela transfecção de uma forma mutada de GluN2A com uma capacidade aprimorada de se ligar a CaMKII [50]. Isto sugere ainda que uma função importante do GluN2B de tipo selvagem é manter CaMKII suficiente na sinapse. Essas descobertas foram estendidas a fatias agudas de uma mutação induzível que enfraquece a LTP prejudicada pela interação GluN2B-CaMKII induzida por um protocolo tetânico e de 10 Hz [51], enquanto um camundongo knock-in com duas mutações pontuais que diminuem o GluN2B-CaMKII a interação também mostrou uma grande redução na LTP induzida por dois tetani [90]. Esta interação é regulada por ambos os componentes como inibidores de CaMKII, que inicialmente interrompe a associação GluN2B-CaMKII, leva à regulação negativa do conteúdo de GluN2B sináptico em 2 he um comprometimento concomitante em LTP [80]. A inibição de CaMKII foi removida e, portanto, a atividade da quinase CaMKII restaurada, antes que a LTP fosse induzida e, portanto, o déficit de LTP observado por Gardoni et al. [80] pode ser atribuído a uma composição alterada da subunidade sináptica.

Uma razão pela qual a interação GluN2B-CaMKII é tão importante para LTP pode ser seu efeito nos AMPARs. A fosforilação de Ser831 em GluA1 pode ser necessária para a inserção de AMPAR, e essa fosforilação não ocorre quando a interação GluN2B-CaMKII é bloqueada [90], o que pode impedir o fortalecimento sináptico. Assim, por meio de sua forte afinidade para CaMKII, parece que GluN2B pode desempenhar um papel especial na sinapse adicional à sua função como um canal iônico. Isso ficou particularmente claro quando, em uma idade em que a inibição farmacológica de GluN2B com Ro 25-6981 não bloqueava mais a LTP induzida por emparelhamento, a LTP foi prejudicada pelo knock-down de RNAi de GluN2B [91]. Esta diferença parece diretamente relacionada a um papel único do CTD GluN2B, pois, após o knock-down de RNAi de GluN2B e o prejuízo LTP resultante, LTP poderia ser restaurado por um GluN2B resistente a RNAi ou uma quimera de GluN2A com a cauda GluN2B, mas não uma quimera de GluN2B com a cauda GluN2A [91]. Assim, a presença física de GluN2B pode ser importante, independentemente de sua contribuição para o influxo de Ca 2+. Isso explica como o GluN2B poderia ter um papel único e fundamental na indução de LTP, apesar do bloqueio farmacológico de GluN2B não prejudicar a LTP induzida por certos paradigmas.

No entanto, isso não significa que o CTD GluN2A não contribua para o LTP. Foi demonstrado que NMDARs contendo subunidades GluN2A por si só podem desencadear uma forma de LTP dependente da via Ras-GRF2 / Erk Map Kinase [52], sugerindo que podem ocorrer interações únicas. De fato, uma linha de camundongos com um truncamento C-terminal de GluN2A mostrou LTP induzido por tétano prejudicado, com o LTP restante suportado por NMDARs contendo subunidade GluN2B [66,92]. No entanto, como a mutação de truncamento também causou uma redução geral nos níveis de GluN2A nesta linha de camundongos, bem como uma possível mudança para uma população NMDAR tri-heteromérica pura, é possível que o comprometimento de LTP tenha surgido de um efeito de limiar do influxo reduzido de Ca 2+ em vez de um papel único do CTD GluN2A. Apoiando a interpretação do limite, protocolos de indução mais fortes esperados para promover níveis mais elevados de influxo de Ca 2+ poderiam superar os déficits de LTP em camundongos com um truncamento C-terminal de GluN2A neste [66] e em outro estudo [93]. Assim, a evidência de um papel privilegiado de GluN2A na indução de LTP é mais fraca.

Uma consideração vital ao investigar um papel seletivo das subunidades NMDAR em LTP é que as sinapses CA3-CA1 não são uma população uniforme. Mudanças no campo extracelular ou na resposta de célula inteira a um protocolo de plasticidade são, portanto, as mudanças somadas de uma população heterogênea de sinapses que pode responder de forma diferente ao mesmo padrão de atividade. Estudos de imagem estrutural e rotulagem molecular revelaram que, mesmo no cérebro adulto, existem diferentes categorias de formato da coluna pós-sináptica que também têm assinaturas de receptor distintas [94]. Imagens de espinhas individuais mostraram que os antagonistas de GluN2B reduzem seletivamente EPSCs evocados por desencadeamento de glutamato e transientes de Ca 2+ em espinhas pequenas [38], indicando que GluN2B está concentrado em tais espinhas. Isso é de interesse particular porque experimentos de imagem crônicos revelaram que, embora o volume de todas as espinhas aumente após um protocolo de indução LTP, essa expansão só é preservada nas espinhas inicialmente classificadas como pequenas, mas é transitório em outras [95]. Isso sugere que esses tipos distintos de espinhos, com suas diferentes composições de subunidades NMDAR, podem se envolver de maneira diferente nos processos de plasticidade e, portanto, podem desempenhar papéis independentes, mesmo no cérebro maduro. Portanto, o uso da variabilidade na estrutura e composição das sinapses pode ser uma abordagem adicional frutífera para estudar o papel das subunidades NMDAR no LTP e no processamento de informações em geral. A microscopia eletrônica e a imunomarcação revelaram que essas diferentes populações de espinha são distribuídas de forma assimétrica no cérebro de camundongo adulto, especificamente, as espinhas CA1 pós-sinápticas que recebem dados do CA3 esquerdo são principalmente pequenas e ricas em NMDARs contendo subunidades GluN2B, enquanto aqueles que recebem informações do CA3 direito tendem a ser maiores e mais ricos em AMPARs [94,96]. Isso permitiu que esses diferentes tipos de coluna, com seus diferentes conteúdos de GluN2B, fossem direcionados optogeneticamente para testar a hipótese de que as subunidades de GluN2B são particularmente importantes para a indução de LTP. Ao injetar canalrodopsina-2 (ChR2) sob o controle de um promotor dependente de Cre no CA3 esquerdo ou direito de camundongos CaMKII-Cre, a entrada CA3 excitatória esquerda ou direita em CA1 poderia ser recrutada seletivamente. Verificou-se que apenas as sinapses CA3-CA1 restantes mostraram LTP induzida por protocolos dependentes do tempo de pico ou baseados em teta [69]. Além disso, isso foi provavelmente o resultado do maior conteúdo de GluN2B de espinhos que receberam projeções CA3 esquerda, como Ro 25-6981 causou uma maior redução na corrente mediada por NMDAR em camundongos injetados à esquerda e também bloqueou a plasticidade observada [69].Embora algum GluN2B estivesse presente nas sinapses CA3-CA1 certas, eles pareciam incapazes de expressar LTP, uma explicação é que eles já estão na força sináptica máxima possível que pode ser mantida. Será interessante testar se uma assimetria semelhante é encontrada seguindo paradigmas de indução mais fortes, como LTP induzido por tétano, embora as limitações atuais da cinética de ChR2 na condução de neurônios piramidais em uma frequência suficientemente alta impeçam o teste direto disso.

Em resumo (figura 1b), a conclusão mais parcimoniosa da evidência disponível é que ambas as subunidades GluN2A e GluN2B podem suportar o influxo de Ca 2+ necessário para induzir LTP. No entanto, qual subunidade predomina na mediação desse influxo de Ca 2+, e assim contribui mais para a indução de LTP, depende do protocolo e também do estágio de desenvolvimento, já que este último afeta a abundância da subunidade na coluna pós-sináptica. Desde que os NMDARs presentes possam suportar um influxo suficiente de Ca 2+, a subunidade GluN2B parece desempenhar um papel adicional único por causa de sua associação com CaMKII. Esta interação direciona CaMKII para a vizinhança do influxo de Ca 2+ no PSD e também fornece um local de ligação para o CaMKII ativado adicional recrutado após um protocolo de indução de LTP. Finalmente, GluN2B ajuda a manter a ativação CaMKII e localizá-lo no PSD na vizinhança de seus substratos celulares, permitindo que ele desencadeie as vias a jusante que medeiam a expressão de LTP.

(c) Depressão de longo prazo

Dado o possível viés para uma importante contribuição da subunidade GluN2B para a indução de LTP, um viés oposto poderia ser esperado para LTD dependente de NMDAR. No entanto, os estudos sobre a dependência da subunidade NMDAR de LTD produziram resultados ainda mais contraditórios do que aqueles para LTP, tornando difícil tirar conclusões unificadoras. Os diferentes tipos de descobertas são ilustrados a seguir e possíveis explicações para as controvérsias são oferecidas. Uma das principais complicações neste campo é a forte dependência da indução de LTD na idade de desenvolvimento, porque pequenas mudanças na idade afetam a magnitude ou mesmo a presença de LTD [97]. No entanto, isso pode fornecer informações sobre os mecanismos envolvidos, especialmente devido à mudança no padrão de expressão da subunidade ao longo do desenvolvimento [20,30]. Muito poucos estudos abordaram o envolvimento de subunidades no LTD dependente do tempo de pico no hipocampo e, portanto, a discussão a seguir se concentrará no LTD induzido por baixa frequência. No entanto, os grupos que investigam esta forma de LTD muitas vezes chegaram a conclusões opostas sobre a especificidade da subunidade, apesar de usar preparações experimentais muito semelhantes. Por exemplo, alguns estudos baseados em farmacologia descobriram que uma concentração de NVP que bloqueou LTP não prejudicou o LTD em cultura [71], em fatias agudas [60] ou na Vivo [68], sugerindo que as subunidades GluN2A não são necessárias para a indução de LTD. Em contraste, outros estudos descobriram que as concentrações de NVP que prejudicaram a LTP também bloquearam o LTD [61,65]. É possível que NVP cause uma redução substancial na corrente mediada por NMDAR que evita LTP e, dependendo das concentrações precisas usadas, um influxo de Ca 2+ suficiente permanece para desencadear as cascatas moleculares a jusante que medeiam LTD. A importância da concentração do antagonista na determinação das conclusões experimentais é ilustrada pelas descobertas de Fox et al. [67], onde, de duas concentrações de NVP administradas por via intraperitoneal que bloqueou LTP na Vivo, apenas a concentração mais elevada bloqueou o LTD. No geral, portanto, a extensão em que as subunidades de GluN2A estão envolvidas na indução de LTD sob circunstâncias fisiológicas ainda não está clara, mas certamente não há evidência farmacológica de que elas desempenham um papel obrigatório ou único.

Tem havido um foco particular em um possível papel de NMDARs contendo subunidades GluN2B em LTD. Alguns grupos descobriram que os antagonistas específicos de GluN2B Ro 25-6981 e ifenprodil bloqueiam LTD em fatias agudas [60,64], em cultura [71] e na Vivo [67,68], mesmo quando uma maior redução de corrente mediada por NMDAR por NVP não tem efeito [60,68,71]. No entanto, como com os resultados contraditórios relatados com o antagonismo de GluN2A, muitos outros estudos descobriram que a mesma manipulação não tem efeito na indução de LTD em fatias agudas, apesar de usar concentrações equivalentes ou mais altas de antagonistas de GluN2B [61,65,98,99]. A orientação de corte utilizada pode explicar parcialmente a discordância entre esses achados, uma vez que Bartlett et al. [100] descobriram que as fatias coronais (como usadas em [60]) tinham uma forma de LTD que era sensível a Ro 25-6981, enquanto as fatias sagitais (como usadas em [65]) tinham uma forma independente de GluN2B de LTD, provavelmente devido à preservação mais forte das projeções colinérgicas com um ângulo de corte sagital. Na verdade, quando eles bloquearam os receptores muscarínicos de acetilcolina, eles desmascararam um LTD dependente de GluN2B [100]. Os resultados contraditórios encontrados em fatias cortadas no ângulo transversal, onde estudos encontraram dependência de GluN2B [53,64] ou independência de GluN2B [98,99] de LTD, podem resultar de variações sutis na integridade das fibras colinérgicas.

Um outro fator que contribui para a variabilidade na sensibilidade de LTD ao antagonismo de GluN2B pode ser a extensão em que NMDARs contendo subunidades de GluN2B extra-sinápticos são recrutados. O protocolo de indução de baixa frequência tradicional às vezes é combinado com a aplicação do inibidor de captação de glutamato treo-β-hidroxiaspartato (TBOA), que provavelmente aumentaria a ativação da população de receptores extra-sinápticos. Efeitos contrastantes foram relatados após a aplicação de TBOA: não afetou o envolvimento do GluN2B no LTD [65], produziu um LTD dependente do GluN2B [101] ou mesmo diminuiu a magnitude do LTD [98]. A última descoberta sugere que NMDARs extra-sinápticos, possivelmente contendo a subunidade GluN2B, poderiam exercer um papel modulador negativo no LTD sob algumas condições experimentais. Esta sugestão é apoiada por um estudo que descobriu que o bloqueio do ifenprodil do GluN2B realmente aumentou a magnitude do LTD [102]. No entanto, não se pode excluir que a discrepância entre esses achados resulta do complexo modo de ação dos antagonistas não competitivos de GluN2B usados, uma vez que a extensão de seu bloqueio varia com a concentração de agonista [57], e tais concentrações são provavelmente mais variáveis ​​quando a captação de glutamato é bloqueada. Em geral, portanto, as descobertas contraditórias significam que a natureza precisa do papel desempenhado pelos NMDARs contendo subunidades GluN2B em LTD é tudo menos clara, e a indução de LTD pode ser particularmente sensível às condições experimentais.

