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Papilomavírus humano E7 (HR HPV16)

Papilomavírus humano E7 (HR HPV16)


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Portanto, há uma proteína que se liga à proteína viral E7. Quero remover um subdomínio da proteína para ver a qual domínio exato o E7 se liga.

Qual é o procedimento para isso?

Edit: Eu acredito que o vírus é HR HPV16. Preciso conhecer um método / procedimento que me permita excluir / transformar os domínios NLS, CXXC, BAH1 e BAH2 na enzima DNMT1


Teste de HPV e HPV

Os vírus são organismos muito pequenos - a maioria nem mesmo pode ser vista com um microscópio normal. Eles não podem se reproduzir por conta própria. Eles devem entrar em uma célula viva, que se torna o célula hospedeirae “sequestram” a maquinaria da célula para produzir mais vírus.

Vírus diferentes podem entrar no corpo de maneiras diferentes, como:

  • Através das membranas mucosas, como o revestimento interno do nariz ou da boca, o revestimento dos olhos ou os órgãos genitais
  • Por meio do sistema digestivo (como o revestimento do estômago ou intestinos)
  • Através de picadas de insetos, picadas de agulha ou outras fissuras na pele
  • Através da pele intacta

Uma vez dentro do corpo, cada vírus infecta um tipo específico de célula. Por exemplo, os vírus do resfriado e da gripe invadem as células que revestem o trato respiratório (nariz, seios da face, tubos respiratórios e pulmões).


Identificação e caracterização de epítopos de células T citotóxicas humanas agonistas potenciadores do papilomavírus humano tipo 16 (HPV16) E6 / E7

O papilomavírus humano (HPV) está associado à etiologia do carcinoma cervical, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço e vários outros tipos de câncer. As vacinas dirigidas contra partículas semelhantes ao vírus HPV e proteínas de revestimento têm sido extremamente bem-sucedidas na prevenção do câncer cervical por meio da ativação de respostas de anticorpos específicos ao HPV do hospedeiro; no entanto, os cânceres associados ao HPV continuam sendo um grande problema de saúde pública. O desenvolvimento de uma vacina terapêutica exigirá a geração de respostas de células T direcionadas contra proteínas precoces do HPV (E6 / E7) expressas em células tumorais infectadas com HPV. Estudos clínicos usando várias plataformas de vacinas demonstraram que ambas as células T humanas específicas do HPV podem ser geradas e o benefício para o paciente pode ser alcançado. No entanto, nenhuma vacina terapêutica contra o HPV foi aprovada pela Food and Drug Administration até o momento. Um método para aumentar a eficácia potencial de uma vacina terapêutica é a geração de epítopos agonistas. Nós relatamos a primeira descrição de epítopos agonistas de linfócitos T citotóxicos potenciadores para HPV E6 e E7. Enquanto o algoritmo in silico revelou seis epítopos com ligação potencialmente melhorada ao antígeno leucocitário humano-alelo A2 (HLA-A2) -Classe I, 5/6 demonstrou ligação aumentada ao HLA-Classe I em ensaios baseados em células e apenas 3/6 tinha uma maior capacidade de ativar células T específicas de HPV que podem lisar células tumorais que expressam HPV nativo, em comparação com suas contrapartes de epítopo nativo. Estes epítopos agonistas têm potencial para uso em uma variedade de plataformas de vacinas terapêuticas de HPV e para uso em plataformas de células T ou natural killer específicas de HPV.

Palavras-chave: Epítopo agonista CTLs E6 E7 HPV16.

Publicado por Elsevier Ltd.

Declaração de conflito de interesse

Laboratório de Imunologia e Biologia Tumoral, NCI: C

Etubics Corporation: Elizabeth S. Gabitzsch é acionista e funcionária da Etubics e possui opções de ações na empresa. Frank R. Jones é acionista e funcionário da Etubics e possui opções de ações na empresa.


Modelagem da biologia do papilomavírus humano em queratinócitos orofaríngeos

A maioria dos cânceres de cabeça e pescoço positivos para o papilomavírus humano (HPV) surgem nas criptas da tonsila, invaginações profundas na superfície da tonsila que são revestidas com epitélio reticulado infiltrado por células do sistema imunológico. Como nas infecções cervicais por HPV, o HPV16 é o tipo de alto risco mais prevalente nos cânceres orofaríngeos, e uma via de infecção genital-oral é mais provável. No entanto, a história natural da patogênese orofaríngea causada pelo HPV é um enigma, embora haja evidências de que seja diferente da doença cervical. Não se sabe se o vírus estabelece uma infecção produtiva ou abortiva em queratinócitos da cripta tonsilar, ou se infecções virais progridem para câncer através da uma fase neoplásica, como na infecção cervical por HPV. O DNA do HPV é mais freqüentemente encontrado não integrado nos cânceres da orofaringe em comparação com aqueles que surgem no colo do útero, e pode incluir novos epissomas de híbridos de DNA humano de HPV. Aqui, revisamos a compreensão atual da biologia do HPV na orofaringe e discutimos os sistemas baseados em células que estão sendo usados ​​para modelar o ciclo de vida do HPV nos queratinócitos da amígdala e como eles podem ser usados ​​para informar sobre a progressão neoplásica conduzida pelo HPV na orofaringe.

Este artigo faz parte do tema ‘Agentes de câncer silenciosos: modelagem multidisciplinar de oncovírus de DNA humano’.

1. Câncer causado pelo papilomavírus humano na orofaringe

No Reino Unido (Reino Unido), a taxa de incidência padronizada por idade de carcinoma de células escamosas da orofaringe (OPSCC) triplicou em homens e dobrou em mulheres entre 1995-2011 e tendências semelhantes foram relatadas nos Estados Unidos (EUA) e em outras partes do mundo [1,2]. Uma infecção por papilomavírus humano (HPV) é um fator contribuinte significativo para a tendência crescente e está notavelmente associada a cânceres de locais linfoepiteliais na orofaringe, especificamente na tonsila e na base da língua [1,3–6]. Curiosamente, alguns estudos mostraram um nivelamento da prevalência de HPV em tumores após 2002, sugerindo que outros fatores além do HPV podem estar conduzindo o aumento de OPSCC em anos posteriores [1,7]. A carga mundial de OPSCC atribuível ao HPV é estimada em um terço de todos os casos de OPSCC (29.000 casos por ano). Há uma maior incidência de OPSCC HPV-positivo nos países desenvolvidos, em vez de nos países menos desenvolvidos, com a América do Norte e a Europa com o maior número de casos [8]. Descobriu-se que esses cânceres associados a vírus são mais comuns em pacientes jovens (menos de 60 anos) e do sexo masculino, embora estudos mais recentes tenham identificado expansão da população idosa (mais de 70 anos) com doença HPV-positiva [9]. O comportamento sexual medido como número vitalício de parceiros sexuais orais é um fator de risco muito forte para HPV-OPSCC, indicando que uma via genital-oral para infecção oral por HPV é mais provável [2,10,11]. Fumar também pode ter um efeito biológico na história natural da infecção oral por HPV e no desenvolvimento de OPSCC, uma vez que esse comportamento foi relacionado a um aumento na aquisição e / ou persistência da infecção oral por HPV [12-14].

Há muito interesse em pacientes com HPV-OPSCC porque eles têm sobrevida geral aumentada em comparação com aqueles com doença HPV-negativa e, portanto, foi proposto que este grupo de pacientes mais jovens poderia se beneficiar da desintensificação da terapia para reduzir as toxicidades de longo prazo em antecipação da sobrevivência a longo prazo [15,16]. No entanto, dois ensaios clínicos recentes demonstraram que a desintensificação do tratamento em HPV-OPSCC de baixo risco de quimiorradioterapia à base de cisplatina para biorradioterapia com cetuximabe não resultou em toxicidade reduzida e os pacientes desintensificados tiveram sobrevida global reduzida [17,18]. Além disso, apesar da melhor sobrevida dos pacientes com tumores HPV-positivos, há uma minoria significativa de pacientes que respondem mal ao tratamento e têm um prognóstico ruim. Embora a redução da resposta ao tratamento neste grupo de pacientes tenha sido correlacionada com a forte exposição à fumaça de cigarro [15,19], a origem do sub-sítio de orofaringe do tumor determina o desfecho clínico [3]. Assim, os tumores que surgiram dos locais linfoepiteliais da amígdala e da base da língua mostram sobrevida benéfica em comparação com os tumores HPV-negativos nesses locais, mas os pacientes com tumores HPV-positivos originados de locais orofaríngeos fora dos tecidos linfoepiteliais não têm vantagem em desfecho em comparação com cânceres negativos para vírus [3]. No entanto, atualmente não existe uma estratégia amplamente aceita para identificar os pacientes que responderão melhor ao tratamento. No entanto, os tumores HPV-OPSCC com baixo número de linfócitos infiltrantes de tumor (TIL) têm um pior prognóstico, e isso poderia ser usado para prever os pacientes que responderão mal ao tratamento [20].

Os tipos de HPV de alto risco (HR) encontrados nos cânceres cervicais também estão presentes no OPSCC e o HPV16 é o tipo de HR mais prevalente em ambos os tipos de tumor [21]. No entanto, uma proporção muito maior (mais de 80%) de OPSCC são HPV16-positivos em comparação com tumores cervicais nos quais aproximadamente 60% são HPV16-positivos [22]. Além disso, a frequência do HPV18 é muito menor no OPSCC (menos de 2%) do que na doença cervical (10%) e, de fato, o HPV33 é o segundo tipo de HR mais prevalente no OPSCC (3,3%) [21,23]. As razões para o domínio do HPV16 sobre os outros vírus HR em OPSCC não são claras, mas podem refletir a natureza da célula alvo da infecção dentro da amígdala, que pode ser diferente entre o HPV16 e os outros tipos de HPV, diferenças entre os ciclos infecciosos ou interação desses vírus com a resposta imune do hospedeiro. Em relação à última possibilidade, os queratinócitos do prepúcio primários imortalizados pelo HPV16 são sensíveis ao tratamento com fator de necrose tumoral alfa, enquanto as células imortalizadas pelo HPV18 são resistentes a essa citocina inibitória [24]. Isso se deve em parte às diferentes alterações da expressão gênica celular induzidas pelo HPV16 e HPV18, que podem contribuir para as diferenças na história natural da patogênese cervical entre esses dois vírus [25,26]. No entanto, pouco se sabe sobre como a infecção por HPV na amígdala manipula a resposta imune, ou se existem diferenças entre os tipos de HPV neste local anatômico.

A integração cromossômica dos genomas do HPV é uma característica comum dos cânceres cervicais e neste local do corpo está associada a um pior resultado clínico. A integração do DNA viral na maioria das vezes interrompe os genes E1 e E2 e desregula a transcrição do gene do vírus, levando a uma expressão mantida e frequentemente elevada das oncoproteínas E6 e E7 do HPV nos tumores. No entanto, em HPV-OPSCC a forma primária de DNA de HPV é epissomas não integrados e integrantes de DNA viral são menos frequentes do que alguns estudos anteriores indicados, provavelmente devido a uma combinação do uso de diferentes metodologias para detectar epissomas e / ou integrantes, e ambiguidades na interpretação dos dados [27-29]. Como no câncer cervical, a integração do DNA do HPV e a perda de expressão do regulador viral E2 estão associadas a piores resultados clínicos no OPSCC [7,30]. Análises mais recentes em todo o genoma levaram a algumas descobertas intrigantes em relação à estrutura do DNA do HPV em tumores positivos para HPV. Trabalho do laboratório Gillison [31] indicou que a integração do DNA do HPV16 estava ligada à mutagênese por inserção em câncer de cabeça e pescoço e a linhas de células de câncer cervical. Os integrantes virais eram flanqueados por uma miríade de variações estruturais genômicas e tais amplificações e rearranjos estavam presentes em tumores de cabeça e pescoço HPV-positivos. Eles propuseram que essas alterações estruturais ocorreram por meio da replicação direcionada à origem viral de integrantes do HPV16 e por meio de um processo de recombinação e rearranjos estruturais formados por looping e concatemers de sequência hospedeira-viral. Uma terceira forma de DNA do HPV foi proposta por Morgan e colegas para estar presente no OPSCC - um híbrido de DNA humano-HPV extracromossômico circular, no qual o genoma do HPV é um multímero (dímero ou maior), mas algumas das cópias carregam DNA viral deleções e sequências de DNA humano [32]. A estrutura desses híbridos de HPV-DNA humano sugere que, durante a história natural da infecção, o DNA viral foi integrado ao DNA do hospedeiro e, por meio de um mecanismo desconhecido, foi subsequentemente excisado e capaz de se replicar, muito provavelmente de uma maneira dependente de E1-E2 , como um epissoma quimérico HPV-humano [29]. Uma quimera HPV16 humana foi supostamente encontrada em um câncer cervical, então talvez essas estruturas não sejam exclusivas da cabeça e do pescoço [33]. É interessante que esses epissomas quiméricos hospedeiro-vírus foram propostos no estudo Gillison [30] como um intermediário transitório, replicado por amplificação por círculo rolante, que eventualmente formam concatemers integrados com pontos de interrupção vírus-hospedeiro e vírus-vírus idênticos.