As abordagens transgênicas também não forneceram suporte conclusivo para um papel único de qualquer uma das subunidades no LTD e, de fato, a maioria dos resultados foram negativos. Uma redução nos níveis sinápticos de GluN2B, alcançada pela interrupção da associação de GluN2B com PSD-95 de forma aguda, não alterou o LTD, apesar de ser suficiente para prejudicar LTP [80]. O camundongo knock-out para GluN2A também não mostrou comprometimento do LTD, embora o mesmo estudo também não tenha encontrado redução na LTP [103]. Além disso, a superexpressão de GluN2B não afetou a magnitude do LTD induzido por estimulação tradicional de 1 Hz [86], e nem a superexpressão direta [88] ou indireta [89] de GluN2A, embora a superexpressão de GluN2A reduziu o LTD induzido por estimulação de 3 ou 5 Hz sem afetar o LTP [88]. As únicas descobertas positivas claras foram que os camundongos knock-out para GluN2B [75] e camundongos knock-out para KIF17, que têm uma redução consequente no GluN2B sináptico [77], ambos têm LTD prejudicado. No entanto, isso não é evidência de um papel seletivo de subunidade de GluN2B em LTD porque essas manipulações também causaram LTP reduzida. No geral, não há evidências claras de abordagens transgênicas de que qualquer uma das subunidades desempenhe um papel insubstituível na indução de LTD, embora deficiências tenham sido mais frequentemente associadas a manipulações específicas de GluN2B.

Uma possibilidade final é que uma subunidade dê uma contribuição mais importante para o LTD por meio de suas interações intracelulares únicas. Isso pode ser porque facilita o acoplamento do influxo de Ca 2+ às vias a jusante que medeiam uma redução na força sináptica. Alternativamente, NMDARs podem desempenhar um papel diferente no LTD, onde sua ativação ainda é necessária para desencadear cascatas de sinalização a jusante, mas não para mediar o influxo de Ca 2+. A evidência para esta última proposta é a demonstração de que o LTD dependente de NMDAR ainda pode ser induzido apesar do fluxo de íons mediado por NMDAR ser bloqueado [104]. Isso sugere que o nível basal de Ca 2+, ao invés do influxo de Ca 2+ através de NMDARs, é necessário para a indução de LTD e pode explicar por que nenhum achado claro emergiu de estudos usando antagonistas farmacológicos específicos de subunidade. Também implica que qualquer função seletiva de subunidade de NMDARs emergiria somente por meio de suas associações intracelulares únicas. Conforme previsto pela exigência de CaMKII na indução de LTP sozinho, a interrupção genética da associação GluN2B-CaMKII não prejudicou o LTD [51]. No entanto, foram identificadas outras interações que podem ser importantes. Por exemplo, LTD sozinho foi prejudicado em camundongos com um nocaute genético do receptor de neurotrofina p75 [105]. O mecanismo específico responsável por esse déficit foi relatado como sendo que o fator neurotrófico derivado do cérebro não pode ativar o receptor de neurotrofina p75 para habilitar LTD e, porque a linha de camundongos também teve uma redução geral nos níveis de GluN2B, sugere um possível papel de sinalização de GluN2B. Outra associação importante pode ser aquela entre Ras-GRF1 e o CTD GluN2B, uma vez que LTD é prejudicado em camundongos knock-out para Ras-GRF1 [53]. O nível de Ras-GRF1 pode determinar o tipo de depressão induzida em condições fisiológicas, uma vez que LTD é dependente de GluN2B quando esta associação predomina [100]. Além disso, a concentração de acetilcolina é inversamente correlacionada com o nível de interação GluN2B-Ras-GRF1 [100], sugerindo que a atividade do sistema colinérgico poderia modular a dependência da subunidade da indução de LTD.

Em resumo, os dados são inconclusivos, mas nem o GluN2A nem a subunidade GluN2B parecem desempenhar um papel obrigatório na indução de LTD. No entanto, a subunidade GluN2B tem sido implicada com mais frequência, talvez por causa de suas associações únicas com componentes de vias que modulam ou medeiam LTD.

5. Metaplasticidade

O estado basal da sinapse provavelmente desempenha um papel crucial na determinação da natureza de suas mudanças em resposta a uma entrada específica. Foi até mesmo sugerido que isso afeta se o mecanismo de expressão de LTP é pré ou pós-sináptico [24]. Dado que não há evidência convincente de seletividade de subunidade completa na indução de qualquer direção de plasticidade, é concebível que as subunidades GluN2A e GluN2B desempenhem um papel mais sutil, enviesando a sinapse para a indução de LTP ou LTD. Assim, foi investigado se a alteração dos níveis relativos ou absolutos de qualquer uma das subunidades muda o estado basal de uma sinapse o suficiente para influenciar a futura indução de plasticidade.

Mudanças dependentes da atividade nos padrões de expressão da subunidade ocorrem no prosencéfalo durante o desenvolvimento [20,30], e mesmo uma curta história de atividade neuronal pode alterar o equilíbrio da subunidade na sinapse CA3-CA1 em roedores jovens [106-108] . Para investigar se as mudanças na composição da subunidade alteram a resposta da sinapse à atividade posterior, Xu et al. [109] usaram 600 pulsos de baixa intensidade em frequências variadas para "preparar" a sinapse, esta preparação foi insuficiente para alterar os pesos sinápticos, mas alterou a razão GluN2A / GluN2B. Seguindo este priming, diferentes protocolos de plasticidade foram aplicados. A magnitude de LTP foi aumentada e LTD reduzida, por priming de baixa frequência que diminuiu a razão GluN2A / GluN2B. Em contraste, um LTD elevado e LTP suprimido foi visto se a sinapse foi iniciada com estimulação de alta frequência que aumentou a razão GluN2A / GluN2B. Eles também usaram um protocolo de plasticidade que não alterou os pesos sinápticos em uma fatia "ingênua" e descobriram que este protocolo de limite poderia induzir LTP se precedido por priming de baixa frequência, mas induzido LTD se precedido por priming de alta frequência. Além disso, o efeito da iniciação no resultado deste protocolo de limiar pode ser replicado por manipulação direta da razão GluN2A / GluN2B usando bloqueio parcial por antagonistas farmacológicos (tendo concentrações tituladas com AP5 de modo que a própria redução de corrente mediada por NMDAR não poderia explicar o efeito) [109]. Este resultado sugere que a atividade sináptica que aumenta o conteúdo relativo de GluN2B de uma sinapse a inclina para LTP, enquanto um aumento relativo de GluN2A encoraja a indução de LTD. O efeito da atividade anterior também foi medido no nível de sinapse única [110]. A transfecção esparsa de culturas neuronais com um construto que bloqueia a liberação da vesícula pré-sináptica foi usada para silenciar algumas entradas espinhas pós-sinápticas de tamanho correspondente, uma com uma entrada silenciada e a outra com uma entrada ativa, foram então expostas a um protocolo de indução LTP baseado em glutamato. . As sinapses silenciadas mostraram LTP e crescimento da coluna subsequente com um protocolo de baixa intensidade, enquanto um número maior e maior duração de eventos de desencadeamento do glutamato foram necessários para induzir LTP e mudanças estruturais nas colunas que estavam recebendo uma entrada ativa. Além disso, GluN2B pareceu mediar o aumento da propensão para a potenciação, uma vez que a corrente mediada por GluN2B foi aumentada em sinapses silenciadas [110]. Portanto, ambos os estudos sugerem que as alterações metaplásicas que causam um aumento relativo ou absoluto no conteúdo sináptico de GluN2B irão direcionar uma sinapse para LTP.

Fatores neuromoduladores são conhecidos por influenciar como uma sinapse responde a um determinado padrão de atividade, e é possível que eles alterem o estado basal da sinapse de uma maneira seletiva de subunidade. Os níveis de dopamina modulam a plasticidade, por exemplo, a aplicação de dopamina aumentou a LTP induzida por tétano por meio de uma cascata envolvendo o D1/5 receptor, quinases da família PKA e Src [111]. Este aumento de LTP foi bloqueado por Ro 25-6981 [111], sugerindo que um aumento em NMDARs contendo subunidades GluN2B pode ser o mecanismo de expressão para metaplasticidade dependente de dopamina, que está de acordo com os achados de estudos de metaplasticidade baseados em atividade. No entanto, nem todos os estudos de metaplasticidade apoiaram a conclusão de que o GluN2B estimula a LTP. O priming por ativação de receptores acoplados à proteína G e seus atuadores a jusante na família Src de quinases mostrou que as mudanças metaplásticas que aumentam o GluN2B tiveram o efeito oposto na plasticidade dos estudos mencionados [112]. Em vez disso, a Src quinase (ativada pelo receptor do peptídeo ativador de adenilato ciclase pituitária 1 PAC1R) foi mostrado para fosforilar GluN2A e, assim, aumentar as correntes mediadas por GluN2A, enquanto a Fyn quinase (ativada pelo D1/5 receptor) GluN2B fosforilado para aumentar as correntes mediadas por GluN2B. Por sua vez, isso influenciou a resposta a uma série de protocolos de indução de frequência diferentes: a mudança de LTD para indução LTP ocorreu em 10-20 Hz sem tratamento prévio com drogas, mas a exposição a drogas ativadoras de PAC1R e um consequente aumento de GluN2A significou que LTP foi induzido em frequências mais baixas pelo contraste, o limiar de indução LTP foi alterado para frequências mais altas se o D1/5 receptor foi ativado e, portanto, GluN2B foi aumentado [112]. Isso, portanto, sugeriu que GluN2A promove a indução de LTP. No geral, uma investigação mais aprofundada sobre metaplasticidade pode ajudar a desvendar como a atividade neuronal pode alterar os pesos sinápticos e se há uma contribuição de mudanças na composição da subunidade NMDAR para os efeitos de iniciação sináptica. Isso é especialmente importante, uma vez que o aprendizado e a memória não ocorrem de maneira isolada, mas em um contexto de atividade neuronal anterior e estímulos neuromodulatórios.

6. Subunidades do receptor NMDA no comportamento

A plasticidade sináptica é amplamente considerada um modelo celular para aprendizagem e memória [3,113], e houve indicações iniciais de um papel importante para NMDARs em certas formas de aprendizagem e memória [4,5]. Em paralelo às investigações sobre se há uma contribuição seletiva de subunidade para LTP e LTD, manipulações específicas de subunidade também foram usadas para questionar se as subunidades GluN2A e GluN2B são importantes para tarefas comportamentais com diferentes demandas cognitivas. Em alguns casos, deficiências em uma direção da plasticidade podem estar relacionadas a déficits de desempenho.

Os camundongos knock-out para GluN2A foram os primeiros a serem estudados comportamentalmente. A caracterização inicial desses camundongos sugeriu déficits de memória relativamente generalizados em comparação com controles C57BL / 6 [82], mas isso foi posteriormente atribuído ao alto grau de caráter da cepa CBA remanescente em seu histórico genético, uma linha conhecida por apresentar pior desempenho na água de Morris tarefa de labirinto (MWM) [114]. Uma vez em um fundo C57 quase puro, os déficits comportamentais encontrados foram relativamente limitados: camundongos knock-out para GluN2A e camundongos sem o CTD GluN2A não mostraram evidências de déficits de memória de longo prazo, já que os camundongos não foram prejudicados em tarefas espaciais adquiridas ao longo de uma série de dias (o MWM e o labirinto do braço radial) [115]. Camundongos com um nocaute de Neuropilina e proteína tolloid-like 1 (Neto1), um componente do complexo de proteína NMDAR, têm uma redução de aproximadamente um terço em GluN2A no PSD e um comprometimento LTP, mas também adquiriram o MWM em um taxa normal [81]. Além disso, as manipulações farmacológicas produziram um resultado semelhante Ge et al. [68] usaram o antagonista de preferência da subunidade GluN2A NVP injetado intraperitonealmente em uma concentração que prejudicou LTP na Vivo, e não viram nenhum déficit de ratos tratados com NVP na aquisição ou consolidação de MWM. Assim, o GluN2A não parece necessário para tarefas de memória de longo prazo adquiridas de forma incremental.

No entanto, as manipulações de GluN2A foram associadas a déficits de memória espacial de curto prazo, porque camundongos knock-out para GluN2A e camundongos sem o CTD de GluN2A foram prejudicados em uma tarefa de labirinto em T de não correspondência com o local e também em sua capacidade de distinguir entre braços com base em quão recentemente eles foram visitados em um teste no labirinto de braço radial [115]. Em apoio adicional de um papel para GluN2A na memória espacial de curto prazo, a infusão de NVP no CA1 prejudicou o desempenho em uma tarefa de labirinto em T de alternância atrasada [116]. Também parece que NMDARs contendo subunidades GluN2A podem contribuir para a formação rápida de contextos ou representações de objetos. Camundongos knock-out para GluN2A, que tinham um limiar aumentado para indução de LTP, só foram prejudicados em um paradigma de condicionamento de medo contextual dependente de hipocampo quando as demandas da tarefa foram aumentadas pela redução da exposição ao contexto antes da aplicação do choque [83], sugerindo um déficit no formação rápida de uma representação de contexto.Camundongos nocaute do Neto1 foram prejudicados em uma tarefa de reconhecimento de objeto deslocado, mas não em uma nova tarefa de reconhecimento de objeto [81]. Ambas as tarefas requerem um aprendizado relativamente rápido sobre um objeto, mas apenas a tarefa de deslocamento tem um claro componente espacial e claro envolvimento do hipocampo (mas também ver [117]). No geral, os ratos com nenhum ou reduzido GluN2A mostram alguns problemas de aprendizagem, que são limitados à memória de curto prazo e à rápida aquisição de informações espaciais. A fim de testar se este é um papel particular de GluN2A ou um efeito não específico de correntes mediadas por NMDAR reduzidas (especialmente dada a falta de seletividade de NVP), esses resultados devem ser comparados aos de camundongos com manipulações genéticas e farmacológicas equivalentes de Níveis de GluN2B.

Há evidências consideráveis ​​de que as manipulações farmacológicas e genéticas da subunidade GluN2B produzem deficiências semelhantes às descritas acima, sugerindo que os déficits de memória de curto prazo observados em camundongos deficientes em GluN2A são principalmente devido a uma redução geral na corrente mediada por NMDAR. Por exemplo, camundongos com knock-out GluN2B pós-natal em neurônios piramidais de CA1 e giro dentado (DG) do hipocampo mostraram deficiências muito semelhantes aos camundongos knock-out GluN2A global, ou seja, um déficit de memória espacial de curto prazo em alternância espontânea no Labirinto em T, mas desempenho normal no MWM [76]. Este achado é apoiado por dados farmacológicos de ratos, onde a infusão de Ro 25-6981 ou ifenprodil na região CA1 do hipocampo prejudicou o desempenho em tarefas que requerem memória espacial de curto prazo, embora a memória de longo prazo não tenha sido testada [116]. Os ratos foram prejudicados em uma tarefa de alternância do labirinto em T atrasada com atrasos de 5 e 30 segundos, mas eles só cometeram significativamente mais erros win-shift do que os controles após um atraso de 30 segundos. Os ratos também tiveram latências de escape mais longas no ensaio 2 de uma tarefa de labirinto aquático de correspondência ao local atrasada, mas apenas quando o intervalo de retenção foi de 10 min, não 30 s [116]. Essas duas descobertas sugerem que as subunidades de GluN2B podem se tornar mais importantes quando os tempos de atraso aumentam. Deve-se notar, entretanto, que o antagonismo farmacológico dos NMDARs também afetará os interneurônios [59]. Em geral, as deficiências de memória de curto prazo semelhantes observadas após manipulações que removem ou reduzem a subunidade GluN2A ou GluN2B sugerem que este fenótipo é principalmente devido a uma diminuição nas correntes mediadas por NMDAR, em vez de uma contribuição seletiva de qualquer uma das subunidades.

No entanto, há evidências de que as subunidades de GluN2B podem desempenhar um papel adicional àquele compartilhado com GluN2A na memória de curto prazo, porque outros estudos encontraram deficiências mais generalizadas após a interrupção de GluN2B. Por exemplo, camundongos knock-out KIF17, que reduziram os níveis sinápticos de GluN2B devido a uma deficiência no transporte, tiveram um desempenho pior na tarefa MWM [77,78], um novo teste de objeto com longos atrasos [77] e condicionamento de medo contextual [77 ] Uma linha de camundongos knock-out para CA1 e GluN2B neocortical foi deficiente na aquisição de MWM, condicionamento de medo e alternância espontânea de labirinto em T [75]. No entanto, essas deficiências podem ser atribuídas a déficits extra-hipocampal [76]. Portanto, é tranquilizador que uma manipulação mais aguda envolvendo o knock-down de GluN2B mediado por RNAi no hipocampo de ratos também mostrou aquisição mais lenta da tarefa MWM [79]. Os autores também encontraram uma correlação entre o nível de GluN2B e o desempenho de MWM em uma população idosa de ratos [79]. No entanto, a natureza do envolvimento de GluN2B não pode ser correlacionada com uma direção de plasticidade como RNAi causou um déficit de LTP, mas LTD não foi investigado, enquanto ambas as linhas de camundongos geneticamente alteradas acima mencionadas tinham déficits em LTP e LTD. No entanto, esses estudos sugerem que GluN2B pode desempenhar um papel na memória de longo prazo que não foi visto em camundongos com nocaute ou redução de GluN2A, embora estudos adicionais usando manipulações agudas restritas ao hipocampo sejam necessários para verificar essa conclusão.

Para dissecar ainda mais um papel possivelmente único de GluN2B na aprendizagem e na memória, é útil investigar os déficits comportamentais associados a um comprometimento seletivo de uma direção da plasticidade. Para LTP, um prejuízo seletivo surge se a associação entre CaMKII e GluN2B for enfraquecida. Descobriu-se que esta manipulação causa déficits na aquisição da tarefa MWM, que poderia ser superada por treinamento prolongado, e também em uma tarefa de labirinto radial de oito braços de mudança espacial atrasada, onde os ratos tiveram que se lembrar dos braços com isca do primeira sessão e, em seguida, evitá-los na próxima tentativa para encontrar a recompensa alimentar [51]. Os autores atribuíram esse déficit a uma deficiência na formação de um mapa espacial. Outra linha de camundongos com interrupção genética da interação CaMKII-GluN2B projetada de uma maneira diferente mostrou menos deficiências comportamentais, sendo normal na aquisição MWM e desempenho de teste de sonda em 1–2 h pós-treinamento, mas, curiosamente, exibiu consolidação a longo prazo déficits, visto que tiveram pior desempenho em um teste de sondagem 24 horas após o treinamento [90].

Além disso, em contraste com as deficiências observadas após a superexpressão de GluN2A [88], a superexpressão de GluN2B demonstrou melhorar o desempenho de ratos adultos [84] e idosos [85] e ratos [86] em uma bateria de testes incluindo contexto e medo sugerido. condicionamento, memória de reconhecimento de objeto em intervalos de retenção mais longos, aquisição MWM e memória espacial de curto prazo. Camundongos knock-out para Cdk5, que aumentaram o GluN2B sináptico devido a uma redução em sua degradação, também mostraram ter aprimorado o aprendizado contextual em um paradigma de condicionamento de medo dependente de contexto [87]. Todas essas melhorias comportamentais foram associadas ao aumento da LTP, enquanto o LTD, quando investigado, não mudou [86]. Evidências mais fortes para uma ligação entre especificidade de subunidade em LTP e aprendizagem vêm de tarefas onde a aprendizagem e as respostas pós-sinápticas podem ser medidas simultaneamente. Usando o paradigma de condicionamento de traços em ratos, Valenzuela-Harrington et al. [118] mostraram que a aquisição dessa tarefa foi associada a um aumento da força da sinapse da via perfurante medial-DG do hipocampo. Além disso, a administração sistêmica de Ro 25-6981 bloqueou a aquisição de tarefas e as mudanças na força sináptica. Portanto, possivelmente por meio de sua contribuição para a indução de LTP via CaMKII, GluN2B parece ter um papel importante na aprendizagem e na memória.

Alguns déficits comportamentais também foram relacionados a um comprometimento do LTD dependente de GluN2B. Ge et al. [68] administrou Ro 25-6981 intraperitonealmente a ratos, que prejudicou o LTD, mas não LTP na Vivo, e descobriram que, embora a aquisição de uma tarefa MWM não fosse prejudicada por esta manipulação, os ratos que receberam Ro 25-6981 no dia de treinamento não conseguiram se lembrar da localização da plataforma 24 horas depois devido a um déficit relacionado à consolidação. Este desempenho comprometido pode ser imitado pela injeção de um peptídeo que evitou a endocitose de AMPAR (Tat-GluA23 anos), sugerindo que a deficiência estava relacionada a um processo semelhante ao LTD. No entanto, uma interpretação alternativa é que essa manipulação interrompeu a reconfiguração homeostática da rede e que esse processo é necessário para a consolidação.

Uma descoberta relatada por vários grupos é uma possível ligação entre LTD e aprendizagem reversa. Duffy et al. [101] descobriram que a administração subcutânea Ro 25-6981 bloqueou o LTD e prejudicou a aprendizagem de reversão em camundongos, e a aprendizagem de reversão deficiente no MWM também foi encontrada em camundongos com knock-out de GluN2B no hipocampo, embora LTD não tenha sido testado [76]. Em ratos, o LTD dependente de GluN2B não pode ser induzido em animais ingênuos na Vivo, mas poderia ser induzido uma vez que os animais experimentaram o treinamento MWM quando os ratos que haviam adquirido previamente o MWM foram testados em uma fase de reversão, aqueles ratos tratados com Ro 25-6981 ou o Tat-GluA23Y peptídeo foram prejudicados na aprendizagem reversa [119]. Em suporte adicional de um papel de LTD dependente de GluN2B na aprendizagem reversa, o aumento de LTD por administração subcutânea de d-serina aumentou a taxa na qual os camundongos aprenderam a fase de reversão no MWM [101], enquanto uma linha de camundongos com GluN2B- aprimorado as correntes mediadas não mostraram nenhuma melhoria na aquisição de uma tarefa MWM, mas mostraram um aprendizado de reversão mais rápido [87]. Assim, muitos dos estudos que investigam um papel das subunidades NMDAR no comportamento encontraram um "fenótipo de perseverança" que se correlaciona com uma deficiência em LTD dependente de GluN2B.

Há uma grande quantidade de evidências que sugerem que a plasticidade sináptica oferece suporte ao aprendizado e à memória [4,5,118,120], mas a ligação ainda não foi resolvida [121,122]. Portanto, os estudos que correlacionam a plasticidade e o comportamento têm sido informativos, independentemente de os mecanismos subjacentes, possivelmente seletivos para a subunidade, serem conhecidos. No entanto, as correlações entre déficits de plasticidade e problemas de aprendizagem e memória não fornecem uma ligação causal. Além disso, devemos ser cautelosos ao concluir que tais estudos fornecem evidências definitivas, dados os possíveis mecanismos compensatórios e mudanças de rede que podem ser desencadeados pelas manipulações experimentais aqui descritas. Claro, mesmo que a plasticidade apoie a aprendizagem e a memória, ainda não sabemos que tipos de plasticidade estariam envolvidos em tarefas com diferentes demandas cognitivas e, portanto, com tudo isso considerado, não é surpresa que os resultados desses estudos sejam complexo e frequentemente contraditório. Em alguns casos, foram encontradas correlações entre uma deficiência em uma direção da plasticidade e desempenho da tarefa e, ocasionalmente, subunidades particulares implicadas. No entanto, da mesma forma, algumas manipulações que causaram grandes prejuízos na magnitude da plasticidade tiveram pouco ou nenhum efeito nos testes comportamentais escolhidos, afetaram apenas certos aspectos das tarefas, ou mesmo apenas causaram um prejuízo quando a dificuldade da tarefa foi aumentada ou as demandas foram alteradas, como introduzindo um atraso. A assimetria hemisférica acima mencionada na distribuição da subunidade GluN2B e LTP na sinapse CA3-CA1 de camundongo pode ajudar a elucidar ainda mais o papel da plasticidade sináptica na aprendizagem e memória, e também determinar se há um envolvimento de subunidade particular. Embora não se saiba como essa assimetria surge no desenvolvimento e é mantida durante a vida adulta, as evidências de que pode ser importante no processamento da memória vêm de inversus vicerum ratos que mostram assimetria interrompida e exibem deficiências de memória [123].

7. Resumo

A hipótese de que diferentes subunidades de GluN2 medeiam seletivamente diferentes direções de plasticidade não é suportada pelos estudos disponíveis. Embora a falta de antagonistas específicos de GluN2A proíba o teste conclusivo dessa hipótese, quando as manipulações controlam a magnitude da redução de corrente mediada por NMDAR, não há evidências claras, ainda, de que qualquer subunidade desempenha um papel insubstituível na indução de LTP. No entanto, as diferentes cinéticas conferidas ao NMDAR pelas subunidades GluN2A e GluN2B significam que a contribuição de cada subunidade para a transferência de carga pode variar de acordo com o padrão de atividade pré-sináptica e, portanto, eles podem não desempenhar um papel igual na potenciação sob condições fisiológicas.

Independentemente do paradigma de indução usado, no entanto, a maioria das evidências sugere que a subunidade GluN2B tem uma importância maior para a indução LTP. Uma explicação para por que GluN2B pode exercer uma forte influência sobre LTP no hipocampo adulto, apesar de compreender uma proporção menor de subunidades GluN2 do que no início do desenvolvimento, seria se NMDARs contendo subunidades GluN2B carregassem mais influxo de Ca 2+ por unidade de corrente [38 ] Uma explicação alternativa, que está mais de acordo com a evidência prevalecente, é que GluN2B é particularmente importante para a indução de LTP porque sua presença na coluna ancora CaMKII no PSD. Assim, NMDARs contendo a subunidade GluN2B permitem a ativação das cascatas de sinalização a jusante que medeiam o fortalecimento sináptico, independentemente de elas suportarem a maioria do influxo de Ca 2+. Isso sugere que GluN2B é um fator necessário para a indução de LTP sob condições naturalísticas, mas, mais importante, se é ou não suficiente para suportar o influxo de Ca 2+ necessário pode depender do padrão de atividade pré-sináptica. Além disso, embora estudos de imagem baseados na coluna e estudos de assimetria tenham sugerido que pequenas espinhas, que tendem a ser ricas em GluN2B, têm uma maior propensão para a indução e manutenção de LTP, a presença de GluN2B pode não ser suficiente se as vias de sinalização a jusante e as mudanças estruturais já estão saturadas.

A literatura do LTD é ambígua, embora um maior número de estudos e o perfil de desenvolvimento do LTD apoiassem um papel mais central do GluN2B em sua indução. Exatamente por que isso pode ser não está claro, mas pode estar relacionado a associações intracelulares distintas daquelas com CaMKII. A maioria dos estudos de plasticidade investiga a resposta aos protocolos de indução no nível do potencial de campo celular ou extracelular e, assim, registra as mudanças somadas em muitas sinapses. No entanto, as sinapses não são iguais e, em vez disso, têm assinaturas estruturais e moleculares diferentes, o que pode ajudar a explicar pelo menos alguns dos achados contraditórios na literatura sobre plasticidade. No geral, dado que GluN2B parece importante para LTP e LTD, uma hipótese parcimoniosa é que esta subunidade confere a sinapse com propriedades maleáveis.

Dadas as conclusões contraditórias dos estudos de plasticidade, não é surpreendente que nenhuma das subunidades ainda tenha um papel claro na aprendizagem e na memória. O que a literatura atual sugere é que tanto GluN2A quanto GluN2B suportam processos de memória de curto prazo. Também há alguma evidência de que NMDARs contendo subunidades GluN2B podem fazer uma contribuição maior para o aprendizado quando a informação deve ser retida por um atraso maior ou há aquisição de tarefa incremental ao longo de vários dias.