A análise recente da paisagem mutacional de HPV-positivos (predominantemente OPSCC) em comparação com carcinomas de células escamosas HPV-negativos (predominantemente cavidade oral) fornece evidências de que a carga de mutação em tumores HPV-positivos é indicativa de enzima de edição de mRNA de apoliproteína B, polipeptídeo catalítico edição de citidina desaminase semelhante a (APOBEC) [34]. Curiosamente, a carga mutacional com tumores HPV-positivos foi semelhante, independentemente do tabagismo, sugerindo que as respostas antivirais inatas mediadas por APOBEC são o principal condutor de mutações genéticas nesses tumores, embora tenha sido claramente demonstrado que o uso do tabaco reduz o tratamento sucesso [15], que poderia refletir um infiltrado imunológico atenuado induzido pela exposição ao tabaco. Além disso, a carga mutacional em tumores HPV-positivos foi significativamente distinta dos tumores HPV-negativos que exibiram uma distribuição de assinatura mutacional mais ampla que reflete o uso pesado de tabaco e álcool. A assinatura mutacional específica de APOBEC de HPV-OPSCC também foi identificada em cânceres cervicais causados ​​por HPV [35] e vários dos genes frequentemente mutados parecem ser identificados de forma consistente em ambos os locais do corpo, incluindo PIK3CA, EP300, PTEN, FBXW7 e TGFBR2. No entanto, vários outros genes comumente mutados no HPV-OPSCC, incluindo ZNF750, FGFR3, CASZ1, CYLD e RIPK4 não foram identificados no câncer cervical [34], indicando que o comportamento biológico do HPV e a história natural da carcinogênese induzida pelo HPV são diferentes em locais anatômicos distintos.

(a) A célula-alvo da infecção pelo papilomavírus humano reside na cripta tonsilar?

A mucosa da base da língua e tonsilas (palatina e lingual) é invaginada e forma criptas revestidas por epitélio reticulado (figura 1). É dentro dessas criptas que os tumores HPV-positivos surgem consistentemente, em contraste com as lesões HPV-negativas que emergem principalmente do epitélio que reveste a superfície da tonsila [3,36]. Ao contrário do epitélio estratificado não queratinizante da superfície da tonsila, que é polarizado e sofre maturação morfológica, o epitélio da cripta é desprovido de uma lâmina basal contínua entre o epitélio e o estroma linfoide subjacente, e sofre diferenciação incompleta [37 , 38]. Os ceratinócitos da cripta têm processos longos e delgados que formam uma rede mediada por desmossomos com espaços intercelulares preenchidos com células linfoides (figura 1). As criptas também são caracterizadas por uma abundante rede de vasos sanguíneos intraepiteliais [39]. A especificidade dos tumores HPV para um sítio anatômico imunologicamente alerta é intrigante [40]. A natureza interrompida deste linfoepitélio pode permitir que o vírus tenha acesso imediato aos queratinócitos basais expostos e como um local imune privilegiado (altos níveis do inibidor de linfócitos PD-L1 são encontrados nas criptas de tonsila, mas não no epitélio da superfície da tonsila [ 41]), o vírus pode escapar da detecção e eliminação imunológica para estabelecer uma infecção persistente. No entanto, a apresentação imune deve ocorrer como a soroconversão HPV16 E6 surge pelo menos 10 anos antes do diagnóstico de OPSCC [42]. Além disso, o resultado clínico favorável desses tumores positivos para vírus foi associado a uma forte resposta imune do hospedeiro com alta frequência de infiltração de TIL e respostas inflamatórias observadas, embora em alguns pacientes um gatilho do PD-1: ponto de verificação PD-L1 possa agir para limitar a capacidade do TIL de eliminar o tumor [20,41].

Figura 1. O epitélio amigdaliano. Esquema da tonsila destacando a diferença no epitélio que reveste a superfície da cripta tonsilar (estratificada escamosa não queratinizada) e a cripta (estratificada reticulada). A região em caixa representa os queratinócitos típicos do epitélio reticulado da cripta, com processos longos e delgados interconectados com células vizinhas por meio de junções desmossomos. Os espaços intercelulares são preenchidos por linfócitos infiltrantes. Veja o texto para detalhes.

A análise do tecido tonsilar não maligno para indicações de infecção por HPV sugere que a infecção por HPV neste local é rara, mesmo quando o epitélio reticulado foi amostrado [43]. Esta descoberta bastante intrigante também pode significar que a infecção por HPV é de natureza focal e limitada a um pequeno número de células na cripta e, portanto, difícil de detectar. Uma vez que o ciclo de vida do HPV depende da maturação epitelial para se completar, a natureza do epitélio escamoso reticulado da cripta pode não ser permissiva para a replicação do HPV. Assim, se a infecção por HPV neste local mais comumente leva a uma infecção abortiva com desregulação da expressão gênica viral precoce, essas células podem estar em alto risco de imortalização e transformação maligna.

Os epitélios escamosos da mucosa em diferentes locais anatômicos que são suscetíveis à infecção por HPV apresentam riscos diferentes de desenvolvimento de câncer. O colo uterino tem uma associação de quase 100% com HR HPV, enquanto em outros locais, incluindo ânus, vagina / vulva e orofaringe, apenas um subconjunto dos tumores está associado ao HPV. Esse risco diferencial entre os locais da mucosa pode ser explicado pela natureza da célula-alvo da infecção pelo HPV, que influencia o desfecho da doença. No colo uterino, uma pequena e discreta população de células cuboidais não estratificadas de origem embrionária na zona de transformação metaplásica na junção escamocolunar (JEC) são altamente suscetíveis à infecção por HPV e da qual surge a maioria das neoplasias [44]. As células SCJ têm um perfil de expressão embrionário específico e esse perfil de expressão também é expresso em neoplasias cervicais [45]. Essas células podem fornecer um ambiente que é inibitório / abortivo para o ciclo de replicação normal do vírus, levando à expressão desregulada da oncoproteína do HPV, além de ser um local de imunidade adaptativa alterada para permitir a persistência viral [46]. Embora uma população similarmente única de células seja encontrada no SCJ entre o esôfago e o epitélio gástrico (e poderia ser a origem celular do esôfago de Barrett), uma composição celular semelhante da amígdala não foi identificada. No entanto, um dos biomarcadores SCJ - citoqueratina 7 (CK7) - é expresso na cripta da tonsila, mas menos no epitélio escamoso da superfície. Notavelmente, a expressão de CK7 foi significativamente associada a cânceres no local da tonsila e que eram HPV positivos [47]. Assim, as células da amígdala CK7 positivas podem representar células vulneráveis ​​à infecção e transformação do HPV16.Curiosamente, CK7 e seu parceiro de ligação citoqueratina 19 (CK19) mostraram ser reguladores potenciais dos níveis de proteína E7 do HPV16. CK7 se liga aos transcritos de E7 para protegê-los da degradação e CK19 alivia um bloqueio de tradução imposto por CK7 [48,49]. É importante notar que na SCJ anal, enquanto múltiplas camadas de células CK7-positivas constituem a zona de transição metaplásica, apenas uma pequena proporção de neoplasias anais HPV-positivas expressam CK7, sugerindo que as células anais CK7 positivas são menos suscetíveis ao HPV infecção e / ou tem um risco reduzido de conversão neoplásica [50].

A patogênese do câncer cervical é caracterizada por uma fase pré-maligna bem definida de neoplasias intraepiteliais de baixo grau a alto grau (CIN1 a 3) que se desenvolvem ao longo de muitos anos, mas lesões displásicas raramente foram relatadas na orofaringe. Isso, combinado com a falta de detecção de infecções produtivas por HPV neste local anatômico, o domínio da positividade para HPV16 e a diferença nas taxas de integração entre os dois locais sugere que a história natural da doença causada pelo HPV na orofaringe é muito diferente da colo do útero, mas ainda inexplicado [51].

2. Modelagem da patogênese do papilomavírus humano na amígdala

Uma abordagem que se mostrou muito bem-sucedida na compreensão da interação entre os tipos de HPV HR e os queratinócitos cervicais foi a análise de células isoladas de neoplasias cervicais de baixo grau. As mais pesquisadas são as células W12 positivas para HPV16 [52] e a linha de células CIN612 positivas para HPV31 [53]. Ambos abrigam o genoma viral como epissomas extracromossômicos e, após cultura organotípica de jangada, formam epitélios reconstituídos que se assemelham à lesão cervical de baixo grau da qual foram derivados. Notavelmente, as linhas celulares mostram progressão neoplásica após cultura estendida, o DNA viral se integra e no crescimento organotípico eles formam um epitélio displásico de alto grau [54-56]. Embora essas linhas de células tenham sido inestimáveis ​​na compreensão da patogênese cervical, até agora nenhuma linha de células pré-malignas foi isolada da orofaringe. Portanto, nesta seção, discutimos como a infecção por HPV e a progressão da doença podem ser modeladas na amígdala.

(a) Camundongos transgênicos

Modelos de camundongos transgênicos projetados para expressar as oncoproteínas E6 e E7 do HPV16 em epitélios escamosos e tratados com carcinógenos químicos têm sido muito informativos sobre o papel das oncoproteínas virais no desenvolvimento da carcinogênese cutânea, cervical e de cabeça e pescoço (língua e esôfago) [ 57–60]. Esses estudos mostraram que a natureza da contribuição das proteínas E6 e E7 para a carcinogênese não é igual entre os diferentes sítios anatômicos, destacando a importância de se compreender a biologia E6 e E7 no sítio fisiológico correto. No entanto, como os ratos carecem de um equivalente de tonsila, uma abordagem semelhante para dissecar a função E6 e E7 neste órgão linfóide não é possível.

(b) Explantes de tecido de amígdala: ex vivo

Uma abordagem que ainda não foi explorada para investigar as interações HPV-tonsila é o uso de explantes de tonsila. As amígdalas humanas frescas dissecadas em pequenos blocos podem ser cultivadas em jangadas de colágeno na interface líquido-ar [61]. Explantes de amígdalas têm sido usados ​​para estudar a infecção por vírus, incluindo o vírus da imunodeficiência humana 1 e o vírus Epstein-Barr [62]. Embora esses explantes tenham uma vida útil limitada e possam ter uma ampla variação inter e intra-experimental, uma vantagem dos explantes de tonsila é que o ex-vivo O modelo mantém a citoarquitetura do tecido, incluindo os principais subtipos de linfócitos e a rede dendrítica folicular, e permitiria que a infecção por HPV fosse interrogada na presença de uma paisagem imunológica fisiológica.

(c) Equivalentes de epitélio amigdaliano

Outra abordagem, que tem sido amplamente utilizada no campo do papilomavírus, é a geração de equivalentes de epitélio "infectados por HPV" a partir de queratinócitos primários cultivados em cultura de jangada organotípica tridimensional (3D). Os queratinócitos que abrigam os genomas virais são semeados em um equivalente dérmico formado a partir do colágeno tipo 1 da cauda do rato embebido em fibroblastos (fibroblastos 3T3-J2 de camundongo são rotineiramente usados ​​no modelo de replicação do HPV). Após um curto período para permitir a expansão dos queratinócitos em uma monocamada confluente nos plugues de colágeno, eles são elevados em um suporte sólido e cultivados na interface ar-líquido por um período de cerca de duas semanas - o tempo que leva para um queratinócito basal para diferenciar totalmente. Isso envolve alimentar as jangadas por baixo com meio contendo soro livre de fator de crescimento epidérmico, fornecendo nutrientes e permitindo que citocinas e fatores de crescimento produzidos a partir dos fibroblastos sejam entregues aos queratinócitos. O sistema 'jangada' permite a análise da organização espacial e temporal do ciclo de vida do vírus - desde os primeiros eventos até a montagem da progênie viral (figura 2uma).

Figura 2. Equivalentes epiteliais. (uma) Desenho animado de crescimento de queratinócitos da amígdala contendo epissomas HR HPV em cultura organotípica de jangada. A estratificação por duas semanas na interface líquido-ar suporta o ciclo de vida produtivo completo do HPV. (b) Seção corada com hematoxilina e eosina de queratinócitos da tonsila primária e (c) queratinócitos do prepúcio. Observe a formação do córneo queratinizado (*) nas jangadas de queratinócitos do prepúcio que está ausente nas jangadas formadas a partir de queratinócitos amigdalianos primários. (d) Seção corada com hematoxilina e eosina de queratinócitos da tonsila primária que abrigam epissomas de HPV16 (b, basal, i, intermediário es, camadas superficiais) e (e) imunocorada para marcadores do ciclo de vida produtivo do HPV: proteína E4 (verde) e a proteína L1 do capsídeo principal (vermelha). Os núcleos são mostrados em azul. Barra de escala, 20 µm. As linhas pontilhadas indicam a fronteira entre a matriz de colágeno embutida em fibroblastos e os queratinócitos basais. Detalhes dos métodos envolvidos na preparação dos queratinócitos primários, transfecção de genomas de HPV, crescimento em cultura organotípica de jangada e imunocoloração de seções fixadas em formalina e embebidas em parafina são dados em [63].