Pode parecer surpreendente que as tarefas de memória de curto prazo freqüentemente pareçam as mais suscetíveis a lesões genéticas ou bloqueio farmacológico de NMDARs, especialmente à luz da proposta de que LTP dependente de NMDAR apóia a aquisição de tarefas por meio de aprendizado incremental [124]. No entanto, uma série de fatores tornam prematuro concluir que isso requer uma revisão da teoria que liga a plasticidade e o aprendizado. Em primeiro lugar, os NMDARs têm papéis adicionais ao seu envolvimento na plasticidade, conforme descrito posteriormente. Em segundo lugar, um knock-out global também removeria NMDARs localizados em interneurônios e, portanto, pode alterar a dinâmica da rede importante para a memória de curto prazo [125]. Em terceiro lugar, nos poucos estudos em que o nocaute da subunidade é restrito a células piramidais no hipocampo, os sistemas de navegação ainda podem ser afetados e como isso poderia interagir com as demandas cognitivas de tarefas de memória de curto e longo prazo não é conhecido. Em quarto lugar, mesmo as manipulações localizadas têm sido crônicas e, portanto, é provável que os mecanismos compensatórios sejam recrutados, é concebível que a memória de curto prazo exija maior poder de processamento online ou mudanças de rede rápidas e em grande escala, qualquer uma das quais pode precisar de um nível mais alto de Ca Influxo de 2+ para conduzi-los e, portanto, seria mais sensível a manipulações que reduzem NMDARs e, portanto, o influxo total de Ca 2+. Finalmente, o fato de que essas manipulações também muitas vezes prejudicam a LTP não implica necessariamente em uma ligação entre a LTP e a memória de curto prazo, apenas mostra que ambos os processos dependem de NMDARs. Na verdade, a potenciação de curto prazo também requer NMDARs e pode ter preferência de subunidade [9].

Em alguns estudos, foi possível relacionar um comprometimento comportamental a um déficit seletivo em uma direção da plasticidade. Em particular, há evidências de que a aquisição gradual e a consolidação de informações podem ser apoiadas pela interação GluN2B-CaMKII, que também é importante para LTP. Outro achado comum é que os mecanismos que suportam o aprendizado de reversão podem envolver um processo do tipo LTD dependente de GluN2B. Uma advertência dos estudos que relacionam deficiências de aprendizagem com déficits de LTD é que muitos laboratórios descobrem que eles não podem induzir LTD em roedores adultos, apesar de roedores dessa idade ainda serem capazes de realizar as tarefas de memória associadas. Isso sugere que os paradigmas de baixa frequência usados ​​para induzir LTD não imitam com sucesso o tipo de atividade que desencadeia a redução dos pesos sinápticos na Vivo, ou mesmo que as reduções específicas de sinapses na força não sejam a base do aprendizado, elas podem ser mais importantes para o refinamento do circuito durante o desenvolvimento. Uma maneira de reconciliar essas observações seria que o fortalecimento sináptico sempre apóia a aquisição de novas informações, mas uma depressão concomitante também é necessária em tarefas comportamentais que requerem reaprendizagem (aprendizagem reversa, extinção) ou refinamento da aprendizagem (memória de reconhecimento) para aumentar o ganho das sinapses recentemente potencializadas acima do ruído ou 'fundo'. Nesse cenário, um número limitado de sinapses potencializaria e carregaria novas informações, mas uma depressão geral seria observada no campo extracelular ou medições de células inteiras que registram populações de sinapses. Tal forma de depressão sináptica seria funcionalmente distinta dos mecanismos puramente homeostáticos, pois contribuiria para a codificação da informação.

8. Direções futuras

Para investigar totalmente a hipótese de seletividade de subunidade, as prioridades para o futuro devem incluir o desenvolvimento de ferramentas para bloquear seletivamente NMDARs contendo subunidades GluN2A. Além disso, o estabelecimento de técnicas para direcionar NMDARs tri-heteroméricos é fundamental para investigar seu papel. Parece provável que parte da confusão na literatura atual pode resultar das diferentes extensões em que esses receptores foram afetados pelas manipulações usadas. Combinar a marcação de subunidades com sondas fluorescentes e imagens ao vivo de alta resolução pode ajudar a estudar essa população em estudos de plasticidade baseados em coluna única. Alternativamente, se uma modificação pós-tradução, como uma ponte dissulfeto, pudesse ser introduzida para ligar as subunidades GluN2A e GluN2B sem interromper suas propriedades cinéticas, isso ajudaria na investigação no nível de células inteiras ou registros de campo extracelular. Dado que vários estudos sugeriram que a população tri-heteromérica pode ser substancial, ou mesmo dominante, no cérebro adulto, é provável que esta composição NMDAR tenha uma função importante. Isso pode ser porque os tri-heterômeros têm cinética de canal intermediário e, portanto, combinam a resposta mais rápida e as propriedades integrativas fornecidas pela subunidade GluN2A com as associações intracelulares importantes transmitidas pela subunidade GluN2B - em particular, permitindo que o influxo de Ca 2+ seja acoplado estreitamente às moléculas de sinalização a jusante , como CaMKII.

Para entender se as ligações entre o envolvimento de subunidades nos paradigmas de plasticidade e o comportamento são significativas, é importante demonstrar conclusivamente que as mudanças nos pesos sinápticos podem apoiar o aprendizado e a memória.Isso poderia então ser dissecado posteriormente para estabelecer os tipos e a localização sináptica de plasticidade que suportam tarefas comportamentais com diferentes demandas cognitivas. No passado, as limitações técnicas impediram o questionamento de uma ligação causal entre plasticidade e aprendizagem e memória. No entanto, novos avanços podem nos ajudar a testar essa hipótese mais diretamente. Como o código neural ainda não foi resolvido, conduzindo o aprendizado para guiar um comportamento complexo ao substituir a experiência por introduzida artificialmente, mudanças específicas nos pesos sinápticos podem não estar no horizonte imediato, embora passos significativos nesta direção tenham sido dados recentemente [126]. Outras abordagens ainda podem ser frutíferas: as tecnologias optogenéticas e farmacogenéticas recentemente desenvolvidas podem ser usadas para alvejar sinapses com composições moleculares e estruturais distintas e, quando usadas em combinação com truques moleculares, são provavelmente uma forma particularmente poderosa de investigar se diferentes tipos de sinapses desempenham papéis computacionais distintos. Essas manipulações agudas já revelaram novas informações sobre a função hipocampal que difere do que havia sido sugerido por estudos de lesões farmacológicas [127]. Além disso, dados os avanços tecnológicos em dispositivos de gravação sem fio, será importante registrar as respostas pós-sinápticas na Vivo durante o comportamento para fornecer uma leitura das manipulações feitas. Essas gravações também mostram a extensão do enfraquecimento sináptico em tarefas de reversão. Em termos da hipótese de seletividade de subunidade, a evidência atual sugere que a extensão em que cada subunidade está envolvida na plasticidade é afetada pelo protocolo de indução usado devido à sua cinética distinta. Portanto, para entender a importância de GluN2A e GluN2B nas condições fisiológicas e em relação ao aprendizado e memória, a ênfase deve ser colocada na investigação dos padrões naturais de atividade que ocorrem durante o comportamento e que conduzem a mudanças duradouras na força sináptica.

No entanto, deve ser lembrado que NMDARs não desempenham apenas um papel na plasticidade, mas também nos componentes de resposta lenta ou tônica da atividade neural, por exemplo, eles mostraram apoiar respostas lentas no tálamo e sintonia sensorial no neocórtex. Além disso, NMDARs podem nem mesmo ser necessários para certas formas de aprendizagem, recentemente foi demonstrado que camundongos com nocaute NMDAR na DG e CA1 dorsal ainda podem realizar tarefas tipicamente consideradas dependentes de NMDAR, por exemplo, MWM [121] . Isso não significa que, em circunstâncias normais, os NMDARs não estejam envolvidos neste tipo de aprendizagem, pois outros mecanismos ou regiões do hipocampo podem assumir o controle após a exclusão prolongada. No entanto, será importante investigar se os NMDARs em todas as sinapses do hipocampo estão envolvidos na aprendizagem e na memória ou, alternativamente, se apenas um subconjunto está, enquanto o resto dos NMDARs do hipocampo realizam cálculos semelhantes aos do neocórtex sensorial. A assimetria hipocampal relatada em humanos [128] e, mais recentemente, no camundongo [69,94,96], torna possível que o hipocampo consista em redes paralelas, sendo uma delas principalmente uma rede de resposta envolvida na codificação sensorial e navegação, enquanto o outro apóia a aprendizagem de associações. Apesar dos enormes avanços em nossa compreensão da função hipocampal, parece que ainda há muito mais a descobrir.


RESULTADOS

Estratégia de design para descoberta de aptâmero visando a conformação de canal aberto de receptores AMPA

Neste trabalho, optamos por usar o GluA2Qvirar O receptor AMPA como o alvo da seleção in vitro (Procedimentos Experimentais e Figura S1, Informações de Apoio). GluA2 é uma das quatro subunidades do receptor AMPA e pode formar um canal homomérico funcional por si só, como qualquer outra subunidade do receptor AMPA (9). GluA2 é considerada uma subunidade chave que medeia a excitotoxicidade (25). A isoforma & # x0201cflip & # x0201d de GluA2Q ou GluA2Qvirar, gerado por splicing alternativo, é conhecido por dessensibilizar menos rapidamente do que a isoforma & # x0201cflop & # x0201d (5, 26). A isoforma editada ou Q (isto é, glutamina no local de edição de glutamina / arginina ou Q / R) é permeável ao cálcio, enquanto a isoforma R não é (27). Uma expressão anormal da isoforma Q de GluA2 está ligada a distúrbios neurológicos como ALS (28).

Para tornar praticamente possível aplicar uma abordagem de evolução in vitro para identificar aptâmeros contra a conformação de canal aberto de receptores AMPA, projetamos especificamente os seguintes experimentos. Primeiro, usamos uma concentração de agonista saturante para & # x0201ctitrate & # x0201d a população de receptores para maximizar a fração da conformação de canal aberto de GluA2Qvirar. Em outras palavras, queríamos apresentar especificamente a conformação de canal aberto de GluA2Qvirar como o alvo da seleção na expectativa de encontrar aptâmeros que reconheceriam especificamente a conformação de canal aberto. Em segundo lugar, a conformação de canal aberto dura não mais do que um milissegundo ou mais (dependendo da concentração de glutamato) após a ligação do glutamato (5), enquanto a reação de ligação entre o receptor e a biblioteca de RNA requer pelo menos 30 minutos para ser concluída (19) ( Procedimentos Experimentais e Figura S1, Informações de Apoio). Assim, tivemos que & # x0201ctrap & # x0201d a conformação de canal aberto por tempo suficiente para a reação de ligação. Para isso, decidimos escolher o cainato como agonista. O cainato é capaz de produzir uma resposta de corrente não dessensibilizante com GluA2 após o cainato se ligar a ele, indicativo de uma existência persistente da conformação de canal aberto (29). Experimentalmente, pré-incubamos a membrana celular contendo o GluA2Qvirar receptor com cainato 1 mM (isto é, esta era uma concentração de saturação). Terceiro, usamos um inibidor não competitivo, ou seja, GYKI 47409, para eluir RNAs putativos que podem se ligar ao mesmo local ou locais mutuamente exclusivos (Figura S1, Informações de Apoio). GYKI 47409 é um derivado de 2,3-benzodiazepina e tem uma constante de inibição (Keu) do

3 & # x003bcM para a conformação de canal aberto de GluA2Qvirar ou

Afinidade 2 vezes maior do que para a conformação de canal fechado (Pei e Niu, dados não publicados). O projeto geral de nossos experimentos foi identificar especificamente um aptâmero que visava a conformação de canal aberto por sua ligação a um site não competitivo.

Identificação de um aptâmero de RNA que inibe os receptores AMAP

O GluA2Qvirar canais foram transitoriamente expressos em células HEK-293S, e os fragmentos de membrana que abrigam todos os receptores funcionais foram usados ​​para seleção in vitro (19). Para suprimir o enriquecimento potencialmente perigoso de RNAs não específicos ligados a quaisquer outros & # x0201ctargets & # x0201d, como lipídios, também realizamos a seleção negativa como nas rodadas 5, 10 e 13, em um total de 14 ciclos de seleção, nos quais HEK simples Membrana celular -293 faltando apenas o GluA2Qvirar receptores foi usado para absorver esses RNAs não específicos. Em contraste, as rodadas de seleção positiva envolveram o uso de GYKI 47409, como mencionado antes, para eluir RNAs potencialmente úteis. Os RNAs eluídos foram amplificados por RT-PCR e uma biblioteca de RNA enriquecida foi então transcrita para uma nova rodada de seleção (Figura S1, Informações de Apoio). Após 14 ciclos, identificamos algumas sequências enriquecidas (Figura 1A). Uma sequência enriquecida era aquela com pelo menos duas cópias em todo o conjunto de sequências de 83 clones (isto é, 43 clones da 12ª rodada e 40 clones da 14ª rodada). A propriedade inibitória putativa dessas sequências enriquecidas foi então testada funcionalmente pelo uso de registro de corrente de célula inteira com GluA2Qvirar expresso em células HEK-293. Com base nos resultados de gravação de células inteiras (ver traços representativos na Figura 1B) ou a razão das amplitudes atuais na ausência e presença de um aptâmero, A / A (I) (mostrado na coluna direita na Figura 1A), nós concluíram que AG1407, a sequência mais enriquecida, era um dos inibidores mais potentes. Um outro teste de AG1407 na mesma concentração de aptâmero, mas com concentrações crescentes de glutamato, mostrou que AG1407 inibiu a conformação de canal aberto de GluA2Qvirar (Figura S2, Informações de suporte).

Identificação da sequência mínima de aptâmero funcional

Em seguida, truncamos sistematicamente o aptâmero AG1407 a fim de identificar a sequência mínima, mas funcional. Guiados pela previsão da estrutura secundária usando o programa Mfold (30), construímos e testamos funcionalmente versões mais curtas do AG1407 (Figura 2A). Com base no valor A / A (I) (mostrado em vermelho na parte inferior de cada estrutura prevista na Figura 2A), encontramos a versão de 56 nucleotídeos (nt) de AG1407, denominado AG56, era o aptâmero funcional com o mínimo comprimento da sequência. Em contraste, encurtando a junção de três vias, excluindo a sequência UUGUGA (ou seja, o RNA 46 nt) ou removendo a protuberância na posição U50 (ou seja, RNA 45 nt) ou truncando a haste emparelhada de base na primeira haste-loop região (ou seja, 48 nt RNA) (Figura 2A) resultou em RNAs não funcionais. Portanto, esses elementos estruturais são essenciais no dobramento de AG56 como um aptâmero funcional. Consequentemente, usamos AG56 como o aptâmero mínimo para todas as caracterizações funcionais descritas abaixo.