O estabelecimento de queratinócitos contendo o genoma do HPV baseou-se amplamente na transfecção de genomas de HPV HR juntamente com um marcador selecionável de medicamento em queratinócitos primários, seguido por um breve período de seleção de medicamento para remover células não transfectadas [64]. A vida útil dos queratinócitos primários é estendida pelas ações das proteínas E6 e E7, levando à imortalização das células e, portanto, ao estabelecimento de linhagens celulares que abrigam os epissomas virais - um processo que leva vários meses de cultura celular. No entanto, a dependência da imortalização celular proíbe a investigação de eventos iniciais imediatos da amplificação do genoma viral inicial e a subsequente transição para a replicação de manutenção, análise de genomas defeituosos de imortalização de E6 e E7 e caracterização de interações vírus-célula que precedem a imortalização. A modificação deste modelo usando um sistema de recombinação Cre-loxP para recombinar epissomas de HPV em células primárias - os locais loxP estão posicionados na região reguladora a montante do local poliA + tardio, mas em uma região desprovida de fatores de ligação conhecidos - permite a análise de eventos no ciclo de vida do HPV [65–67]. Mais recentemente, queratinócitos primários foram infectados com sucesso com pseudovirions HPV16 que foram primeiro condicionados em uma matriz extracelular estabelecida por queratinócitos que expressam o receptor transiente laminina 332, e os queratinócitos primários infectados suportaram o ciclo de vida completo na cultura 3D [68].

Vários grupos, incluindo o nosso, estão usando queratinócitos de tonsila primários para investigar a biologia do HPV neste local (figura 2). Por causa da prevalência muito alta de HPV16 em doenças malignas da tonsila, os modelos de tonsila compreensivelmente focaram no HPV16. No entanto, há algum sentido no estabelecimento de modelos de tonsila dos tipos de HPV HR (por exemplo, HPV18) que são muito menos prevalentes, porque análises comparativas em células isogênicas podem descobrir pistas sobre as razões para a dominância de HPV16.

(i) Cripta versus queratinócitos de tonsila escamosa de superfície

Uma questão importante é por que a cripta tonsilar é mais suscetível à transformação do HPV do que o epitélio escamoso da superfície. Um estudo muito interessante isolou células de células progenitoras da tonsila expressando altos níveis de antígenos de superfície celular CD44 e receptor do fator de crescimento nervoso (NGFR) da cripta e do epitélio de superfície [69]. No epitélio superficial da amígdala, as células CD44 + / NGFR + estão nas camadas de células basais e parabasais, mas na cripta elas são encontradas em uma distribuição mais aleatória, indicando a natureza rompida da cripta (figura 1). As células progenitoras de ambos os locais eram molecularmente semelhantes (enriquecidas por vias associadas à mobilidade e migração), mas as da cripta eram mais primitivas do que as da superfície com base em seu maior potencial proliferativo. Embora o tempo de vida dessas células de ambos os locais tenha sido estendido a extensões semelhantes após a co-expressão das oncoproteínas HPV16 E6 e E7, a diferenciação das células criptográficas que expressam E6 / E7 após a estratificação 3D foi mais marcadamente interrompida em comparação com o epitelial de superfície que expressa a oncoproteína progenitores derivados. Não se sabe se as células progenitoras são as células-alvo naturais do vírus, mas a natureza mais primitiva daquelas da cripta pode torná-las menos permissivas para suportar o ciclo de vida do HPV16 e, portanto, mais suscetíveis à transformação causada pelo vírus. Talvez a introdução de genomas HPV16 inteiros nessas células para determinar se elas podem suportar o ciclo infeccioso seja um caminho a seguir.

(ii) O HPV16 pode infectar e se replicar nos queratinócitos da amígdala?

HPV16 se replica em queratinócitos de tonsila primários "não classificados" após a transfecção de genomas virais completos ou infecção com pseudovirions HPV16 [68,70,71]. Após a estratificação, as células positivas para HPV16 suportam a produção de progênie infecciosa, embora a conformação dos vírions maduros produzidos nas tonsilas sejam diferentes daqueles montados nas jangadas queratinizantes de queratinócitos do prepúcio [71]. Os vírions derivados da amígdala foram neutralizados efetivamente com anticorpos anti-L1, mas a neutralização foi menos eficiente com anticorpos anti-L2. Se de fato houver diferenças estruturais entre os vírions do HPV produzidos em diferentes locais do corpo, isso poderia impactar a eficácia de qualquer uso futuro de vacinas profiláticas à base de L2 neutralizantes [72].

(iii) Os queratinócitos das amígdalas suportam a replicação dos tipos de papilomavírus humano de alto risco menos prevalentes em doenças malignas das amígdalas?

A raridade de outros tipos de HPV HR em tecidos orofaríngeos pode ser porque esses tipos são incapazes de infectar esses tecidos ou diferem no potencial de replicação. No entanto, o HPV18 é muito eficaz em estender a vida útil dos queratinócitos da amígdala e as células suportam eventos produtivos do HPV18 na cultura 3D ([73] (figuras 3 e 4)).

Figura 3. Expressão de citoqueratina em jangadas 3D positivas para HPV. Seções manchadas por (uma) CK8 (Sigma-Aldrich, M20) e HPV E4, (b) CK7 (Dako Products, M701829-2) e HPV E4. Núcleos contrastados (azul). HTK, queratinócitos da amígdala humana HFK, queratinócitos do prepúcio humano. Barra de escala, 20 µm. As linhas pontilhadas ou pontas de seta indicam a fronteira entre a matriz de colágeno embutida em fibroblastos e os queratinócitos basais.

Figura 4. Equivalentes de amígdalas para modelar a patogênese da tonsila do HPV. (uma) Os queratinócitos da tonsila primários que abrigam os genomas do HPV HR são modelos fortes para entender a biologia do HPV neste sítio anatômico e as alterações do vírus e do hospedeiro ligadas aos estágios iniciais da progressão da doença. Além disso, eles podem ser uma plataforma para testar a capacidade de "driver" de mutações no gene do hospedeiro identificadas em cânceres de amígdala causados ​​por HPV. Consulte o texto para obter detalhes. (b) Southern blot de células de tonsila-HPV em cultura de células bidimensionais estendida mostra perda de epissoma e detalhes experimentais de persistência de epissoma dados em [63].

(iv) Os modelos baseados em queratinócitos da tonsila primária são fisiológicos?

Quando cultivados em cultura de jangada organotípica, os queratinócitos de epitélios escamosos de diferentes locais do corpo exibem um potencial intrínseco para diferenciação específica de tecido. Assim, os queratinócitos isolados do tecido do prepúcio neonatal formam uma estrutura cornificada com um córneo forte queratinizado, enquanto os queratinócitos da amígdala recapitulam a estrutura do epitélio não queratinizante (figura 2b,c) No entanto, a superfície da tonsila e o epitélio da cripta passam por programas alternativos de diferenciação e, em particular, há diferenças marcantes em seus perfis de queratina [74]. A citoqueratina 8 (CK8), normalmente associada à CK18, é fracamente expressa nos queratinócitos do epitélio da tonsila superficial (e nos queratinócitos basais), mas é fortemente expressa na cripta reticulada, particularmente nas células das camadas superiores [74]. Outra citoqueratina que distingue a cripta do epitélio de superfície é o marcador de epitélio transicional / juncional CK7. No epitélio de superfície, a expressão de CK7 é baixa e irregular, enquanto na cripta é fortemente expressa [47].

Então, os equivalentes do epitélio da tonsila mostram padrões de expressão de CK8 e CK7 da superfície ou da cripta, e a replicação do HPV afeta os perfis de expressão dessas citoqueratinas? Nossos modelos de queratinócitos de tonsila HR HPV estão começando a responder a essas perguntas. Jangadas organotípicas imunocoradas de queratinócitos da amígdala humana primários usando anticorpos anti-CK8 mostraram coloração irregular de CK8 que estava amplamente ausente das áreas de estratificação completa, mas em áreas que não eram de espessura total, algumas células basais / parabasais foram positivas para esta citoqueratina (figura 3uma) No entanto, a expressão intensa de CK8 ocorreu em células superficiais de equivalentes de epitélio de tonsila HPV16 e HPV18 isogênicos, com coloração de baixo nível em queratinócitos basais (figura 3uma) Isso era específico para o local de origem dos queratinócitos porque a coloração de CK8 muito baixa ocorreu em jangadas de queratinócitos do prepúcio que abrigam os epissomas de HPV HR (figura 3uma) Nas jangadas de queratinócitos das tonsilas, CK7 estava restrito à célula superficial ocasional, mas nas linhas isogênicas contendo o genoma HPV16 e HPV18, os níveis desta citoqueratina estavam marcadamente aumentados nas células das camadas intermediárias superiores e superficiais correspondentes à fase produtiva do Ciclo de vida do HPV (figura 3b) Um efeito semelhante na expressão de CK7 não ocorreu em equivalentes de queratinócitos de prepúcio positivos para HPV18 (figura 3b) Esses achados fornecem evidências de que HR HPV altera o padrão de expressão de marcadores de diferenciação específicos da amígdala, um fenômeno que parece ser exclusivo deste sítio anatômico. O HPV é conhecido por atrasar a diferenciação no colo do útero para apoiar a replicação do vírus, mas na amígdala talvez o vírus seja capaz de reprogramar o queratinócito para expressar as características de diferenciação da cripta tonsilar. Uma vez que CK7 foi implicado em um mecanismo de tradução de mRNAs de HPV [49], este pode ser um mecanismo viral específico para o queratinócito da tonsila.

(v) Compreendendo a progressão neoplásica de câncer de amígdala conduzido por papilomavírus humano usando os modelos de amígdala de papilomavírus humano

Pacientes com câncer orofaríngeo HPV-positivo geralmente apresentam doença mais avançada em comparação com aqueles com OPSCC HPV-negativo, mas eles têm um melhor prognóstico e sobrevida geral, embora a recorrência ainda seja uma preocupação [15,75]. Portanto, embora a positividade do HPV seja um indicador de prognóstico, a sobrevida do paciente pode ser ainda mais estratificada com base em se o genoma viral está integrado ou não no tumor, uma vez que o resultado clínico demonstrou ser pior nos pacientes com HPV16 integrado e / ou interrupção do HPV E2 gene [7,16,30]. A identificação de marcadores prognósticos entre essas diferentes populações de doenças HPV-positivas será importante se os regimes de tratamento de descalonamento forem implementados com sucesso.

A integração do DNA do HPV é muito menos frequente no OPSCC do HPV do que no colo do útero, mas além das formas integradas e não integradas do DNA viral, uma terceira forma de um híbrido humano-DNA viral foi proposta [29]. Se esses híbridos humano-viral realmente existem e se eles são relevantes para a patogênese do HPV-OPSCC não está claro, e ainda não foram relatados em queratinócitos de amígdala imortalizados por genomas de HPV16. No entanto, os genomas do HPV16 tornam-se integrados no DNA do hospedeiro nas células da tonsila primária e os mRNAs da célula do vírus E6-E7 expressos são indistinguíveis daqueles encontrados em tumores de cabeça e pescoço positivos para HPV16 (figura 4), sugerindo que as mesmas pressões seletivas ocorrem no equivalentes de tonsila como em infecções clínicas e, portanto, eles representam bons modelos para estudar as interações vírus-célula na progressão da neoplasia de tonsila induzida por HPV [76].

Curiosamente, em nossos modelos de replicação do HPV em queratinócitos da tonsila primária, nos três doadores investigados até o momento, o HPV18 é mantido como um epissoma por entre 40 e 70 duplicações populacionais, após o que há uma diminuição acentuada nas formas epissomais do genoma viral, conforme determinado por Southern blotting. Enquanto nos mesmos três doadores, o DNA do HPV16 se integrou muito cedo após o estabelecimento das linhas celulares (em um doador) e nos outros dois doadores permaneceu epissomal em cultura de células estendida (mais de 90 duplicações populacionais até o momento). Embora o tamanho da amostra do doador seja muito pequeno para concluir que o HPV16 é menos provável de se integrar do que o HPV18 em queratinócitos de tonsila primários, esses modelos são úteis para investigar diferenças na biologia de HPV16 e HPV18 e nas interações vírus-hospedeiro em fundos de queratinócitos de tonsila isogênicos cultivados em curto e cultura de células de longo prazo em condições de não estresse (figura 4).

3. Direções futuras

É um quebra-cabeças que, apesar do reconhecimento de uma associação com HR HPV e OPSCC, a infecção nesses locais em tecido não maligno não tenha sido encontrada conclusivamente. Queratinócitos primários isolados do tecido tonsilar não são refratários à infecção pelo HPV16 e são capazes de suportar a produção de progênie infecciosa, mas os queratinócitos tonsilares primários são realmente representativos da célula-alvo do vírus? Se as células-tronco na cripta são o alvo natural e as infecções orais por HPV podem representar uma fonte de vírus para infectar a amígdala, essas células podem ser menos permissivas para a replicação do HPV, levando à expressão desregulada de E6 e E7. Uma vez que no trato anogenital, o fenótipo da célula-alvo HR-HPV é um determinante do risco carcinogênico, a definição molecular da célula-alvo desses vírus na amígdala é necessária [50].