A sequência mínima funcional do aptâmero e a seletividade do subtipo do receptor AMPA. (A) Ao truncar a sequência de AG1407 para identificar a sequência mínima funcional de 56 nt ou AG56, apenas a estrutura secundária mais estável de cada sequência, com a energia livre listada abaixo dessa estrutura, foi considerada, com base na previsão de Mfold . As letras pretas e marrons representam as regiões de sequência constante e variável, respectivamente. Um & # x0201cscissor & # x0201d indica onde uma sequência particular foi cortada e as letras verdes representam os nucleotídeos de corte. A função inibidora, mostrada como valor A / A (I), é listada na parte inferior de cada estrutura truncada. (B) Por ensaio de registro de corrente de célula inteira, AG56 inibiu seletivamente a conformação de canal aberto de todas as subunidades do receptor AMPA (painel esquerdo) (ver explicação adicional e análise estatística na Figura S3, Informações de Apoio). No entanto, AG56 não afetou GluK1Q e GluK2Q, dois canais de receptor de cainato representativos, nem canais de receptor de GluN1A / 2A e GluN1A / 2B NMDA. Para cada um dos tipos de receptores testados, a concentração de glutamato foi escolhida para ser equivalente a

Fração de 95% dos canais abertos. Especificamente, a concentração de glutamato foi de 0,04 mM (para a conformação de canal fechado) / 3 mM (para a conformação de canal aberto) de GluA1virar, 0,1 mM / 3 mM para GluA2Qvirar, GluA3virare GluA4virar, bem como 0,04 mM / 3 mM para GluK1 e GluK2Q.

Caracterização Funcional do Aptâmero AG56 por Gravação de Célula Inteira

AG56 foi funcionalmente caracterizado em uma série de experimentos. Primeiro, como sua sequência predecessora AG1407 (Figura S2, Informações de Apoio), AG56 inibiu seletivamente o canal aberto, mas não o canal fechado, conformação de GluA2Qvirar (Figura 2B, painel esquerdo). Além disso, AG56 inibiu de forma semelhante a conformação de canal aberto de todas as outras subunidades do receptor AMPA, isto é, GluA1, 3 e 4, embora o efeito inibitório de AG56 em GluA4 fosse fraco (Figura 2B painel esquerdo e Figura S3, Informações de Apoio). Ainda, AG56 não teve nenhum efeito inibidor em qualquer uma das conformações de canal fechado (Figura 2B painel esquerdo). AG56 não afetou os canais do receptor de cainato (ou seja, GluK1 e GluK2) ou os canais do receptor NMDA (ou seja, GluN1A / 2A e GluN1A / 2B) (Figura 2B painel direito). Deve-se notar que GluN1A / 2A e GluN1A / 2B são dois complexos de receptor NMDA dominantes in vivo (31) e nem GluN1A nem GluN2A ou GluN2B podem formar um canal funcional por si só (32). Estes resultados sugerem, portanto, que AG56 é um inibidor seletivo do subtipo de receptor AMPA ao direcionar as conformações de canal aberto, e AG56 não tem qualquer atividade cruzada indesejada contra outros subtipos de receptor de glutamato.

Mecanismo de inibição de AG56 em GluA2Qvirar: Estudos de ligação homóloga

Elucidamos ainda mais o mecanismo de ação do AG56 no GluA2Qvirar canal receptor expresso em células HEK-293. Neste estudo, primeiro determinamos a constante de inibição de AG56 como sendo 0,95 & # x000b1 0,20 & # x003bcM (a linha sólida na Figura 3A) para a conformação de canal aberto de GluA2Qvirar na concentração de glutamato de 3 mM, onde quase todos os canais estavam na conformação de canal aberto (isso ocorreu porque o CE50 valor de GluA2Qvirar com glutamato foi de 1,3 mM e a probabilidade de abertura de canal de GluA2Qvirar estava perto da unidade (21)). Em contraste, AG56 não inibiu a conformação de canal fechado de GluA2Qvirar, conforme verificado por uma série de concentrações de aptâmero (Figura 3A), mas na concentração de glutamato de 100 & # x003bcM, onde a maioria dos receptores estava na conformação de canal fechado (21). Este resultado poderia ser explicado por um mecanismo não competitivo pelo qual AG56 se ligou a um local regulatório ou local não competitivo, e tal local era acessível tanto do canal fechado quanto do canal aberto, estados ou conformações, mas apenas a interação do aptâmero com o a conformação em canal aberto resultou em inibição. Alternativamente, este resultado poderia ser explicado por um mecanismo não competitivo, como um modelo de bloqueio de canal aberto, pelo qual AG56 inibiria apenas a conformação de canal aberto, porque o local não competitivo seria acessível apenas através da conformação de canal aberto (33) (veja os dois mecanismos no Apêndice). Para diferenciar esses dois mecanismos, primeiro realizamos um ensaio de ligação de competição homóloga (20) e descobrimos que AG56 não apenas se ligou à conformação de canal fechado (ou seja, a forma de receptor de canal fechado não ligado), mas o fez com uma afinidade, ou seja, Kd = 68 & # x000b1 40 nM (Figura 3B painel esquerdo) semelhante àquele para a conformação de canal aberto, ou seja, Kd = 80 & # x000b1 23 nM (Figura 3B painel direito). Este resultado foi consistente com um mecanismo não competitivo, baseado no fato de que AG56 se ligou à conformação de canal fechado, além de sua ligação à conformação de canal aberto. Este resultado, no entanto, foi inconsistente com o mecanismo não competitivo.

Caracterização da constante de inibição, afinidade de ligação e mecanismo de ação de AG56 com GluA2Qvirar expresso em células HEK-293. (A) Por ensaio de registro de corrente de célula inteira, AG56 inibiu a conformação de canal aberto (medido a 3 mM de concentração de glutamato), mas não a conformação de canal fechado (medido a 0,1 mM de concentração de glutamato) de GluA2Qvirar (a linha pontilhada indica nenhuma inibição ou A / A (I) = 1). A constante de inibição, Keu, para a conformação de canal aberto de GluA2Qvirar por AG56 foi determinado ser 0,95 & # x000b1 0,20 & # x003bcM (isto é, a linha contínua superior). (B) A ligação de competição homóloga de AG56 a GluA2Qvirar o receptor foi plotado tanto para a forma de canal fechado não ligada (círculo sólido) quanto para a forma de canal aberto (círculo oco). A constante de ligação, Kd, de AG56 para as formas de canal fechado (painel esquerdo) e canal aberto (painel direito) de GluA2Qvirar foi determinado ser 68 & # x000b1 40 nM e 80 & # x000b1 23 nM, respectivamente, com base em conjuntos de dados triplicados. A constante de ligação foi calculada usando eq. 1 em Procedimentos Experimentais. (C) A medição de fotólise de pulso de laser do efeito de AG56 na constante de taxa de fechamento de canal ou kcl (painel esquerdo) e constante de taxa de abertura de canal ou kop (painel do meio) com GluA2Qvirar expresso em células HEK-293. Especificamente, a 100 & # x003bcM concentração de glutamato liberado fotoliticamente, o kobs valor, que refletiu kcl, diminuiu de 2.200 s & # x022121 (controle ou & # x022120.5 & # x003bcM AG56, traço preto, painel esquerdo) para 1.600 s & # x022121 (+0,5 & # x003bcM AG56, traço vermelho, painel esquerdo). Na concentração de glutamato liberado fotoliticamente em 340 & # x003bcM, o kobs valor, que refletiu kop (painel do meio), foi de 5.128 s & # x022121 e 4.405 s & # x022121 na ausência e presença de 0,5 & # x003bcM AG56. A diferença, entretanto, ou & # x00394kobs = kobs & # x02013 kobs& # x02019 = & # x00394kcl era invariante mesmo quando a concentração de glutamato aumentou (painel direito). Aqui & # x00394kcl = kcl & # x02013 kcl& # x02019 onde kcl& # x02019 é o inibido kcl valor e o kcl é a constante de taxa de fechamento de canal sem AG56 (veja equ. 9 no Apêndice). Cada ponto de dados representa pelo menos uma medição de uma única célula onde kobs é a constante de taxa de controle e kobs& # x02019 é a constante de taxa na presença de 0,5 & # x003bcM AG56.

Mecanismo de inibição de AG56 em GluA2Qvirar: Uma medição de fotólise de pulso de laser do efeito de AG56 no processo de taxa de abertura de canal

Nós ainda caracterizamos o mecanismo de inibição de AG56 no processo cinético de abertura de canal de GluA2Qvirar. Usando uma técnica de fotólise de pulso de laser, juntamente com um precursor fotolábil de glutamato ou glutamato enjaulado, que forneceu uma resolução de tempo de

30 microssegundos (22), medimos especificamente o efeito de AG56 em ambos os canais de fechamento (kcl) e a abertura do canal (kop) constantes de taxa (23) (Figura 3C painéis esquerdo e do meio, respectivamente). Este experimento nos permitiu acompanhar simultaneamente não apenas a taxa de abertura do canal, mas também a amplitude da corrente, antes da dessensibilização do canal (23) (Figura 3C, painéis esquerdo e do meio). A magnitude de kcl reflete o tempo de vida (& # x003c4) do canal aberto (ou seja, & # x003c4 = 1 /kcl) e o efeito de um inibidor sobre kcl assim, revela se inibe ou não a conformação de canal aberto (23). Em contraste, kop reflete a conformação do canal fechado e o efeito sobre kop revela se o inibidor inibe a conformação de canal fechado (23) (consulte as equações de taxa e o tratamento quantitativo dos dados de taxa no Apêndice). Experimentalmente, a uma baixa concentração de glutamato (ou seja, 100 & # x003bcM de glutamato liberado fotoliticamente), onde kcl foi medido (23), o AG56 inibiu a taxa de fechamento do canal, consistente com um mecanismo não competitivo pelo qual inibiu a conformação do canal aberto. Ainda, AG56 não afetou a amplitude da corrente (Figura 3C painel esquerdo). Isso não foi surpreendente porque a amplitude observada nesta baixa concentração de glutamato (ou seja, 100 & # x003bcM glutamato liberado fotoliticamente) foi dominada pela população de receptores de canal fechado (observe que isso foi consistente com a medição de amplitude mostrada como a linha tracejada vermelha na Figura 3A).

No entanto, quando a concentração de glutamato aumentou e kop tornou-se mensurável (23) (ver Apêndice), AG56 não inibiu kop (Figura 3C painéis do meio e direito).Este resultado sugeriu que a inibição da taxa por AG56 poderia ser completamente atribuída à inibição de kcl por AG56 de modo que a diferença entre a constante de taxa observada de abertura do canal ou & # x00394kobs na ausência e presença de AG56 na mesma concentração de AG56 era invariante, apesar do aumento da concentração de glutamato (Figura 3C, painel direito, e ver o tratamento mecanístico dos dados de taxa, especificamente equ. 9, no Apêndice). Em outras palavras, o fato de & # x00394kobs permaneceu o mesmo (ou & # x00394kobs = constante), verificada em uma série de concentrações crescentes de glutamato, foi inteiramente consistente com a previsão por equ. 9 (consulte a explicação adicional sobre a equação 9 no Apêndice). A falta de um efeito inibidor de AG56 sobre kop (Figura 3C painéis do meio e direito) demonstrou ainda que AG56 não inibiu a conformação de canal fechado.

Por outro lado, AG56 reduziu a amplitude da corrente em uma concentração de glutamato mais alta (veja a diferença nas amplitudes da corrente de pico entre os traços vermelho e azul no painel central da Figura 3C e veja um traço adicional na Figura S4, Informações de Apoio, para uma corrente mais alta inibição da amplitude em uma concentração mais elevada de glutamato e inibidor). Novamente, isso era esperado porque a amplitude da corrente em uma concentração de glutamato mais alta começou a refletir mais na população de receptores de canal aberto. Além disso, o efeito de AG56 na amplitude da corrente da medição da taxa (Figura 3C, painel do meio e Figura S4, Informações de Apoio) foi totalmente consistente com a medição da amplitude usando um método de fluxo de solução rápido (Figura 3A). Tomados em conjunto, os resultados da avaliação do local de ligação / afinidade (Figura 3B) e a caracterização cinética química do efeito de AG56 em ambos kcl e kop (Figura 3C), bem como a medição de amplitude (Figura 3A) são consistentes apenas com AG56 sendo um inibidor não competitivo seletivo para a conformação do receptor de canal aberto. Por outro lado, um modo de ação não competitivo é inconsistente com nossos dados, ou seja, AG56 só se ligaria à conformação de canal aberto, mas não à conformação de canal fechado. Um modo de ação competitivo também é inconsistente com nossos dados, ou seja, AG56 só seria eficaz como um inibidor em uma concentração de ligante baixa e inibiria kop, mas não kcl.


7. Papéis fisiológicos e patológicos do CB1R

Dada a ampla distribuição de CB1Rs no corpo humano, é razoável especular um amplo espectro de papéis fisiológicos do CB1R [3,9,63,126]. De fato, o CB1R e o sistema endocanabinoide estão amplamente envolvidos em vários aspectos das atividades e distúrbios neurais centrais, incluindo apetite, aprendizado e memória, ansiedade, depressão, esquizofrenia, acidente vascular cerebral, esclerose múltipla, neurodegeneração, epilepsia e vício [3,9,126,127] . O CB1R também está envolvido em condições fisiológicas e patológicas no SNP e tecidos periféricos, incluindo dor, metabolismo energético, funções cardiovasculares e reprodutivas, inflamação, glaucoma, câncer e distúrbios hepáticos e musculoesqueléticos [63]. A expressão de CB1R flutua notavelmente em muitas condições patológicas, ressaltando seu papel crítico em um amplo espectro de atividades biológicas [69]. Curiosamente, em alguns casos, foram relatadas alterações positivas e negativas na expressão e funcionalidade do CB1R [69]. Além disso, a administração de agonistas CB1R exerce efeitos bifásicos em várias condições [128]. Por outro lado, a presença generalizada do CB1R limita a aplicação terapêutica dos ligantes CB1R devido a vários efeitos colaterais. Esses fatos enfatizam a importância de compreender e manipular o sistema endocanabinoide de uma maneira específica para a condição.