A razão para a prevalência de HPV16 em HPV-OPSCC também não é clara, mas os queratinócitos da amígdala primários sustentam o ciclo infeccioso do HPV18, que raramente é encontrado em cânceres de amígdala, tão simplesmente que este tipo de HPV é menos capaz de infectar ou replicar nas células da amígdala parece uma explicação improvável de por que vemos menos cânceres de amígdalas positivos para HPV18. Talvez a natureza da interação entre esses vírus e o sistema imunológico nesse tecido linfoepitelial seja diferente entre os vários tipos de HPV e isso contribua para os diferentes resultados da infecção. São necessários mais estudos para compreender os efeitos da infecção e da replicação do HPV nos queratinócitos da amígdala sobre a sinalização inata e outros braços do sistema imunológico. Com relação a este tópico, o RNA-Seq de queratinócitos gengivais imortalizados com a enzima telomerase hTERT e genomas de HPV16 mostraram regulação negativa do complexo de sinalização inato regulado por interferon, fator gênico estimulado por interferon 3 (ISGF3) e uma série de genes alvos deste complexo [70]. Embora o tecido gengival não seja um local comum para o desenvolvimento de cânceres de HPV16, houve uma forte correlação entre a regulação negativa dos alvos ISGF3 entre essas células imortalizadas de HPV16 e em cânceres de cabeça e pescoço HPV-positivos versus HPV-negativos [70]. Os níveis desses alvos também eram baixos nos queratinócitos da amígdala que albergavam os epissomas do HPV16, sugerindo que a interferência desta via é fundamental nas infecções por HPV na cabeça e no pescoço.

A investigação da biologia do ciclo de vida do HPV nas amígdalas primárias é um nível de compreensão da interação vírus-hospedeiro. No entanto, uma vez que a amígdala é um tecido linfóide com infiltração significativa de células linfóides na cripta tonsilar, estudos futuros podem avançar esses modelos através da co-cultura de queratinócitos com componentes imunológicos em sistemas de cultura bidimensionais e 3D.

Embora as linhagens celulares tenham sido estabelecidas a partir de neoplasias cervicais e tenham sido de grande importância na compreensão da história natural da patogênese do HPV cervical, equivalentes da orofaringe não foram estabelecidos. Isso pode ser porque neste local anatômico a história natural da infecção por HPV é muito diferente do colo do útero, já que um estágio pré-maligno prolongado não ocorre [51] ou as alterações displásicas induzidas pela replicação desses vírus neste local do corpo são muito leves , como sugerido para a replicação do HPV18 no colo do útero [77]. No entanto, durante a cultura dos modelos de queratinócitos de tonsila imortalizados por HPV16, o DNA viral se integra ao DNA do hospedeiro e em locais cromossômicos também encontrados em tumores HPV16-positivos, então eles modelam eventos vírus-hospedeiro que ocorrem na Vivo [76]. Nossas linhas de queratinócitos de amígdalas isogênicas que abrigam HPV16 ou HPV18 mostram persistência diferencial dos epissomas virais após cultura de células estendida e, uma vez que a maioria dos cânceres dirigidos por HPV na orofaringe retêm epissomas, eles fornecem um modelo útil para investigar vírus e eventos celulares associados com estágios da patogênese da tonsila conduzida por integrante e epissoma do HPV (figura 4). Desfechos importantes também podem incluir novos alvos virais e / ou celulares que podem ser desenvolvidos em marcadores diagnósticos e prognósticos.

A realização de análises de expressão gênica global em culturas organotípicas de queratinócitos cervicais primários que abrigam epissomas de HPV16 revelou uma série de genes hospedeiros modulados pelo vírus (genes associados à progressão do ciclo celular e metabolismo do DNA foram regulados positivamente, enquanto os genes envolvidos no desenvolvimento da pele, resposta imunológica e celular morte foram reguladas para baixo) que não foram observados em modelos baseados no prepúcio HPV16-positivo [78]. A biologia do epitélio da tonsila é muito diferente da do colo do útero e a análise do gene global nos equivalentes epiteliais da tonsila 3D HPV16 é necessária para permitir um melhor entendimento da reprogramação do vírus no hospedeiro neste local do corpo. Como o HPV regula a expressão de miRNA durante o ciclo de vida do vírus e um perfil específico de miRNA está associado a tumores de tonsila HPV-positivos em comparação com malignidades negativas para vírus, então a caracterização do efeito do vírus sobre o transcriptoma de miRNA também deve ser investigada usando os modelos [79] .

Tampouco os estudos devem ser limitados apenas ao HPV16, mas incluir modelos contendo tipos de HPV HR encontrados com menos frequência no HPV-OPSCC, o que pode auxiliar na identificação das razões moleculares para a patogenicidade diferente no tecido tonsilar.

É comumente assumido que os papilomavírus evoluem lentamente, mas o sequenciamento de próxima geração de DNA de HPV isolado de lesões está desafiando essa suposição e, de fato, a variabilidade do genótipo de HPV entre hospedeiros pode ser alta, embora a conservação de E7 tenha sido demonstrada no colo do útero [33, 80,81]. Há também um grau de variabilidade intra-hospedeiro dos genótipos do HPV16 em sub-locais anatômicos, sugerindo que nem todos os locais de infecção do HPV16 são iguais no que diz respeito à diversidade viral. Mas quais fatores podem estar impulsionando a evolução do HPV em diferentes locais de infecção? Uma grande proporção dessas mutações é impulsionada pela atividade antiviral de APOBEC3. Outras pressões imunes inatas e adaptativas também podem ser importantes e as diferenças entre o colo do útero e a orofaringe podem, portanto, conduzir a diferentes níveis de diversidade do genótipo do HPV. Certamente, esta é uma área de debate contínuo e mais informações sobre a variabilidade intra-hospedeiro do genótipo HPV16 são necessárias no HPV-OPSCC. A biologia de quaisquer variantes de HPV16 exclusivas para OPSCC poderia ser testada nos modelos de queratinócitos de tonsila primários.

Em resumo, está se tornando reconhecido que a doença orofaríngea causada por vírus é diferente da patogênese cervical: assim, o refinamento e o aprimoramento dos modelos baseados em queratinócitos da tonsila contribuirão para uma maior compreensão da doença por HPV neste sítio anatômico.

Ética

Aprovação ética obtida para coleta de tecidos por consentimento informado para isolamento de queratinócitos primários (REC 06 / Q1702 / 45).

Acessibilidade de dados

Os dados que sustentam este artigo estão descritos no texto ou estão disponíveis mediante solicitação ao autor para correspondência.


Conteúdo

O HPV + OPC apresenta-se de quatro maneiras: como uma anormalidade assintomática na boca encontrada pelo paciente ou por um profissional de saúde, como um dentista, com sintomas locais como dor ou infecção no local do tumor com dificuldades de fala, deglutição, e / ou respiração ou como um inchaço no pescoço (se o câncer se espalhou para os gânglios linfáticos). Isso pode ser acompanhado por sintomas mais gerais, como perda de apetite, perda de peso e fraqueza. [3]

A maioria dos cânceres de células escamosas da mucosa da cabeça e pescoço, incluindo o câncer de orofaringe (OPC), tem sido historicamente atribuída ao uso de tabaco e álcool. No entanto, esse padrão mudou consideravelmente desde a década de 1980. Percebeu-se que alguns cânceres ocorrem na ausência desses fatores de risco e uma associação entre o vírus do papiloma humano (HPV) e vários cânceres de células escamosas, incluindo OPC, foi descrita pela primeira vez em 1983. [4] [5] Desde então, tanto molecular quanto evidências epidemiológicas têm se acumulado, com a Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer (IARC) declarando que os tipos 16 e 18 de HPV de alto risco são cancerígenos em humanos, em 1995, [6] e em 2007 que o HPV era uma causa de câncer oral. [7] [8] A incidência de câncer positivo para papilomavírus humano (HPV) (HPV + OPC) tem aumentado, enquanto a incidência de câncer HPV-negativo (HPV-OPC) está diminuindo, uma tendência que deve aumentar ainda mais nos próximos anos. [9] Como há diferenças marcantes na apresentação clínica e no tratamento em relação ao status do HPV, HPV + OPC agora é visto como uma condição biológica e clínica distinta. [10] [11] [12]

O HPV humano há muito está implicado na patogênese de vários cânceres anogenitais, incluindo os do ânus, vulva, vagina, colo do útero e pênis. [13] Em 2007, também foi implicado por evidências moleculares e epidemiológicas em cânceres que surgem fora do trato anogenital, a saber, cânceres orais. A infecção por HPV é comum entre indivíduos saudáveis ​​e é adquirida por meio do sexo oral. Embora menos dados estejam disponíveis, a prevalência da infecção por HPV é pelo menos tão comum entre os homens quanto entre as mulheres, com estimativas de cerca de 27% em 2004 entre as mulheres dos Estados Unidos com idades entre 14 e 59 anos. [8]

A infecção oral por HPV precede o desenvolvimento de HPV + OPC. [8] [5] Lesões leves na membrana mucosa servem como uma porta de entrada para o HPV, que, portanto, atua na camada basal do epitélio. [14] [15] Pessoas com teste positivo para infecção oral pelo vírus HPV tipo 16 (HPV16) apresentam risco 14 vezes maior de desenvolver HPV + OPC. [14] A imunossupressão parece ser um fator de risco aumentado para HPV + OPC. [5] Indivíduos com variações genéticas TGF-β1, especialmente T869C, são mais propensos a ter HPV16 + OPC. [16] O TGF-β1 desempenha um papel importante no controle do sistema imunológico. Em 1993, observou-se que os pacientes com câncer anogenital associado ao papilomavírus humano (HPV) tinham um risco 4 vezes maior de carcinoma de células escamosas tonsilar. [17] Embora as evidências sugiram que o HPV16 é a principal causa de OPC em humanos não expostos ao fumo e ao álcool, o grau em que o uso de tabaco e / ou álcool pode contribuir para aumentar o risco de HPV + OPC nem sempre foi claro [5] ], mas parece que fumar e infecção por HPV são fatores de risco independentes e aditivos para o desenvolvimento de OPC. [18] A conexão entre a infecção por HPV e o câncer orofaríngeo é mais forte nas regiões do tecido linfoepitelial (base da língua e tonsilas palatinas) do que nas regiões do epitélio escamoso estratificado (palato mole e úvula). [19] A infecção por herpesvírus humano-8 pode potencializar os efeitos do HPV-16. [20]

Os fatores de risco incluem um grande número de parceiros sexuais (aumento de 25% & gt = 6 parceiros), história de sexo oral-genital (125% & gt = 4 parceiros) ou sexo anal-oral, uma parceira com histórico de esfregaço de Papanicolaou anormal ou displasia cervical, [21] periodontite crônica, [22] [23] e, entre os homens, idade decrescente na primeira relação sexual e história de verrugas genitais. [24] [25] [26] [27]

Os cânceres da orofaringe surgem principalmente no tecido linfóide das tonsilas palatinas e lingual que é revestido pelo epitélio da mucosa escamosa respiratória, que pode ser invaginado dentro do tecido linfóide. Portanto, o tumor surge primeiro em criptas ocultas. O OPC é classificado com base no grau de diferenciação escamosa e de queratina em graus bem, moderados ou mal (altos) diferenciados. Outras características patológicas incluem a presença de invasão em forma de dedo, invasão perineural, profundidade de invasão e distância do tumor das margens de ressecção. Variantes fenotípicas incluem carcinoma escamoso basaloide, uma forma de alto grau (Vejo Chung Fig. 35-3 (C) [28] e ilustração aqui). Eles são mais comumente não queratinizantes. HPV + OPC também difere de HPV-OPC por ser focal em vez de multifocal e não estar associado à displasia pré-maligna. Pacientes com HPV + OPC têm, portanto, menos risco de desenvolver outras doenças malignas na região de cabeça e pescoço, ao contrário de outros tumores primários de cabeça e pescoço que podem ter uma segunda neoplasia associada, que pode ocorrer ao mesmo tempo (síncrono) ou em um tempo distante (metacrônico ), tanto na região da cabeça e pescoço ou mais distantes. Isso sugere que as alterações oncogênicas produzidas pelo vírus são espacialmente limitadas, e não relacionadas a um defeito de campo. [29] [28] [30]

Edição de anatomia

A orofaringe, na parte posterior da boca, forma um círculo e inclui a base da língua (terço posterior) abaixo, as amígdalas de cada lado e o palato mole acima, juntamente com as paredes da faringe, incluindo a epiglote anterior , valéculas epiglóticas e fenda branquial em sua base. A orofaringe é uma das três divisões do interior da faringe com base em sua relação com estruturas adjacentes (faringe nasal (nasofaringe), faringe oral (orofaringe) e faringe laríngea (laringofaringe - também conhecida como hipofaringe), de cima para baixo ) A faringe é um tubo fibromuscular semicircular que une as cavidades nasais acima da laringe (caixa vocal) e esôfago (garganta), abaixo, onde a laringe está situada na frente do esôfago. [31]