Foi descoberto que o CB1R inibe a liberação de GABA e glutamato dos terminais pré-sinápticos, o que confere ao CB1R a capacidade de modular a neurotransmissão [60,129]. Isso foi proposto como um mecanismo subjacente plausível de neuroproteção mediada por CB1R contra a excitotoxicidade, um processo patológico proeminente de muitos distúrbios neurológicos, incluindo epilepsia e doenças neurodegenerativas [34,130,131]. Até o momento, vários estudos mostraram que o CB1R desempenha um papel neuroprotetor contra a excitotoxicidade induzida por vários estímulos [131,132,133,134]. Foi demonstrado recentemente que no cérebro de camundongos, o efeito neuroprotetor exercido pelo CB1R contra a excitotoxicidade é restrito à população CB1R localizada nos terminais glutamatérgicos [130]. Além dos efeitos inibitórios proeminentes no influxo de Ca 2+ e na liberação de glutamato, a neuroproteção mediada por CB1R também envolve a inibição da produção de óxido nítrico (NO), redução da mobilização de zinco e aumento da expressão de BDNF [134,135,136]. Estudos recentes têm implicado uma interação física direta entre CB1Rs e NMDARs na presença da proteína 1 de ligação a nucleotídeos da tríade de histidina, que permite que os CB1Rs regulem negativamente a atividade NMDAR e protege as células neurais da excitotoxicidade [136,137].

Especificamente, a expressão alterada do CB1R e outros elementos do sistema endocanabinoide foram observados em várias doenças neurodegenerativas, como doença de Alzheimer & # x02019s (AD), doença de Parkinson & # x02019s (PD) e doença de Huntington & # x02019s (HD) [3] . A suprarregulação da atividade do CB1R e do sistema endocanabinoide foi observada nos gânglios da base de modelos experimentais de DP, o que poderia ser um mecanismo para compensar os neurônios dopaminérgicos degenerados da substância negra, ou um processo patológico que contribui para o agravamento da doença [138]. Curiosamente, a diminuição da atividade do sistema endocanabinoide também foi relatada em modelos de DP [128]. Além disso, tanto os inibidores FAAH quanto os antagonistas CB1R mostraram aliviar os sintomas motores em modelos de DP [128]. Da mesma forma, embora as mudanças na expressão de CB1R em pacientes com DA ou modelos animais ainda sejam controversas, a ativação do CB1R demonstrou prevenir a neurotoxicidade induzida por amilóide & # x003b2 em vários modelos de células [139,140,141,142,143,144]. Além disso, foi relatado que a ativação do CB1R é benéfica em modelos animais com DA com déficits de memória e distúrbios cognitivos [145,146,147]. Por outro lado, estudos têm enfatizado os potenciais benéficos do CB1R na patogênese da DH. Em 1993, a diminuição da expressão do CB1R foi relatada pela primeira vez na substância negra de pacientes em HD por meio de autorradiografia [148]. Outros estudos revelaram uma perda progressiva de CB1Rs como um sinal precoce de DH, que ocorreu antes do início da neurodegeneração real e acelerou o agravamento da DH [149]. Esta observação foi confirmada no nível do mRNA, bem como com a imunorreatividade CB1R em vários modelos de camundongos transgênicos HD (revisado em [3]). Um estudo recente descreveu a regulação negativa do CB1R não apenas em neurônios de projeção espinhosos médios (MSNs), mas também em uma subpopulação de interneurônios que são seletivamente preservados em camundongos transgênicos e pacientes em HD [150]. A perda tardia de CB1Rs em camundongos transgênicos HD R6 / 1 foi observada em ambiente enriquecido, acompanhada por início tardio de distúrbios motores e progressão da doença [151]. Além disso, em camundongos transgênicos HD R6 / 2, o nocaute de CB1R leva à piora do desempenho motor, aumento da suscetibilidade ao ácido 3-nitropropiônico e atrofia estriatal exacerbada e agregados de Huntingtin (Htt) [133,152]. O aumento seletivo na expressão de CB1R em MSNs melhora a sobrevivência dos neurônios de projeção excitatória, mas não promove o desempenho motor de camundongos transgênicos HD R6 / 2 [153]. Foi relatado que a administração de THC melhora distúrbios motores, atrofia estriatal e agregados Htt em camundongos transgênicos, embora haja controvérsia [133,154]. A ativação do CB1R inibe a liberação de glutamato enquanto aumenta a liberação de BDNF dos terminais pré-sinápticos em camundongos [131]. Investigações adicionais em modelos de células HD revelaram que a ativação do CB1R pode proteger as células do estriado contra a excitotoxicidade por meio do aumento da expressão de BDNF por meio da via PI3K / Akt [133]. Estas observações suportam um papel crítico e possivelmente benéfico do CB1R em doenças neurodegenerativas.

O registro histórico dos efeitos antiepilépticos do CB1R data de séculos [1]. Relatos de casos sobre os efeitos benéficos dos canabinóides em pacientes epilépticos tornaram-se disponíveis somente após a identificação do THC [155,156]. No entanto, estudos também sugeriram aumento da frequência de convulsões após fumar maconha [157]. Este efeito paradoxal dos canabinóides na epilepsia não é visto apenas em estudos humanos, mas também foi relatado em modelos animais [158,159]. A ativação do CB1R por AEA demonstrou inibir convulsões induzidas por eletrochoque em ratos [159]. Por outro lado, a ativação do CB1R em camundongos knockout para FAAH apresenta maior suscetibilidade a convulsões induzidas por ácido caínico [158]. A alteração do sistema endocanabinóide após a epilepsia é específica do tipo celular. Este conceito é apoiado por estudos anteriores em animais que mostram que a sinalização retrógrada de CB1R é seletivamente aumentada em sinapses inibitórias, mas não excitatórias, resultando em uma potenciação persistente de DSI, mas não de DSE em convulsões febris, o que leva à hiperexcitabilidade dos neurônios, contribuindo assim para a exacerbação de convulsões [160,161]. Além disso, essa supressão aumentada mediada por CB1R de neurônios inibitórios também depende da fase. Os tecidos do hipocampo de pacientes epilépticos na fase aguda da epilepsia exibem densidade diminuída de CB1R, especialmente no giro denteado, enquanto em pacientes na fase crônica de epilepsia, foi observada uma regulação positiva de CB1R [162,163,164,165].

Apesar da baixa expressão de CB1R no hipotálamo, os canabinóides são conhecidos por seus efeitos para estimular o apetite, principalmente de uma maneira dependente de CB1R [166]. Os níveis de endocanabinóides aumentam no hipotálamo do rato durante o jejum e voltam aos níveis normais após o consumo de alimentos [167]. A estimulação do apetite e do comportamento alimentar é observada após a injeção direta de endocanabinóides e é abolida pela administração de antagonistas CB1R [167]. Além disso, a ativação dos CB1Rs do estriado ventral inibe os neurônios GABAérgicos, resultando em um efeito hipofágico, mas não orexinérgico [168]. Um estudo recente demonstrou que o comportamento alimentar induzido por CB1R é promovido pela ativação de neurônios POMC hipotalâmicos [81]. Além do hipotálamo, foi proposto que o processo olfatório esteja envolvido na regulação positiva da ingestão alimentar mediada por CB1R [169]. Além disso, a interferência entre CB1Rs e os hormônios importantes envolvidos na regulação do apetite, incluindo grelina, leptina e orexina, foi amplamente relatada [68,166]. Os CB1Rs expressos no trato GI também estão envolvidos no processo metabólico e no balanço energético, conforme discutido na seção anterior. Esses estudos sugerem que a regulação do apetite mediada pelo CB1R envolve pelo menos dois aspectos: por meio da regulação da região do SNC relacionada ao apetite e por meio da modulação de hormônios metabólicos e funções digestivas no local. O rimonabanto, um antagonista do CB1R, exibiu notáveis ​​efeitos anti-obesidade, embora os efeitos colaterais psiquiátricos que o acompanham levem à sua retirada do mercado [170]. Uma revisão atualizada por Koch resumiu o progresso recente na elucidação do papel do CB1R no controle do apetite [171].

A regulação da dor é uma das primeiras aplicações médicas dos canabinóides [1,2]. Numerosos estudos documentaram os efeitos analgésicos dos canabinóides em diferentes tipos de dor, incluindo dor química, mecânica e de calor, bem como dor neuropática, inflamatória e oncológica [172,173]. O sistema endocanabinóide também está envolvido na regulação da nocicepção [3]. Um artigo de revisão publicado recentemente discutiu os estudos pré-clínicos e clínicos sobre o papel dos endocanabinóides no controle da dor inflamatória e neuropática em detalhes [173]. Além do CB1R, também há evidências que apóiam o envolvimento do CB2R e do TRPV1 na regulação da dor mediada por canabinoides [174,175]. Além disso, os fitocanabinóides têm chamado muita atenção atualmente no campo da antinocicepção e outros distúrbios neurológicos. O CBD, por exemplo, demonstrou modular a dor crônica em vários estudos [173]. O medicamento com o nome comercial Sativex, contendo quantidade igual de THC e CBD, é usado para tratar vários tipos de sintomas associados à esclerose múltipla, incluindo dor crônica [176]. Apesar do CBD ter afinidade desprezível para o CB1R e CB2R, estudos recentes sugeriram que seja um modulador alostérico e um antagonista indireto dos CBRs, com capacidade de potencializar o efeito do THC [177].

Os canabinóides usados ​​no câncer são mais conhecidos por seus efeitos paliativos, incluindo redução de náuseas e vômitos, alívio da dor do câncer e estimulação do apetite [178,179]. Tem sido argumentado que os canabinóides podem exercer efeitos antitumorais diretamente através da inibição da proliferação celular e indução da apoptose, ou indiretamente através da inibição da angiogênese, invasão e metástase [180]. Numerosos estudos usando sintéticos / endo- / fito-canabinóides e reguladores do sistema endocanabinóide em várias linhas de células cancerosas apoiam esta noção [181]. Os efeitos antitumorais dos canabinóides também foram observados em vários modelos de tumores animais [180]. Em geral, um sistema endocanabinoide aprimorado é visto em tecidos tumorais [179,182,183]. No entanto, o papel da atividade do sistema endocanabinoide regulado positivamente ainda é controverso, visto que resultados contrastantes foram relatados apoiando um papel proliferativo e também antiproliferativo dos canabinoides em células cancerosas [180,181]. Curiosamente, um efeito bimodal dos canabinóides no crescimento das células cancerosas também foi observado, com baixas concentrações sendo proliferativas e altas concentrações sendo pró-apoptóticas [184].


Organização, controle e função dos receptores extra-sinápticos NMDA

NOs receptores de -metil d-aspartato (NMDARs) existem em diferentes formas devido a múltiplas combinações de subunidades que podem se reunir em um receptor funcional. Além disso, eles estão localizados não apenas nas sinapses, mas também em locais extra-sinápticos. Tem havido intensa especulação na última década sobre se os subtipos e / ou localizações específicas de NMDAR são responsáveis ​​por induzir a plasticidade sináptica e excitotoxicidade. Aqui, revisamos as últimas descobertas sobre a organização, composição de subunidades e controle endógeno de NMDARs em locais extra-sinápticos e consideramos suas funções putativas. Como os astrócitos são capazes de controlar NMDARs por meio da liberação de gliotransmissores, também discutimos o papel do ambiente glial na regulação da atividade desses receptores.

1. Introdução

NReceptores de -metil d -aspartato (NMDARs) há muito tempo são de grande interesse para neurocientistas devido às suas múltiplas implicações na fisiologia neuronal durante o desenvolvimento e a idade adulta. Seguindo a descoberta seminal de plasticidade sináptica de longa duração por Bliss & amp Lomo [1], NMDARs são conhecidos por seu papel chave na potenciação de longo prazo (LTP) e depressão de longo prazo (LTD) da transmissão sináptica [2]. No entanto, como esses canais iônicos controlados pelo glutamato são altamente permeáveis ​​ao cálcio, eles não apenas transmitem um sinal fisiológico para os neurônios, mas também podem desencadear cascatas de sinalização intracelular que podem levar à morte celular. Na verdade, o fenômeno da excitotoxicidade [3] e sua ligação causal com a liberação excessiva de glutamato [4] foram descritos anos antes da existência de plasticidade sináptica ser estabelecida, mas os NMDARs só demonstraram ser a principal fonte de cálcio responsável pela indução de glutamato excitotoxicidade no final dos anos 1980 [5-7]. Desde então, esses receptores são conhecidos por sua dualidade. Eles são receptores essenciais e potencialmente prejudiciais, cuja atividade precisa ser controlada de forma precisa e rigorosa. Tal regulação é alcançada por muitos fatores intracelulares e extracelulares, incluindo parceiros intracelulares, bloqueio de magnésio, moduladores alostéricos endógenos, bem como ligação agonista e co-agonista. Curiosamente, muitas dessas ações regulatórias são altamente sensíveis à composição de subunidades do receptor [8,9]. Junto com o desenvolvimento de antagonistas farmacológicos específicos de subunidade, evidências para papéis específicos de subtipos NMDAR têm se acumulado nas últimas décadas, com particular atenção para os heterodímeros contendo GluN2B [8,9]. Em 1995, como outros canais iônicos controlados por transmissor, NMDARs também foram encontrados em proporções significativas em locais extra-sinápticos [10-13]. As relações entre a localização do receptor, seu conteúdo de GluN2B e seus papéis na direção da plasticidade sináptica e na morte celular foram logo assumidas [14,15]. Isso gerou uma nova mania de NMDARs e lançou as bases para uma compreensão significativa de como esses receptores impactam a fisiologia e patologia celular. Mais recentemente, NMDARs ganharam um novo interesse, como d -serina, um potencial gliotransmissor liberado por astrócitos ([16], mas veja [17]) foi encontrado para agir como um co-agonista endógeno em seu local de ligação à glicina [16] , 18–21]. Essa descoberta tornou a glia um possível regulador da função NMDAR e marcou o surgimento de uma excitante conversa cruzada entre o campo dos NMDARs e o domínio expansivo das células gliais. Nesta revisão, discutimos as últimas descobertas sobre a organização, o controle endógeno e as funções dos NMDARs em locais extra-sinápticos, e qual papel a glia pode desempenhar na atividade desses receptores.

2. Definindo o espaço extra-sináptico

Fazer um delineamento preciso dos espaços sinápticos e extra-sinápticos é desafiador, especialmente quando se tenta reconciliar dados de microscopia e eletrofisiologia. Essa dificuldade decorre do fato de que o que se considera extrassináptico a partir de pistas morfológicas ainda pode fazer parte do espaço sináptico no que diz respeito à transmissão de sinais. Do ponto de vista morfológico, os receptores são frequentemente considerados extra-sinápticos se estiverem a mais de 100 nm de distância da densidade pós-sináptica (PSD) [22,23]. No entanto, esta definição morfológica não leva em consideração o transbordamento de glutamato durante a transmissão sináptica, que provavelmente ativa os receptores localizados no colo das espinhas dendríticas (ou seja, os receptores perissinápticos) ou na haste dendrítica. Do ponto de vista eletrofisiológico, uma convenção de fisiologistas sinápticos define NMDARs sinápticos como aqueles recrutados durante a estimulação aferente em baixa frequência (menos de 0,05 Hz), ou em resposta à liberação espontânea de glutamato produzindo respostas excitatórias em miniatura [24-29]. NMDARs extra-sinápticos correspondem a receptores que não são ativados durante tais condições [24-29].Esta definição eletrofisiológica de NMDARs sinápticos pode encapsular receptores localizados não apenas nas sinapses, mas também em locais peri ou extra-sinápticos que possivelmente contribuem, mesmo que moderadamente, para a transmissão sináptica de baixa frequência. Como é difícil determinar em que extensão o glutamato transborda durante a transmissão sináptica basal, não está claro em que grau a definição morfológica e eletrofisiológica dos espaços sinápticos e extrassinápticos se sobrepõem. Na verdade, o delineamento preciso da fronteira sináptica-extra-sináptica parece específico para o parâmetro que se considera, e é provável que uma definição abrangente dessa fronteira não possa ser encontrada.

3. Organização NMDAR em locais extra-sinápticos

Apesar de algumas observações ocasionais de NMDARs em locais extra-sinápticos [10-13,30-36], o primeiro estudo a investigar direta e extensivamente a organização de NMDARs pós-sinápticos em locais extra-sinápticos foi publicado em 2010 [22]. Curiosamente, parece que NMDARs extra-sinápticos são organizados como clusters, com uma distribuição discreta ao longo da zona perissináptica (45%) e eixo dendrítico (55%) [22]. Em particular, esses aglomerados muitas vezes correspondem à área de contato entre um dendrito e processos celulares adjacentes, incluindo processos gliais (aproximadamente 25%), axonais (aproximadamente 50%) ou dendríticos (aproximadamente 25%). Esses locais extrassinápticos se espalham para uma largura média de menos de 100 nm, o que significa que eles são substancialmente mais estreitos do que os locais sinápticos que têm uma largura estimada de 195 nm na região CA1 [37]. Curiosamente, os clusters extra-sinápticos de NMDAR parecem co-localizar-se com moléculas de adesão intercelular, como β-cateninas e algumas proteínas de arcabouço, como SAP102 e PSD95 em cultura [22], embora não seja claro neste trabalho se algum MAGUK específico está preferencialmente interagindo com NMDARs extra-sinápticos . Essas observações sugerem fortemente que NMDARs extra-sinápticos são agrupados e organizados na membrana plasmática de maneira semelhante aos seus homólogos sinápticos. NMDARs não são distribuídos uniformemente nem aleatoriamente ao longo do eixo dendrítico e provavelmente não são tão livres para se difundir como demonstrado em culturas [38-40]. Isso desafia a ideia comum de que NMDARs extra-sinápticos são essencialmente uma reserva de receptores, esperando para serem recrutados para as sinapses. Na verdade, a descoberta de que esses receptores estão agrupados em áreas de contato celular muito específicas sugere que eles podem servir a uma função de sinalização distinta, independente de seus homólogos sinápticos. O trabalho de Harris & amp Pettit [26] já apoiou esta ideia, demonstrando que NMDARs sinápticos e extra-sinápticos representam pools distintos e estáveis ​​de receptores na superfície dos neurônios CA1 em fatias do hipocampo.

4. GluN2B-NMDARs em locais extra-sinápticos

É geralmente acreditado que os NMDARs extra-sinápticos são enriquecidos em heterodímeros contendo GluN2B (GluN2B-NMDARs). Isso se encaixaria com a ideia de que NMDARs extra-sinápticos constituem uma população distinta, cumprindo uma função específica. Essa ideia também é bastante satisfatória quando se considera que os GluN2B-NMDARs têm maior afinidade pelo glutamato, cuja concentração é menor no espaço extra-sináptico [8,9,41,42]. Finalmente, esta localização de GluN2B-NMDARs também faria sentido em relação à interação de NMDARs com seus parceiros intracelulares. De fato, o domínio C-terminal (CTD) das subunidades GluN2 dita a proteína de arcabouço com a qual o receptor pode interagir e, portanto, influencia fortemente a localização de superfície dos subtipos NMDAR (conforme revisado em grande detalhe em [8,9]). Foi proposto que GluN2A-NMDARs se associem preferencialmente ao PSD95, o que se acredita limitar seu campo de ação ao PSD e aumentar seu tempo de meia-vida antes da reciclagem [38,43-47]. Porque eles tendem a interagir com SAP102 ao invés de PSD95, GluN2B-NMDARs são considerados mais móveis, difundidos e não confinados a sinapses em adultos [45,47]. Na verdade, a expressão das subunidades GluN2A e GluN2B segue de perto a expressão de PSD95 e SAP102, respectivamente, durante o desenvolvimento [47], e as evidências sugerem que (i) GluN2B-NMDARs neonatais são mantidos em sinapses por meio de sua interação com SAP102 durante os estágios iniciais de desenvolvimento (ii) a expressão de PSD95 aumenta ao longo do desenvolvimento pós-natal e compete com SAP102 para inserção no PSD e (iii) isso desloca subunidades SAP102 e GluN2B fora das sinapses, enquanto PSD95 e GluN2A tornam-se predominantes em locais sinápticos [22,45, 48,49]. Junto com o fato de que os neurônios do córtex visual e colículo superior ainda mostram expressão significativa das subunidades SAP102 e GluN2B na idade adulta [45,47], essas observações juntas alimentam fortemente a ideia de que GluN2B-NMDARs existem em locais extra-sinápticos mais abundantemente do que GluN2A- NMDARs, que são encontrados preferencialmente nas sinapses.

No entanto, apenas alguns estudos investigaram funcionalmente esse aspecto em fatias de cérebro, e muitas vezes indiretamente. Harris e Pettit [26], que abordou especificamente essa questão, não encontraram um enriquecimento particular de GluN2B-NMDARs em uma localização extra-sináptica em comparação com as sinapses, na região CA1 do hipocampo de rato, pois identificaram grandes quantidades de GluN2B-NMDARs em ambos Localizações. Em contraste, Fellin et al. [50], que realizou um trabalho pioneiro em NMDARs extra-sinápticos ativados por glutamato derivado da glia, observou um enriquecimento relativo de GluN2B-NMDARs fora das sinapses, em linha com observações semelhantes [51-53]. Infelizmente, esses estudos foram todos realizados em fatias obtidas de roedores jovens (P10-P22), em um momento durante o desenvolvimento quando a mudança de NMDARs contendo a subunidade GluN2A para GluN2A ainda está ocorrendo nas sinapses [9]. Por exemplo, Harris e Pettit descobriram, como esperado, que GluN2B-NMDARs desaparecem das sinapses ao longo do primeiro mês de idade, mas lamentavelmente realizaram a comparação da composição sináptica versus extra-sináptica em animais jovens (P15) [26] e concluíram que não havia diferença no conteúdo GluN2B. Além disso, não se sabe se NMDARs extra-sinápticos também sofrem uma mudança no desenvolvimento de sua composição de subunidades. Portanto, por ter sido conduzido principalmente em fatias de animais imaturos ou em culturas, o estudo da composição das subunidades NMDAR em locais sinápticos e extra-sinápticos tem, até agora, essencialmente conduzido a resultados contraditórios e confusão.

Mesmo quando abordado em roedores adultos, a situação não parece ser mais clara. Em neurônios piramidais CA1 hipocampais de ratos adultos, GluN2B-NMDARs mostraram estar ausentes nas sinapses, mas ainda podiam ser encontrados em locais extra-sinápticos [19]. No entanto, a substituição de GluN2B- por GluN2A-NMDARs em sinapses não é onipresente e completa, e GluN2B-NMDARs ainda representam uma porção importante de NMDARs sinápticos em muitas outras regiões do sistema nervoso central adulto (SNC) [16,54] como revisado em [9]. Portanto, embora seja amplamente aceita, a ideia de que os receptores extra-sinápticos são essencialmente GluN2B-NMDARs, ou são pelo menos enriquecidos em GluN2B-NMDARs em comparação com sua contraparte sináptica, ainda está aberta para debate.

5. Controle agonista de NMDAR em locais extra-sinápticos

Em 1989, a existência de uma corrente tônica mediada por NMDARs foi relatada nos neurônios principais do hipocampo sob despolarização leve [55]. Semelhante ao que é conhecido para correntes tônicas mediadas por GABAR [56], a corrente tônica mediada por NMDAR parece ser permitida por concentrações suficientes de agonista ambiente [42,55] e gerada por receptores localizados fora das sinapses [55,57,58] . De fato, a corrente tônica mediada por NMDAR persiste quando a atividade sináptica é suprimida com tetrodotoxina e, inversamente, a atividade NMDAR sináptica permanece inalterada após os NMDARs mediadores da corrente tônica serem bloqueados com MK801 [58], que estabelece esses receptores como distintos e de alguma forma distantes dos receptores sinápticos . No entanto, a origem do chamado glutamato ambiental que permite tal ativação tônica ainda não está clara e existem poucas evidências para a fonte, além da observação de que é de origem não sináptica [58,59]. Curiosamente, a amplitude da corrente tônica mediada por NMDAR é fortemente aumentada pelo bloqueio da recaptação de glutamato através do transportador de glutamato 1 (GLT1) [58,60], que está predominantemente presente em células gliais e medeia 95% do transporte de glutamato, ou quando fatias são desafiados com toxinas gliais [60]. Além disso, um estudo recente mostrou que a extensão da corrente tônica mediada por NMDAR depende da cobertura glial no núcleo supra-óptico do hipotálamo [60]. Portanto, a atividade dos NMDARs que medeiam a corrente tônica provavelmente depende da regulação do tônus ​​do glutamato extra-sináptico pela glia. O corolário dessas observações é que este subconjunto de NMDARs extra-sinápticos é ativado constitutivamente. No entanto, NMDARs extra-sinápticos também podem ser recrutados experimentalmente por aplicações exógenas de NMDA ou glutamato. Isso indica que existe outra subpopulação de NMDARs extra-sinápticos (mas veja abaixo) que pode ser ativada por liberação fásica "ectópica" de glutamato de locais de zona não ativa. A principal manifestação dessa atividade fásica dos NMDARs extra-sinápticos é lenta (tempo de decaimento da ordem de segundos), pouco frequente (aprox. 0,05 Hz), correntes internas de grande amplitude (centenas de pA), geradas nos neurônios principais da região CA1 do hipocampo [50,51,53] e nas camadas superficiais do corno dorsal [52,61]. Essas correntes, denominadas correntes lentas para dentro (SICs), persistem na ausência de atividade neuronal e / ou sináptica [51] e são completamente suprimidas por inibidores da glia [52]. As evidências apontam para o fato de que tais correntes são causadas pela liberação de glutamato da glia para NMDARs extra-sinápticos [33,41,50,62,63]. No entanto, o caminho exato envolvido neste processo ainda está sob investigação. Foi demonstrado que a frequência e amplitude do SIC aumentam com a ativação de receptores acoplados à proteína G astrocítica (GPCRs) no hipocampo [50,51], como os receptores PAR1 [53]. Concomitantemente, a estimulação do receptor PAR1 nos astrócitos demonstrou recentemente desencadear a liberação de glutamato dependente de cálcio através dos canais Best1 no hipocampo [64-66]. Assim, os SICs podem ser causados ​​pela liberação de glutamato derivado de astrócitos através dos canais Best1 em NMDARs extra-sinápticos, após a ativação de PAR1. Embora esta teoria atraente se encaixe com observações anteriores de que a atividade do cálcio nos astrócitos é necessária para que os SICs ocorram [50,53,61], seria uma contradição flagrante com a ideia de que o carregamento vesicular dos astrócitos é necessário [50]. Além disso, não está claro se a atividade PAR1 endógena pode desencadear SICs sem estimulação experimental exógena. Outras vias podem estar em jogo, envolvendo receptores metabotrópicos de glutamato, receptores de prostaglandina ou outros GPCRs astrocíticos, e dependendo da liberação vesicular [50,51].