A orofaringe encontra-se entre a boca (cavidade oral) para a frente, e a laringofaringe abaixo, que a separa da laringe. O limite superior da orofaringe é marcado pelo palato mole, e seu limite inferior pela epiglote e raiz da língua. A orofaringe se comunica com a boca, na frente, por meio do que se conhece como istmo orofaríngeo, ou istmo das fauces. O istmo (ou seja, a conexão) é formado acima pelo palato mole, abaixo pelo terço posterior da língua e nas laterais pelos arcos palatoglossais. O terço posterior da língua, ou base da língua, contém numerosos folículos de tecido linfático que formam as tonsilas linguais. Adjacente à base da língua, a superfície lingual da epiglote, que se curva para a frente, está ligada à língua pelas pregas glossoepiglóticas mediana e lateral. As dobras formam pequenas depressões conhecidas como valéculas epiglóticas. As paredes laterais são marcadas por dois pilares verticais de cada lado, os pilares das fauces, ou arcos palatoglossais. Mais apropriadamente, eles são chamados separadamente de arco palatoglosso anteriormente e arco palatofaríngeo posteriormente. O arco anterior é denominado a partir do músculo palatoglosso interno, que vai do palato mole à língua (brilho), enquanto o arco posterior contém, de forma semelhante, o músculo palatofaríngeo que vai do palato mole à faringe lateral. Entre os arcos existe um espaço triangular, a fossa tonsilar onde fica a tonsila palatina, outro órgão linfóide. [32]

As paredes externas da faringe, compostas pelos quatro músculos constritores, fazem parte do mecanismo de deglutição. A anatomia microscópica é composta por quatro camadas, sendo do lúmen para fora, a mucosa, a submucosa, os músculos e a fibrosa, ou camada fibrosa. A mucosa é constituída por epitélio escamoso estratificado, geralmente não queratinizado, exceto quando exposto a irritantes crônicos como a fumaça do tabaco. A submucosa contém agregados de tecido linfóide. [32] [33]

Padrões de propagação Editar

Os cânceres que surgem na fossa tonsilar se espalham para os nódulos linfáticos cervicais, principalmente os linfonodos subdigástricos (jugular superior) (nível II), com envolvimento secundário dos nódulos jugulares médios (nível III) e baixos (nível IV) e, às vezes, os nódulos cervicais posteriores nós (nível V). Os cânceres da base da língua se espalham para os nódulos subdigástricos e jugulares médios e, ocasionalmente, nódulos cervicais posteriores, mas estando mais próximos da linha média, têm maior probabilidade de apresentar doença nodal bilateral. Os cânceres tonsilares raramente se espalham para o lado contralateral, a menos que envolvam a linha média. [34]

Edição de mecanismo

Virology Edit

Os cânceres associados ao HPV são causados ​​por cepas de HPV de alto risco, principalmente HPV-16 e HPV-18. [35] HPV é um pequeno vírus DNA sem envelope da família do papilomavírus. Seu genoma codifica as primeiras (E) oncoproteínas E5, E6 e E7 e as tardias (L) proteínas do capsídeo L1 e L2. O vírus ganha acesso à mucosa por meio de microlesões, onde infecta a camada basal das células, que ainda podem se proliferar. Embora o vírus não se replique nessas células, a expressão de seus genes iniciais estimula a proliferação e a expansão lateral das células basais. À medida que isso move as partículas de vírus para as camadas suprabasais sobrepostas, ocorre a expressão do gene viral tardio, permitindo a replicação do genoma viral circular (Vejo figura) e proteínas estruturais. À medida que são empurrados para as camadas mais superficiais da mucosa, partículas virais completas são montadas e liberadas. [36]

Oncogenesis Edit

Um risco aumentado de HPV + OPC é observado mais de 15 anos após a exposição ao HPV, [8] apontando para um desenvolvimento lento da doença, semelhante ao observado no câncer cervical. Em relação ao HPV-OPC, a progressão molecular oncogênica de HPV + OPC é mal compreendida. [28] As duas principais oncoproteínas virais dos tipos de HPV de alto risco são E6 e E7. Estes são expressos consistentemente em linhas de células malignas e, se sua expressão for inibida, o fenótipo maligno das células cancerosas será bloqueado. Qualquer uma dessas oncoproteínas pode imortalizar linhagens celulares, [37] mas são mais eficientes quando ambas são expressas, uma vez que seus papéis moleculares separados são sinérgicos. [35] [36] Os oncogenes E6 e E7 tornam-se integrados ao DNA da célula hospedeira, e as oncoproteínas que eles expressam interferem com uma variedade de mecanismos reguladores celulares predominantemente antiproliferativos. Eles se ligam e inativam o mais conhecido desses mecanismos, as proteínas supressoras de tumor p53 e a proteína de retinoblastoma pRB (pRb), levando à instabilidade genômica e, em seguida, à desregulação do ciclo celular (Vejo Chung et al., 2016 Fig. 35.2). [28] Além disso, ainda não foram eliciados, mecanismos são necessários para as etapas finais de transformação maligna de células infectadas por HPV. [28]

HPV- e HPV + OPC são distinguíveis a nível molecular. O p53 de ocorrência natural (tipo selvagem) está amplamente envolvido em processos celulares, incluindo autofagia, resposta a danos no DNA, regulação e senescência do ciclo celular, apoptose e geração de trifosfato de adenosina (ATP) por fosforilação oxidativa. [38] O gene que codifica p53 é inativado por E6 no nível da proteína e é encontrado como o tipo selvagem em HPV + OPC, mas com mutação em HPV-OPC. No HPV + OPC a proteína p53 sofre degradação acelerada pelo E6, reduzindo drasticamente seus níveis, enquanto no HPV-OPC sofre mutação genética, que pode resultar na síntese de uma proteína p53 anormal, que pode não só ser inativa como supressora de tumor, mas também pode ligar e inativar qualquer p53 de tipo selvagem não mutado, com um aumento na atividade oncogênica. [39] Embora as mutações de p53 ocorram em HPV + OPC, elas são muito menos comuns do que em HPV-OPC (26% vs 48%), e não parecem afetar o resultado clínico. [40]

A proteína pRb é inativada por E7 em HPV + OPC, mas em HPV-OPC é a parte supressora de tumor p16 da rede supressora de tumor pRb que está inativada. Além disso, a via pRb é inativada por E7 em vez da amplificação da ciclina D1. [8] [41] CDKN2A é um gene supressor de tumor que codifica uma proteína supressora de tumor, p16 (inibidor de quinase dependente de ciclina 2A) e inibe a atividade de quinase das quinases dependentes de ciclina CDK4 e CDK6, que por sua vez induzem a parada do ciclo celular. [38] A expressão de p16 é dependente do ciclo celular e é expressa focalmente em apenas cerca de 5–10% do epitélio escamoso normal. Como a maioria dos cânceres HPV +, HPV + OPC expressa p16, mas o último não funciona como um supressor de tumor, porque o mecanismo pelo qual isso é alcançado, pRb, foi inativado por E7.O p16 é regulado positivamente (superexpresso) devido à perda de pRB relacionada ao E7 com feedback negativo reduzido, [39] [42] ao passo que é regulado para baixo em até 90% do HPV-OPC. [43] Essa superexpressão difusa nas células tumorais fornece um marcador diagnóstico para o envolvimento do HPV. [44] [45] Embora os HPV E6 e E7 reduzam a atividade supressora de tumor, eles o fazem menos do que os processos genéticos e epigenéticos no HPV-OPC. [46] [47] [11]

Os epitélios tonsilares (palatino e lingual) compartilham características semelhantes de não queratinização com o colo do útero, onde a infecção por HPV desempenha o papel principal nos casos de câncer cervical. [14] [48] Além disso, E6 e E7 podem tornar o HPV + OPC mais imunogênico do que o HPV-OPC, uma vez que os anticorpos anti-E6 e E7 podem ser detectados nesses pacientes. Isso, por sua vez, pode restringir o comportamento maligno de HPV + OPC e a presença de anticorpos tem sido associada a um melhor prognóstico, enquanto o tratamento pode aumentar a imunogenicidade do tumor e, portanto, melhorar a resposta, embora até que ponto não esteja claro. [49] [11] Os resultados também estão associados à melhora da imunidade adaptativa. [50]

Edição de biópsia

O diagnóstico inicial requer a visualização do tumor pela boca ou endoscopicamente pelo nariz usando um rinoscópio, ilustrado à direita, seguido de biópsia. [ citação necessária ]

Diferenciando HPV + OPC de HPV-OPC Edit

HPV + OPC é geralmente diagnosticado em um estágio mais avançado do que HPV-OPC, [8] com 75–90% tendo envolvimento de linfonodos regionais. [51] Além disso, o carcinoma de células escamosas não queratinizante está fortemente associado ao HPV-OPC. [52] [53]

As assinaturas genéticas de HPV + e HPV-OPC são diferentes. [54] [55] [56] [57] [58] HPV + OPC está associado ao nível de expressão dos mRNAs E6 / E7 e de p16. [59] Os casos positivos para HPV16 E6 / E7 são histopatologicamente caracterizados por sua estrutura verrucosa ou papilar (tipo mamilo) e coilocitose da mucosa adjacente. Aproximadamente 15% dos HNSCCs são causados ​​por infecção por HPV16 e a expressão constitutiva subsequente de E6 e E7, e alguns tumores iniciados por HPV podem perder suas características originais durante a progressão do tumor. [60] Os tipos de HPV de alto risco podem estar associados ao carcinoma oral, por desregulação do controle do ciclo celular, contribuindo para a carcinogênese oral e a superexpressão de mdm2, p27 e catepsina B. [61]

HPV + OPC não é meramente caracterizado pela presença de HPV-16: apenas a expressão de oncogenes virais dentro das células tumorais mais a presença de anticorpos E6 ou E7 no soro é inequivocamente conclusiva para HPV + OPC. [14]

Não existe um método de teste de HPV padrão em cânceres de cabeça e pescoço, [62] tanto a hibridização in situ (ISH) quanto a reação em cadeia da polimerase (PCR) são comumente usadas. [44] [63] Ambos os métodos têm desempenho comparável para detecção de HPV; no entanto, é importante usar controles de sensibilidade apropriados. [64] A coloração por imunohistoquímica (IHC) do tecido para p16 é frequentemente usada como um substituto custo-efetivo para HPV em OPC, em comparação com ISH ou PCR [65] [66] [67], mas há uma pequena incidência de HPV- doença p16-positiva negativa responsável por cerca de 5% do HPV-OPC. [65]

O estadiamento é geralmente pelo sistema UICC / AJCC TNM (Tumor, Nodes, Metastases). [67] O estadiamento é baseado no exame clínico, diagnóstico por imagem e patologia. Na imagem, os linfonodos envolvidos podem parecer císticos, uma característica de HPV + OPC. [68]

HPV + OPC foi tratado de forma semelhante ao OPC não relacionado ao HPV de estágio correspondente e local, mas seus recursos exclusivos, que contrastam com cânceres de cabeça e pescoço HPV-OPC relacionados ao fumo, para os quais os dados demográficos, comorbidades, fatores de risco e carcinogênese dos pacientes diferem marcadamente, sugerem que um sistema de estadiamento distinto seja desenvolvido para representar mais apropriadamente a gravidade da doença e seu prognóstico. [69] O estadiamento TNM da AJCC padrão, como a sétima edição (2009) [70], embora preditivo para HPV-OPC, não tem valor prognóstico em HPV + OPC. [71] [72] [66] [69] A 8ª edição do AJCC TNM Staging Manual (2016) [73] incorpora este estadiamento específico para HPV + OPC. [74] A partir de 2018, as diretrizes de tratamento estão evoluindo para levar em conta os diferentes desfechos observados em HPV + OPC. Consequentemente, o uso menos intensivo (desintensificação) de radioterapia ou quimioterapia, [75] bem como terapia específica, está sob investigação, envolvendo HPV + OPC em ensaios clínicos para preservar o controle da doença e minimizar a morbidade em grupos selecionados com base no estadiamento TNM modificado e tabagismo. [76] [77] [78] [79] [80]

O câncer de HPV + da orofaringe é classificado como (AJCC 8ª ed. 2016): [74] Estágio do tumor

  • T0 sem identificação primária
  • T1 2 cm ou menos na maior dimensão
  • T2 2–4 cm
  • T3 & gt4 cm, ou extensão à superfície lingual da epiglote
  • T4 doença local moderadamente avançada, invasão da laringe, músculo extrínseco da língua, pterigóide medial, palato duro ou mandíbula ou além
  • Nx linfonodos regionais não podem ser avaliados
  • N0 nenhum linfonodo regional envolvido
  • N1 um ou mais nódulos ipsilaterais envolvidos, menos de 6 cm
  • Linfonodos N2 contralaterais ou bilaterais, menos de 6 cm
  • Linfonodo (s) N3 maior do que 6 cm
  • Estágio I: T0N1, T1–2N0–1
  • Estágio II: T0N2, T1–3N2, T3N0–2
  • Estágio III: T0-3N3, T4N0-3
  • Estágio IV: quaisquer metástases (M1)

No entanto, a literatura publicada e os ensaios clínicos em andamento usam a sétima edição anterior que não faz distinção entre HPV + OPC e HPV-OPC - consulte Câncer Orofaríngeo - Estágios. [81] [82] Os estágios T são essencialmente semelhantes entre AJCC 7 e AJCC 8. com duas exceções. Tis (carcinoma in situ) foi eliminado e a divisão de T4 em subestágios (por exemplo, T4a) foi removida. As principais mudanças estão nos estágios N e, portanto, no estágio clínico geral. N0 permanece o mesmo, mas como com o estágio T, subestágios como N2a foram eliminados. A extensão extracapsular (ECE), também conhecida como extensão extranodal (ENE), que é a invasão do tumor além da cápsula do linfonodo, foi eliminada como critério de estadiamento. [uma]

Isso resulta em um tumor HPV + OPC recebendo um estágio inferior do que se fosse HPV-OPC. Por exemplo, um tumor de 5 cm com um nódulo ipsilateral envolvido que tem 5 cm de tamanho, mas tem ECE seria considerado T3N3bM0 Estágio IVB se HPV-, mas T3N1M0 Estágio II se HPV +. [74]

Evitando exposição Editar

A prevenção de HPV + OPC envolve evitar ou reduzir a exposição a fatores de risco, sempre que possível. [ citação necessária ]

Edição de vacinação

Cerca de 90% dos HPV + OPC carregam o HPV 16 e outros 5% do tipo 18. Esses dois tipos são alvos das vacinas disponíveis. As vacinas contra o HPV administradas antes da exposição podem prevenir a infecção genital persistente e o conseqüente estado pré-canceroso. [11] Portanto, eles têm um potencial teórico para prevenir a infecção oral por HPV. [8] Um estudo de revisão de 2010 descobriu que a infecção oral por HPV16 era rara (1,3%) entre os 3.977 indivíduos saudáveis ​​analisados. [83]

Os objetivos do tratamento são otimizar a sobrevida e o controle loco-regional da doença e prevenir a disseminação para áreas distantes do corpo (metástases), ao mesmo tempo em que minimiza a morbidade a curto e longo prazo. [84] Não há evidência de nível I de alta qualidade de ensaios clínicos prospectivos em HPV + OPC, portanto, as diretrizes de tratamento devem se basear em dados do tratamento de OPC em geral e de alguns subconjuntos não planejados retrospectivos desses estudos, juntamente com dados de cabeça e pescoço câncer em geral. [67] O tratamento para OPC tradicionalmente conta com radioterapia, quimioterapia e / ou outros tratamentos sistêmicos e ressecção cirúrgica. Dependendo do estágio e de outros fatores, o tratamento pode incluir uma combinação de modalidades. [85] A base tem sido a radioterapia na maioria dos casos. [66] uma análise conjunta de estudos publicados sugeriu controle de doença comparável entre radiação e cirurgia, mas taxas de complicações mais altas para cirurgia +/- radiação. [85] [86] Idealmente, uma abordagem de modalidade única é preferida, uma vez que a modalidade tripla está associada a muito mais toxicidade, e uma equipe multidisciplinar em um grande centro com altos volumes de pacientes é recomendada. [67] [87] [12]

As diferenças na resposta ao tratamento entre HPV-OPC e HPV + OPC podem incluir diferenças na extensão e na maneira em que as vias regulatórias do crescimento celular são alteradas nas duas formas de OPC. Por exemplo, em HPV + OPC, os oncogenes HPV E6 e E7 apenas tornam as vias p53 e pRb dormentes, deixando em aberto a possibilidade de reativação dessas vias por regulação negativa (redução) da expressão dos oncogenes. Isto está em contraste com a forma mutante de p53 encontrada no HPV-OPC que está associada à resistência ao tratamento. [11] Além disso, é sugerido que os efeitos de E6 e E7 nessas vias tornam o tumor mais radiossensível, possivelmente por interferência com mecanismos como reparo de DNA, sinalização de repovoamento e redistribuição do ciclo celular. [88] [89] O microambiente também é importante, com a radiação aumentando a resposta imune do hospedeiro aos antígenos virais expressos no tumor. [50] [49] Além disso, há uma associação entre um aumento nos linfócitos infiltrantes de tumor e nos leucócitos circulantes em pacientes com HPV + OPC e melhor prognóstico. Isso implica um papel para um sistema imunológico adaptativo na supressão da progressão do tumor. [90] [91] [89]

Edição de cirurgia

Historicamente, a cirurgia fornecia a abordagem única para o câncer de cabeça e pescoço. O tratamento cirúrgico de OPC carrega morbidade significativa com uma abordagem transcervical (através do pescoço), muitas vezes envolvendo mandibulotomia, na qual o osso da mandíbula (mandíbula) é dividido. Isso é conhecido como uma técnica cirúrgica aberta. Consequentemente, as abordagens cirúrgicas declinaram em favor da radiação. Nos Estados Unidos, o uso de cirurgia diminuiu de 41% dos casos em 1998 para 30% em 2009, ano em que a Food and Drug Administration aprovou o uso das técnicas mais recentes. [92]

Essas melhorias nas técnicas cirúrgicas permitiram que muitos tumores fossem ressecados (removidos) por abordagens cirúrgicas transorais (pela boca) (TOS), usando cirurgia endoscópica transoral de cabeça e pescoço (HNS). [93] Consequentemente, a cirurgia passou a ser mais usada, aumentando para 35% dos casos em 2012. [92] Essa abordagem provou segurança, eficácia e tolerabilidade e inclui duas técnicas principais minimamente invasivas, a cirurgia robótica transoral (TORS) [94] [ 95] [96] [97] [98] [99] e microcirurgia transoral a laser (TLM). [100] [101] [102] Nenhuma comparação direta dessas duas técnicas foi conduzida, e os ensaios clínicos em câncer de cabeça e pescoço, como o ECOG 3311, também permitem. Eles estão associados a uma morbidade pós-operatória substancial, dependendo da extensão da ressecção, mas em comparação com técnicas mais antigas têm internação mais curta, recuperação mais rápida, menos dor e menos necessidade de gastrostomia ou traqueostomia, e menos efeitos de longo prazo, que são mínimos na ausência de radiação pós-operatória (RT) ou quimiorradiação (CRT). [103] [104] O TORS tem a vantagem prática de que telescópios angulares e braços cirúrgicos robóticos rotativos fornecem melhor linha de visão. Os resultados dos procedimentos minimamente invasivos também se comparam favoravelmente com os mais invasivos. Na doença em estágio inicial, incluindo envolvimento dos nódulos cervicais, a TORS produz uma sobrevida de 2 anos de 80–90%. [105] TLM de forma semelhante, é relatado como tendo uma sobrevida em cinco anos de 78% e taxas de controle local de 85–97%. [106] [107] Além da doença precoce, a cirurgia minimamente invasiva tem sido usada em casos avançados, com até 90% de controle local e sobrevida específica da doença. [94] [107] A deglutição pós-operatória foi excelente em 87%, mas a disfagia em longo prazo foi associada a cânceres maiores (T4), especialmente se envolver a base da língua. [107] [12]

Os detalhes da abordagem cirúrgica dependem da localização e do tamanho do tumor primário e de seu estágio N. O esvaziamento do pescoço para examinar os linfonodos de drenagem pode ser realizado simultaneamente ou como um segundo procedimento de estadiamento. Para tumores da amígdala e da parede lateral da faringe, e doença com linfonodo clinicamente negativo (N0), a dissecção do pescoço normalmente envolve níveis 2-4 (veja o diagrama em Dubner 2017) ipsilateralmente. Quando os nódulos estão clinicamente envolvidos, a dissecção dependerá da localização e do tamanho do nódulo ou nódulos. No caso de primários na base da língua, próximo à linha média, a dissecção bilateral é recomendada. [12]

Edição de estadiamento patológico

Uma vantagem de uma abordagem cirúrgica primária é a quantidade de informações patológicas disponibilizadas, incluindo grau, status da margem e grau de envolvimento dos linfonodos. Isso pode alterar o estadiamento, pois até 40% dos pacientes podem apresentar um estágio patológico pós-operatório diferente em relação ao estágio clínico pré-operatório. Em um estudo, 24% tiveram seu estágio reduzido (downstaged), o que pode impactar a tomada de decisão subsequente, incluindo redução de intensidade e morbidade. [108] [12] No Reino Unido, o Royal College of Pathologists (1998) [109] [b] padronizou o relato das margens cirúrgicas, com duas categorias, "mucosas" e "profundas", e para cada grupo criado com base na distância microscópica do câncer invasivo à margem, como segue: mais de 5 mm (claro), 1–5 mm (próximo) e menos de 1 mm (envolvido). [110]

Terapia adjuvante pós-operatória Editar

Os dados sobre o uso de radioterapia pós-operatória (PORT) são amplamente confinados a estudos históricos ou retrospectivos, em vez de ensaios clínicos randomizados de alta qualidade e são baseados na população geral de pacientes com câncer de cabeça e pescoço, ao invés de estudos específicos de HPV + OPC, o que teria formado uma proporção muito pequena da população estudada. [12] Apesar da excisão cirúrgica, nos casos mais avançados, a recorrência local e regional do câncer, juntamente com a disseminação para fora da região da cabeça e pescoço (metástases) são frequentes. O risco de doença recorrente subsequente foi considerado mais alto nos tumores em que a patologia mostra tumor nas margens da ressecção (margens positivas), múltiplos linfonodos regionais envolvidos e extensão do tumor fora da cápsula do linfonodo (extensão extracapsular ), com base na experiência histórica com câncer de cabeça e pescoço. [111] O PORT foi introduzido na década de 1950 em uma tentativa de reduzir a falha do tratamento apenas com a cirurgia. [112] Embora nunca tenha sido testado em um ambiente controlado, o PORT foi amplamente adotado para esse propósito. [113] Em uma análise de falha do tratamento cirúrgico no Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, os pacientes tratados apenas com cirurgia entre 1960-1970 tiveram taxas de falha de 39 e 73% para aqueles com margens cirúrgicas negativas e positivas, respectivamente. Estes foram comparados com aqueles que receberam PORT (com ou sem quimioterapia) de 1975–1980. O último grupo teve menores taxas de falha de 2% e 11%, respectivamente. [114] Além disso, um estudo randomizado da década de 1970 (RTOG 73-03) comparou a radiação pré-operatória com a PORT e encontrou taxas de falha mais baixas com a última. [113] [115]

A adição de outra modalidade de tratamento é referida como terapia adjuvante (literalmente de ajuda), em comparação com seu uso como terapia inicial (primária), também conhecida como terapia radical. Consequentemente, muitos desses pacientes foram tratados com radiação adjuvante, com ou sem quimioterapia. Na série de relatórios acima de cirurgia minimamente invasiva, muitos (30–80%) pacientes receberam radiação adjuvante. No entanto, os resultados funcionais eram piores se a radiação fosse adicionada à cirurgia e piores se a radiação e a quimioterapia fossem usadas. [12] A dosagem de radiação segue amplamente aquela derivada para todos os cânceres de cabeça e pescoço, neste cenário, com base no risco. Historicamente, apenas um ensaio clínico randomizado abordou a dosagem ideal, alocou os pacientes em dois níveis de dosagem, estratificados por risco, mas não mostrou diferença no controle do câncer entre as doses baixas e altas (63 e 68,4 Gy), mas uma maior incidência de complicações no doses mais altas. Consequentemente, a dose mais baixa de 57,6 Gy foi recomendada. [116] [117] Como os autores usaram um esquema de fracionamento de 1,8 Gy por tratamento, essa dosagem não foi amplamente adotada, os médicos preferindo uma fração maior de 2 Gy para produzir um tempo de tratamento mais curto e uma dose ligeiramente maior de 60 Gy em Frações de 2 Gy (30 tratamentos diários). [41] No entanto, 57,6 Gy em frações de 1,8 Gy é equivalente (dose isoefetiva) a apenas 56 Gy em frações de 2 Gy. [118] 60 Gy corresponde a 63 Gy usada como a dose baixa no grupo de alto risco. 60 Gy também foi a dose usada no RTOG 73-03. Posteriormente, houve uma tendência de intensificar o tratamento do câncer de cabeça e pescoço, e vários centros adotaram uma dose de 66 Gy, pelo menos para os pacientes com características tumorais adversas. [119] A eficácia do PORT em HPV + OPC recebe algum apoio de um estudo de coorte (Nível 2b), embora o número de pacientes tenha sido baixo e o número de eventos (doença recorrente ou morte) apenas 7%. [120] Outro estudo retrospectivo em nível de população (Nível 4) do banco de dados SEER (1998-2011) concluiu que houve uma sobrevida global, mas não um efeito de sobrevida específico da doença da radiação em 410 pacientes com um único linfonodo envolvido, mas usado apenas análise estatística univariada e não continha informações sobre o status do HPV. [121] Um estudo subsequente muito maior em uma população semelhante no National Cancer Database (2004-2013) de mais de 9.000 pacientes encontrou uma vantagem de sobrevida, mas isso foi apenas em HPV-OPC, não em 410 pacientes HPV + OPC, [122] e um estudo subsequente de 2.500 pacientes com HPV + OPC de risco baixo e intermediário mostrou sobrevida global semelhante, independentemente de o PORT ter sido administrado ou não. [123]