Além de sua relevância mecanística, essas observações são interessantes porque abrem a possibilidade de que NMDARs extra-sinápticos podem existir em dois pools funcionalmente distintos: (i) receptores ativados tonicamente, que enfrentam quantidades supralimiares de glutamato e co-agonista, e (ii) extrassináptico silencioso geral NMDARs, que podem ser recrutados de forma aguda pela liberação exógena ou endógena (não sináptica) de glutamato. Se verdadeiro, isso pode significar que a disponibilidade de glutamato não é homogênea fora das sinapses e pode ser regulada espacialmente, dando origem a diferentes subcompartimentos. Outra interpretação, no entanto, poderia ser que as respostas NMDAR extra-sinápticas tônicas e fásicas são mediadas pela mesma população de receptores: a corrente tônica poderia ser realizada por esses receptores sob ocupação parcial de seu local de ligação ao glutamato, e a liberação adicional (isto é, fásica) de glutamato causaria saturação transitória e recrutamento de receptores suplementares. Embora seja puramente especulativo, propomos aqui que pode ser relevante considerar o espaço extra-sináptico, pelo menos do ponto de vista do glutamato, como compreendendo domínios separados em vez de um grande volume homogêneo (figura 1). Compreender as regras que governam a liberação, absorção e difusão do glutamato no espaço extracelular certamente lançaria luz sobre esta situação e sobre o controle e as funções dos NMDARs extra-sinápticos.

Figura 1. Visão simplificada da organização NMDAR em sites extra-sinápticos. Os processos astrocíticos captam glutamato por meio de GLT1 e glicina por GlyT1 enquanto liberam d-serina (d-ser) nas sinapses. O GLT1 astrocítico também reduz a concentração de glutamato perto de NMDARs extra-sinápticos (as concentrações de glutamato no ambiente são representadas em tons de azul: o azul escuro representa as concentrações mais altas de glutamato). Isso poderia permitir a ativação aguda de tais receptores por meio da liberação vesicular (ves.) Ou mediada por Best1 de glutamato pelos astrócitos, após a ativação de GPCRs astrocíticos, causando SICs no neurônio pós-sináptico. Por outro lado, NMDARs extra-sinápticos que não estão próximos aos processos gliais e / ou GLT1 podem enfrentar concentrações supraliminares de glutamato e mediar a corrente tônica. A literatura sugere que NMDARs extra-sinápticos podem interagir com diferentes parceiros intracelulares (SAP102) do que seus homólogos sinápticos (PSD95), mas este aspecto não está completamente claro. Da mesma forma, a contribuição de NMDARs sinápticos versus extra-sinápticos para a excitotoxicidade ainda é controversa. Pelo contrário, parece que NMDARs sinápticos contribuem para LTP, enquanto NMDARs extra-sinápticos e sinápticos são necessários para LTD. A presença de moléculas de adesão (como β-cateninas) é representada. A composição da subunidade NMDAR foi propositalmente omitida para evitar adicionar confusão ao debate (veja o texto principal).

6. Controle co-agonista de NMDARs extra-sinápticos

Conforme demonstrado há mais de 25 anos, os NMDARs têm a propriedade única de exigir não um, mas dois agonistas para serem ativados [67]. A identidade do segundo agonista, denominado co-agonista, era indescritível até recentemente, embora a glicina tenha se mostrado originalmente ligada ao local do co-agonista [67-69]. Na região CA1 do hipocampo de rato adulto, foi demonstrado recentemente que a d-serina é o co-agonista endógeno de NMDARs sinápticos, mas que a glicina bloqueia os NMDARs extra-sinápticos que medeiam a corrente tônica e contribuem para a resposta induzida pela aplicação exógena de NMDA [19]. SICs não foram investigados neste estudo e se NMDARs que medeiam SICs também são bloqueados por glicina ou por d-serina, ainda é desconhecido. Isso é potencialmente de grande interesse, porque não há nenhuma demonstração real de que os SICs são causados ​​pela liberação de glutamato. Em vez disso, os SICs poderiam ser gerados pela liberação de d-serina ou glicina pelos astrócitos, em NMDARs que enfrentam níveis supralimiares de glutamato ambiente. Esta hipótese, que nunca foi considerada, se encaixa com o corpo de dados já disponíveis nos SICs (mas veja abaixo as considerações sobre as concentrações de glicina no espaço extracelular) e explicaria por que o bloqueio dos transportadores de glutamato não necessariamente aumenta a amplitude ou frequência do SIC, como se Os NMDARs mediadores de SIC já enfrentavam níveis saturantes de glutamato [50].

Curiosamente, a diferença no co-agonista usado por NMDARs em locais sinápticos e extra-sinápticos parece basear-se principalmente no fato de que a d-serina é liberada nas sinapses e que a atividade do transportador glial de glicina 1 (GlyT1) impede que a glicina acesse o fenda sináptica [19]. Assim, o delineamento entre o espaço sináptico e extra-sináptico, no que diz respeito ao controle co-agonista dos NMDARs, parece ser definido pela abundância de d-serina e glicina. Não está claro, no entanto, se os domínios delineados pelos co-agonistas correspondem aos domínios definidos pelo transbordamento de glutamato (consulte a seção ‘Definindo o espaço extra-sináptico’).

Ainda mais obscuro é a origem da glicina disponível para NMDARs extra-sinápticos. Em estruturas onde a inervação glicinérgica é abundante, como na retina e na medula espinhal, a glicina que atua como um co-agonista endógeno em NMDARs origina-se de terminais glicinérgicos [70,71]. Nessas preparações, foi demonstrado que a glicina liberada em sinapses inibitórias transborda e se difunde para se ligar a NMDARs remotos. No entanto, no hipocampo adulto, embora a existência de receptores extra-sinápticos de glicina (GlyRs) tenha sido documentada [72,73], a presença de terminais glicinérgicos nunca foi estabelecida. Na verdade, a transmissão inibitória é totalmente abolida pelos antagonistas do receptor GABA naquela estrutura [74], e acredita-se que a expressão de GlyRs funcionais pare após o nascimento [74-76]. No entanto, a microdiálise revelou que as quantidades de glicina livre na Vivo chegam a 10 µM no hipocampo [77,78]. Na Vivo, uma fonte importante de glicina extracelular no SNC pode ser o fluxo sanguíneo. Na verdade, o sangue contém aproximadamente 200 µM de glicina [79] e a glicina é capaz de atravessar a parede endotelial dos capilares por meio de transportadores de glicina [80,81]. Em fatias, no entanto, os vasos sanguíneos são quase todos esvaziados de seu conteúdo inicial, restringindo a fonte de glicina ao próprio parênquima cerebral. Por conterem de 3 a 6 mM de glicina [82], as células gliais podem ser a principal fonte de glicina em fatias cerebrais. Foi demonstrado que o potássio estimula a liberação de glicina pelas células gliais em cultura, por meio de um mecanismo independente de cálcio [83-85]. Além disso, a atividade de GlyT1 pode ser revertida em certas condições, levando a um efluxo de glicina para o espaço extracelular [86,87]. Por exemplo, no cerebelo, se as células gliais de Bergmann forem infundidas com 4 mM de glicina, que é a concentração estimada em astrócitos do hipocampo [82], e submetidas a uma despolarização leve da membrana (aprox. -50 mV), o GlyT1 torna-se responsável por um efluxo de glicina. No hipocampo, outra fonte notável de glicina pode ser os interneurônios GABA. Canção et al. [88] de fato demonstrou na região CA1 que os interneurônios GABA contêm glicina e expressam o transportador de glicina 2 (GlyT2). Eles propuseram que a glicina poderia ser co-liberada com GABA em sinapses inibitórias semelhantes ao que ocorre no tálamo, tronco cerebral, medula espinhal e córtex [89-94].

Independentemente da origem da glicina, na Vivo a microdiálise sugere que a quantidade de glicina disponível para NMDARs extra-sinápticos deve ser alta o suficiente para saturar [77,78], especialmente se esses receptores forem GluN2B = NMDARs (EC50 & lt 1 µM). Em consonância com essa ideia, foi observado que as aplicações exógenas de co-agonista não aumentam a amplitude da corrente tônica mediada por NMDAR [58]. Se for verdade, isso significa que há pouco espaço para mecanismos regulatórios e modulação da atividade NMDAR através do local de ligação do co-agonista em locais extra-sinápticos, mas isso nunca foi abordado para SICs ou qualquer outra manifestação de atividade NMDAR extra-sináptica. Esse aspecto intrigante, portanto, precisa de mais investigação.

7. Papel das correntes lentas para dentro e da corrente tônica na fisiologia e patologia

Os papéis desempenhados pelos NMDARs extra-sinápticos ainda são muito elusivos, principalmente porque ferramentas específicas e confiáveis ​​para investigá-los não existiam até agora. Alguns estudos relataram um papel para NMDARs não sinápticos em várias funções, como inibição extra-sináptica [95] ou compressão de faixa dinâmica [96]. Mas, além de NMDARs pré-sinápticos [97,98], que não são abordados nesta revisão, a maioria dos estudos tem se concentrado nas manifestações da atividade NMDAR extra-sináptica, como correntes tônicas e SICs. É aceito que a corrente tônica mediada por NMDARs extra-sinápticos desempenha um papel na excitabilidade dos neurônios principais e na modulação das entradas dendríticas [99]. Também se torna cada vez mais claro que a corrente tônica mediada por NMDAR pode ser regulada positivamente em condições patológicas, variando do vício em cocaína [100] até a doença de Alzheimer [101]. No entanto, a relevância de tal corrente tônica para a fisiologia neuronal e o impacto de seu distúrbio patológico precisam de mais investigações. Em contraste, os SICs foram bem caracterizados (veja acima) e mostraram ocorrer simultaneamente em neurônios distintos dentro de 100 µm um do outro [51]. Isso se encaixa na ideia de que os SICs são gerados pela liberação de glutamato (ou co-agonista) de astrócitos cujo território anatômico abrange uma área de aproximadamente 50–100 µm de diâmetro. Com base nessas observações, os SICs foram propostos para desempenhar um papel na sincronia neuronal e na excitabilidade da rede [51,52]. No entanto, eles só foram observados em fatias até agora, muitas vezes em condições não fisiológicas (baixo magnésio, bloqueadores de GLT1). Se os SICs representam uma característica importante da sinalização neurônio-glia, isso também ocorre na Vivo, ainda não foi estabelecido, mas vale a pena mencionar que a amplitude do SIC demonstrou ser aumentada em modelos animais de inflamação [61].

8. Potenciação e depressão de longa duração: sobre a importância da composição e / ou localização das subunidades?

Usando abordagens genéticas e farmacológicas, tem havido intensa especulação e muitas demonstrações de que subtipos NMDAR específicos são responsáveis ​​por induzir seletivamente LTP ou LTD [102-107]. Foi proposto que GluN2A-NMDARs desencadeariam preferencialmente LTP, enquanto GluN2B-NMDARs seriam preferencialmente associados com LTD. Esta dicotomia, no entanto, foi significativamente e repetidamente desafiada [106,107] (tabela 1), e a ideia de que um subtipo particular de NMDAR está especificamente envolvido na indução de potenciação ou depressão em sinapses glutamatérgicas parece simplificar demais, conforme revisado em grande detalhe por Paoletti et al. [9]. Isso levanta a questão de saber se a localização NMDAR, ao invés da composição da subunidade, poderia ser o fator determinante para a direção da plasticidade sináptica [117]. Infelizmente, poucos estudos abordaram diretamente esse aspecto. Em vez disso, parece que o papel dos NMDARs sinápticos e extra-sinápticos na plasticidade foram principalmente inferidos dos resultados obtidos sobre o papel da composição da subunidade NMDAR (em particular, GluN2B-NMDARs) em LTP e LTD. No entanto, parece não haver uma relação simples entre a localização celular e a composição das subunidades, em particular nas idades mais utilizadas nesses estudos (aproximadamente P20-P25, consulte a discussão acima). É, portanto, notoriamente perigoso tirar conclusões de trabalhos que estudam o envolvimento de NMDARs extra-sinápticos na plasticidade sináptica (e, de fato, em quaisquer funções específicas) com base em seu perfil farmacológico GluN2B. Ativar ou silenciar NMDARs especificamente sinápticos ou extra-sinápticos, portanto, requer outros tipos de abordagens que não dependem da composição de subunidades. A principal alternativa é o uso do bloqueador de canal aberto MK801, que permite a inativação dos NMDARs recrutados, deixando intactos os receptores silenciosos / não recrutados. Quando combinado com estimulação de baixa frequência de fibras aferentes, este método permite o bloqueio seletivo de NMDARs sinápticos e deixa intacta a maioria de suas contrapartes extra-sinápticas [19,26,27,118,119]. Por outro lado, esta abordagem também permite o bloqueio de NMDARs extra-sinápticos mediando correntes tônicas, enquanto deixa NMDARs sinápticos não estimulados intactos [58]. De qualquer forma, este método apresenta a vantagem de depender apenas do fato de os receptores estarem ativos ou não durante a aplicação do MK801 e, portanto, contornar as advertências associadas ao uso de reagentes seletivos de subunidade ou animais imaturos. Curiosamente, usando essa abordagem, Liu et al. [120] descobriram que a estimulação seletiva de NMDARs extra-sinápticos dispara LTD em neurônios CA1. Alternativamente, foi recentemente demonstrado que os NMDARs sinápticos e extra-sinápticos da porta d-serina e glicina, respectivamente [19]. Aproveitando esta segregação, os autores foram capazes de mostrar em fatias do hipocampo de ratos adultos que os NMDARs sinápticos, mas não extra-sinápticos, são necessários para a indução de LTP, enquanto a ativação de ambos os tipos de receptores é necessária para LTD. Essas descobertas alimentam a ideia, proposta por Rusakov et al. [117], que o que importa na indução LTP e LTD pode ser a localização, ao invés do subtipo, dos NMDARs recrutados.

Tabela 1. Papel dos receptores NMDA sinápticos e extra-sinápticos na excitotoxicidade em cultura de células, fatias de cérebro e na Vivo. Os estudos foram organizados pela data de publicação. OGD, privação de glicose de oxigênio NVP, NVP-AAM077, um antagonista NMDAR com leve preferência por GluN2A-NMDARs DL-TBOA, bloqueador do transportador de glutamato 1 (GLT1) 4-AP, 4-aminopiridina, bloqueador de canais de potássio dependentes de voltagem .

um Katsuki et al., bem como Shleper et al., não investigou especificamente o papel dos NMDARs sinápticos e extra-sinápticos, mas sim o papel dos NMDARs dependentes de d-serina na excitotoxicidade.