Edição de Desintensificação

Embora menos estudos tenham sido concluídos examinando a desintensificação (descalonamento) nesse cenário, do que na radiação radical primária para esse câncer (veja abaixo), é uma área de investigação ativa. [124] Em um único estudo de instituição, foi tomada a decisão de reduzir a dose de radiação em pacientes de alto risco com HPV + OPC de 66 para 60 Gy, correspondendo à evidência real, e o acompanhamento não mostrou redução no controle do câncer. [119] Ensaios atuais, tanto na América do Norte quanto na Europa (como ECOG 3311 [c] e PATHOS [d]) usam 50 Gy como o braço de comparação. [126] O comparador de 50 Gy foi escolhido com base em (i) a sensibilidade requintada de HPV + OPC à radiação, ambos em vitro e na Vivo ECOG 1308 mostrando excelente controle da doença em 54 Gy e dados [127] sugerindo que 50 Gy em 1,43 Gy (dose isoeficaz de 43 Gy em 2,0 Gy) foi suficiente para tratar eletivamente o pescoço. [125] Outros estudos, como MC1273 e DART-HPV, avaliaram doses tão baixas quanto 30–36 Gy. [128] A redução da dose de radiação para 54 Gy foi identificada como um dos importantes Avanços Clínicos do Câncer de 2018 pela Sociedade Americana de Oncologia Clínica, sob o tema geral "Menos é mais: Preservando a qualidade de vida com menos tratamento".[129] A quimioterapia tem sido usada concomitantemente com a radiação nesse cenário, como no tratamento primário com radiação radical, particularmente quando as características patológicas indicam um risco maior de recorrência do câncer. Vários estudos sugeriram que isso não melhora o controle local, embora acrescente toxicidade. [130]

Edição de radioterapia

As preocupações sobre a morbidade associada à ressecção cirúrgica aberta tradicional em bloco, levaram à exploração de abordagens alternativas usando radiação. [120] A radioterapia modulada por intensidade (IMRT) pode fornecer um bom controle de tumores primários enquanto preserva excelentes taxas de controle, com toxicidade reduzida para estruturas salivares e faríngeas em relação à tecnologia anterior. HPV + OPC mostrou sensibilidade aumentada à radiação com regressão mais rápida, em comparação com HPV-OPC. [131] Geralmente, a radiação pode ser administrada com segurança apenas ao lado envolvido (ipsilateral), devido à baixa taxa de câncer recorrente no lado oposto (contralateral) e significativamente menos toxicidade em comparação ao tratamento bilateral. [e] [133] [132] IMRT tem uma sobrevida livre de doença de dois anos entre 82 e 90% e uma sobrevida específica da doença de dois anos de até 97% para os estágios I e II. [134] [135]

As toxicidades relatadas incluem boca seca (xerostomia) por danos à glândula salivar, 18% (grau 2) [f] dificuldade para engolir (disfagia) por danos aos músculos constritores, laringe e esfíncter esofágico, 15% (grau 2) aspiração subclínica até 50 % (incidência relatada de pneumonia aspirativa de aproximadamente 14%) hipotireoidismo 28-38% em três anos (pode ser até 55% dependendo da quantidade da glândula tireoide exposta a mais de 45 Gy estenose esofágica de radiação 5% osteonecrose da mandíbula 2,5% e necessidade de um tubo de gastrostomia ser colocado em algum ponto durante ou até um ano após o tratamento 4% (até 16% com acompanhamento mais longo). [12] [137] [135] [138] [139] As preocupações têm sido expressa em relação à toxicidade excessiva em curto e longo prazo, especialmente disfagia e xerostomia, [140] [141] [142] e, portanto, se as doses padrão expõem os pacientes com melhor prognóstico e estão sendo expostos a tratamento excessivo e efeitos colaterais desnecessários. [143] [89]

Edição de Dosimetria

A probabilidade de xerostomia em um ano aumenta em 5% para cada aumento de 1 Gy na dose para a glândula parótida. Doses acima de 25-30 Gy estão associadas a xerostomia moderada a grave. Considerações semelhantes se aplicam à glândula submandibular, mas a xerostomia é menos comum se apenas uma glândula parótida for incluída no campo irradiado [144] e a glândula submandibular contralateral for poupada (menos de 39 Gy) [145] Da mesma maneira, dose de radiação para os músculos constritores da faringe, laringe e canal cricofaríngeo determinam o risco de disfagia (e, portanto, a dependência de alimentação por tubo de gastrostomia). O limite para essa toxicidade é dependente do volume em 55–60 Gy, [146] [147] [148] [89] com comprometimento moderado a grave da deglutição, incluindo aspiração, estenose e dependência de tubo de alimentação acima de uma dose média de 47 Gy , com uma dose recomendada para o constritor inferior de menos de 41 Gy. [149] [150] As relações dose-toxicidade para os constritores superior e médio são acentuadas, com um aumento de 20% na probabilidade de disfagia para cada 10 Gy. [151] Para disfagia tardia, as doses constritoras totais médias limiares, para limitar as taxas maiores ou iguais a grau 2 e 3 abaixo de 5%, foram 58 e 61 Gy, respectivamente. Para disfagia de grau 2, a taxa aumentou 3,4% por Gy. [152] Doses acima de 30 Gy para a tireoide estão associadas a hipotireoidismo moderado a grave. [153] Desfechos subjetivos de qualidade de vida relatados pelo paciente também se correlacionam com a dose de radiação recebida. [141]

Esquemas de fracionamento alterados, como RTOG 9003 [g] [140] e RTOG 0129 [h] não conferiram benefício adicional. [154] [155] As recomendações de dose de radiação foram amplamente determinadas empiricamente em estudos clínicos com poucos pacientes com HPV + OPC e permaneceram inalteradas por meio século, [89] tornando difícil determinar a dose ideal para esse subgrupo. Uma abordagem comum usa 70 Gy bilateralmente e anteriormente, como RTOG 9003 (1991–1997) [140] [154] e RTOG 0129 (2002–2005). [156] [155] Para câncer de amígdala lateralizado, a radiação unilateral do pescoço geralmente é prescrita, mas para os primários da base da língua, a radiação bilateral do pescoço é mais comum, mas a radiação unilateral pode ser usada quando as lesões da base da língua são lateralizadas. [12]

Edição de Desintensificação

Foram expressas preocupações com relação à toxicidade excessiva a curto e longo prazo, especialmente disfagia e xerostomia, [140] [141] [142] e, portanto, se as doses padrão expõem os pacientes com melhor prognóstico a tratamento excessivo e efeitos colaterais desnecessários. [143] [89] Toxicidades atuais foram descritas como "não toleráveis", [157] e, portanto, um intenso interesse na redução da escalada. [126]

Embora a comparação com controles históricos tenha valor limitado em comparação com ensaios clínicos randomizados (fase III), estudos de fase II usando doses reduzidas de radiação em comparação com o padrão histórico de 70 Gy foram realizados. Um estudo usando 54-60 Gy (uma redução de 15-20%, estratificada pela resposta à quimioterapia de indução inicial) demonstrou níveis comparáveis ​​de controle da doença com taxas de complicações muito mais baixas, [89] quando comparados a estudos semelhantes, usando 70 Gy, como ECOG 2399. [158] [159] A porcentagem de pacientes vivos após 2 anos foi de 95% com a dose mais alta e 98% com a dose mais baixa. O mesmo ocorre com a porcentagem livre de doenças (86 e 92%). As toxicidades foram grandemente reduzidas de uma incidência de grau 3 ou maior de disfagia e mucosite de 54 e 53%, respectivamente, para 9%. Uma menor incidência e gravidade da disfagia também significa que menos pacientes precisam de alimentação por gastrostomia. [89] Uma comparação semelhante pode ser feita com os dados combinados de dois estudos RTOG que utilizaram 70 Gy (0129 e 0522). [160]

Nenhuma nova diretriz que trata especificamente de HPV + OPC foi desenvolvida, fora dos ensaios clínicos. Dados indiretos sugerem a eficácia de um tratamento menos intenso. Uma análise retrospectiva do avançado (N +) HPV + OPC sugeriu 96% de controle local de 5 anos com radiação não intensificada de 54 Gy e quimioterapia concomitante à base de cisplatina. [161] As conclusões do par acima de estudos de fase II semelhantes foram apoiadas por vários outros estudos de fase II. Um estudo prospectivo (ECOG 1308) demonstrou controle locorregional semelhante com 54 Gy, [143] e outro estudo, uma alta taxa de resposta patológica completa com 60 Gy. [162] O ensaio Quarterback [i] mostrou resultados comparáveis ​​entre 56 e 70 Gy. [163] e foi seguido pelo Quarterback 2, comparando 50 a 56 Gy. [j] Da mesma forma, o estudo Optima mostrou um bom controle da doença com doses entre 45 e 50 Gy. [164] Estudos em andamento, seguindo a experiência do ensaio da Mayo Clinic (MC1273), [128] como o Memorial Sloan Kettering Cancer Center estão explorando doses tão baixas quanto 30 Gy. Todos esses estudos foram usados ​​bem abaixo da dose padrão anterior de 70 Gy. Uma vez que a toxicidade de longo prazo está associada à dose de radiação, determinar a eficácia de doses mais baixas e, portanto, menos mórbidas de radiação é uma prioridade, uma vez que pode-se esperar que muitos pacientes com HPV + tenham sobrevida em longo prazo. [12]

A radiação é comumente utilizada em combinação com quimioterapia, mas também pode ser usada como uma modalidade única, especialmente em estágios iniciais, e. T1-T2, N0-1 e seu uso em estágios posteriores estão sendo explorados em ensaios clínicos como o RTOG 1333, que compara a radiação isolada à radiação com quimioterapia reduzida, em não fumantes ou não fumantes. [12]

Edição de quimioterapia

Tal como acontece com os dados da radioterapia, a maior parte do conhecimento disponível sobre a eficácia da quimioterapia deriva do tratamento de câncer avançado de cabeça e pescoço, em vez de estudos específicos de HPV + OPC. Desde 1976, muitos estudos clínicos compararam a TRC à RT isolada no tratamento primário de cânceres de cabeça e pescoço localmente avançados e demonstraram uma vantagem da TRC tanto na sobrevida quanto no controle loco-regional. [165] [166] A cisplatina é considerada o agente padrão e uma vantagem de sobrevida foi observada para os pacientes que receberam radiação com cisplatina concomitante. [167] Apesar disso, nenhum ensaio comparando diretamente a cisplatina com outros agentes neste contexto foi realizado. O outro agente amplamente utilizado é o cetuximabe, um anticorpo monoclonal direcionado ao receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR). Uma vantagem de sobrevivência de 10% em três anos foi observada quando o cetuximabe foi administrado simultaneamente com a radiação (bioradiação). [168] Os ensaios com cetuximabe foram concluídos antes do conhecimento do status do HPV. [169] Os estudos laboratoriais e clínicos sobre a utilidade do cetuximabe neste contexto são conflitantes. A principal toxicidade é uma erupção acneiforme, mas não foi comparada diretamente à cisplatina em HPV + OPC, até RTOG 1016 (ver falar) abordou esta questão. [12] [163] A análise dos resultados três anos após a conclusão do ensaio demonstra que o cetuximabe é inferior à cisplatina. [170] A quimioterapia concomitante também é superior à quimioterapia isolada (quimioterapia de indução) seguida por radiação. [165] [12] O cetuximabe não mostra nenhuma vantagem quando adicionado à cisplatina em combinação com a radiação. [142] Embora a quimiorradiação tenha se tornado um padrão de tratamento com base em ensaios clínicos e, em particular, metanálises, um estudo populacional subsequente de pacientes com OPC, não indicou nenhuma vantagem para a adição de quimioterapia à radiação em HPV + OPC ou HPV-OPC , [171] e preocupações significativas sobre toxicidade adicionada. [172]

A quimioterapia também tem um papel, combinada com a radiação, no cenário pós-operatório (terapia adjuvante). [173] Geralmente é usado quando a patologia da amostra ressecada indica características associadas a alto risco de recorrência loco-regional (por exemplo, extensão extracapsular através de linfonodos envolvidos ou margens muito próximas). Ele mostrou uma melhor sobrevida livre de doença e controle loco-regional em dois ensaios clínicos muito semelhantes em tais pacientes de alto risco, EORTC 22931 (1994–2000) [111] e RTOG 9501 (1995–2000). [l] [m] [n] [174] [175] [176] No entanto, para pacientes com HPV + OPC, essa disseminação extracapsular não parece ser um fator adverso [177] [178] [179] e a adição de a quimioterapia à radiação neste grupo não forneceu nenhuma vantagem adicional. [178] Como o tamanho da amostra para detectar uma vantagem de sobrevivência é grande, dado o pequeno número de eventos neste grupo, esses estudos podem ter sido insuficientes e a questão da utilidade de adicionar quimioterapia está sendo abordada em um ensaio clínico randomizado (ADEPT ) com controle locorregional de dois anos e sobrevida livre de doença como ponto final. [o] A adição de quimioterapia à radiação aumenta a toxicidade aguda e tardia. No estudo GORTEC, a quimioterapia com docetaxel proporcionou maior sobrevida e controle loco-regional em OPC localmente avançado, mas foi associada a aumento da mucosite e necessidade de alimentação por gastrostomia. [180] Quimioterapia e radiação estão associadas a um risco de morte de 3–4% neste contexto. [181] Não está claro se a toxicidade adicional da adição de quimioterapia à radiação é compensada por um benefício clínico significativo no controle da doença e na sobrevida. [12]

Pensa-se que os pacientes HPV + OPC se beneficiam melhor da radioterapia e do tratamento concomitante com cetuximabe do que os pacientes HPV-OPC recebendo o mesmo tratamento, [182] e que a radiação e a cisplatina induzem uma resposta imune contra um tumor antigênico que aumenta seu efeito nas células cancerosas . [49] Embora a incidência de positividade para HPV seja baixa (10-20%), uma vantagem para HPV + OPC foi observada em ensaios de cetuximabe e panitumumabe, um agente anti-EGFR semelhante, mas não uma interação consistente com o tratamento, embora HPV + OPC parece não se beneficiar na mesma medida que HPV-OPC para terapia anti-EGFR de segunda linha, possivelmente devido à menor expressão de EGFR em HPV + OPC. [169]

Escolha da abordagem de tratamento Editar

Na ausência de evidências de alta qualidade comparando uma abordagem cirúrgica primária com outras modalidades, as decisões são baseadas na consideração de fatores como exposição cirúrgica adequada e características anatomicamente favoráveis ​​para ressecção adequada, função pós-tratamento e qualidade de vida. Essa seleção de pacientes pode permitir que eles evitem a morbidade do tratamento adjuvante adicional. Na ausência de características cirúrgicas favoráveis, o tratamento primário de escolha continua sendo a radiação com ou sem quimioterapia. As características do tumor que favorecem uma abordagem não cirúrgica incluem invasão da base da língua a ponto de exigir ressecção de 50% ou mais da língua, envolvimento do músculo pterigóide, extensão para a gordura parafaríngea adjacente à carótida, envolvimento da mandíbula ou maxila ou invasão do espaço pré-vertebral. [12]

A adequação da ressecção cirúrgica é um fator importante na determinação do papel da terapia adjuvante pós-operatória. Na presença de uma margem positiva no exame patológico, a maioria dos oncologistas de radiação recomenda radiação para o local primário e quimioterapia concomitante. Uma margem negativa tem maior probabilidade de ser tratada com doses mais baixas e um volume de tratamento menor. Além disso, a remoção de um tumor volumoso pode permitir uma dosagem reduzida para estruturas faríngeas adjacentes não envolvidas e, portanto, menos efeito na deglutição normal. [75] [12]

Os desfechos do câncer (controle local, controle regional e sobrevida) para ressecção transoral seguida de terapia adjuvante são comparáveis ​​à quimiorradiação primária, [101] [97] [138] para que as decisões de tratamento dependam mais da morbidade relacionada ao tratamento, resultado funcional, e qualidade de vida. Os fatores do paciente também precisam ser levados em consideração, incluindo funcionalidade basal geral, histórico de tabagismo, risco de anestesia, função orofaríngea, deglutição e proteção das vias aéreas e potencial para reabilitação. A preferência do paciente é igualmente importante. Muitos ensaios clínicos estão em andamento com foco na desintensificação, muitas vezes com estratificação de risco, e. Risco baixo, intermediário e alto (ver Fundakowski e Lango, Tabela I) [12] [p]

As decisões clínicas também levam em consideração as morbidades, particularmente se os resultados do câncer forem comparáveis, por exemplo, a cirurgia está associada a um risco de sangramento entre 5–10% e um risco de 0,3% de hemorragia pós-operatória fatal. [102] [183] ​​[98] [99] A cirurgia também pode ser complicada por disfagia e, embora a maioria dos pacientes possa tolerar uma dieta no primeiro dia pós-operatório, o uso em longo prazo de um tubo de alimentação foi relatado em até 10%. [107] [98] [99] Pacientes com tumores maiores, envolvimento da base da língua e necessidade de terapia adjuvante pós-operatória têm maior probabilidade de necessitar de sonda de alimentação de longo prazo. [184] [185] No geral, a função e a qualidade de vida parecem relativamente semelhantes entre a cirurgia com radiação pós-operatória e quimiorradiação primária, [186] [187] [12] mas os pacientes com HPV + OPC tendem a ter melhor qualidade de vida no diagnóstico do que HPV-OPC, mas pode sofrer uma perda maior após o tratamento. [188]

As considerações anatômicas também podem ditar a preferência por abordagens cirúrgicas ou não cirúrgicas. Por exemplo, trismo, língua volumosa, extensão limitada do pescoço, dentes proeminentes, toro da mandíbula (um crescimento ósseo na mandíbula) ou largura limitada da mandíbula seriam todas contra-indicações relativas à cirurgia. [100] As considerações relacionadas ao tumor incluem invasão da mandíbula, base do crânio e extenso envolvimento da laringe ou mais da metade da base da língua. [101] Considerações técnicas na oferta de cirurgia como modalidade primária incluem a capacidade presumida de atingir margens adequadas na amostra ressecada e o grau de defeito resultante, uma vez que margens fechadas ou positivas provavelmente resultarão em terapia adjuvante subsequente para alcançar o controle da doença, com morbidade aumentada resultante. Os custos são difíceis de estimar, mas um estudo norte-americano, baseado em estimativas de 25% de todos os pacientes com OPC que receberam cirurgia isolada e 75% cirurgia seguida de terapia adjuvante, usando os critérios do NCCN, descobriu que essa abordagem era menos cara do que a quimiorradiação primária. [189] [190] [191]

A doença em estágio inicial [q] está associada a um resultado relativamente favorável, para o qual a terapia de modalidade única é recomendada, a escolha dependendo da localização do tumor e acessibilidade. Por exemplo, os tumores da tonsila unilateral ou da base da língua geralmente serão tratados com ressecção transoral e esvaziamento cervical ipsilateral seletivo. Por outro lado, uma grande lesão na linha média da língua exigiria esvaziamento cervical bilateral, mas na ausência do que é considerado patologia adversa (margens positivas, extensão extracapsular) provavelmente será tratada apenas por cirurgia ou radiação, incluindo campos de radiação ipsilateral ou bilateral no pescoço, com cirurgia para os casos em que a probabilidade de terapia adjuvante é baixa. [12]

Mas muitos HPV + OPC apresentam envolvimento dos gânglios linfáticos no pescoço e, portanto, um estágio mais avançado da doença, geralmente referido como doença localmente avançada. Este grupo é tratado principalmente com terapia multimodal, com exceção de um dos subgrupos mais favoráveis ​​com pequenos tumores primários e envolvimento de linfonodos confinados a um único linfonodo não maior que 3 cm de tamanho, que, como observado, são considerados doença em estágio inicial. As três opções principais para doença localmente avançada, mas operável, são ressecção, esvaziamento cervical e quimiorradiação de terapia adjuvante (com possível cirurgia de resgate), quimioterapia de indução seguida por radiação ou quimiorradiação. No entanto, a última opção não foi apoiada em ensaios clínicos que a testaram. [r] A principal consideração da cirurgia para doença localmente avançada é obter margens negativas adequadas e poupar o paciente de quimiorradiação pós-operatória. Mas isso deve ser balanceado contra a morbidade e perda funcional da ressecção extensa, particularmente quando a base da língua está envolvida. Para evitar tal morbidade, a quimiorradiação primária é preferida. O manejo da doença nos linfonodos cervicais deve ser levado em consideração no tratamento da doença localmente avançada. As diretrizes para todos os OPC determinam que a extensão ectracapsular receba quimiorradiação pós-operatória. Quando a doença cervical macroscópica é evidente inicialmente, geralmente é administrada quimiorradiação primária. [12]

Preferências do paciente Editar

As diretrizes atuais são baseadas em dados para OPC como um todo, de modo que os pacientes geralmente estão sendo tratados independentemente do status do HPV, embora muitos médicos e pesquisadores estejam considerando a desintensificação. [194] É provável que o tratamento dessa condição continue a evoluir na direção da desintensificação, a fim de minimizar a perda de função, mas manter o controle da doença.[195] Na ausência de ensaios clínicos e diretrizes específicos, as preferências do paciente devem ser levadas em consideração para minimizar a toxicidade e a perda funcional de curto e longo prazo e otimizar a qualidade de vida, dada a sobrevida prolongada frequentemente observada. [12] Isso pode envolver a exploração dos valores dos pacientes em relação às compensações entre o controle da doença e os efeitos adversos do tratamento. Os pacientes que receberam CRT como tratamento primário para OPC colocam um alto valor na sobrevivência e, embora concordem que a desintensificação é desejável, relutam em trocar muitas vantagens de sobrevivência por menor toxicidade, embora sejam mais propensos a renunciar à quimioterapia do que aceitar radiação reduzida. [196]

Carcinoma de primária desconhecida Editar

Em algumas situações, HPV + OPC pode se apresentar com linfonodos cervicais, mas sem doença evidente de um tumor primário (T0 N1-3) e, portanto, é classificado como Carcinoma de células escamosas de origem primária desconhecida. Ocorre em 2 a 4% dos pacientes que apresentam câncer metastático nos nódulos cervicais. A incidência de positividade para HPV está aumentando em uma taxa semelhante à observada em OPC. Nessas situações, a ressecção das tonsilas linguais e palatinas associada ao esvaziamento cervical pode ser diagnóstica e constituir intervenção suficiente, visto que as taxas de recorrência são baixas. [197] [198] [199] [200] [201] [12] [ citações excessivas ]

A presença de HPV dentro do tumor é considerada um fator importante para predizer a sobrevida desde a década de 1990. [202]

Comparação com câncer orofaríngeo HPV-negativo Editar

O status do HPV do tumor está fortemente associado à resposta terapêutica positiva e à sobrevida em comparação com o câncer HPV-negativo, independentemente da modalidade de tratamento escolhida e mesmo após ajuste para o estágio. [203] Embora os pacientes com HPV + OPC tenham uma série de características demográficas favoráveis ​​em comparação com os pacientes com HPV-OPC, essas diferenças são responsáveis ​​por apenas cerca de dez por cento da diferença de sobrevida observada entre os dois grupos. [11] As taxas de resposta de mais de 80% são relatadas no câncer HPV + e a sobrevida livre de progressão de três anos foi relatada como 75–82% e 45–57%, respectivamente, para o câncer HPV + e HPV-, e melhorando ao longo do tempo. [12] [204] [205] [206] É provável que o HPV + OPC seja inerentemente menos maligno que o HPV-OPC, uma vez que os pacientes tratados apenas por cirurgia têm uma sobrevida melhor após o ajuste para o estágio. [11]

Determinantes da sobrevivência Editar

No ensaio clínico RTOG 0129, [s] em que todos os pacientes com doença avançada receberam radiação e quimioterapia, uma análise retrospectiva (análise de partição recursiva ou RPA) em três anos identificou três grupos de risco para sobrevivência (baixo, intermediário e alto) com base no status do HPV, tabagismo, estágio T e estágio N (Vejo Ang et al., Fig. 2). [156] O status do HPV foi o principal determinante da sobrevida, seguido pela história de tabagismo e estágio. 64% eram HPV + e todos estavam no grupo de risco baixo e intermediário, com todos os pacientes HPV + não fumantes no grupo de baixo risco. 82% dos pacientes com HPV + estavam vivos em três anos em comparação com 57% dos pacientes com HPV-, uma redução de 58% no risco de morte. [t] [156] A falha loco-regional também é menor no HPV +, sendo 14% em comparação com 35% para o HPV-. [159]

Determinantes da progressão da doença Editar

A positividade para HPV confere um risco 50–60% menor de progressão da doença e morte, mas o uso de tabaco é um fator prognóstico negativo independente. [156] [207] Uma análise agrupada de pacientes HPV + OPC e HPV-OPC com progressão da doença em ensaios RTOG 0129 e 0522 mostrou que, embora menos HPV + OPC experimentou progressão da doença (23 v. 40%), o tempo médio até a doença a progressão após o tratamento foi semelhante (8 meses). A maioria (65%) das recorrências em ambos os grupos ocorreu no primeiro ano após o tratamento e foram loco-regionais. Embora a taxa de falha no pescoço oposto após o tratamento de apenas um lado seja de 2,4%, a taxa de recorrência isolada no pescoço oposto é de 1,7%, e ocorreram principalmente onde o tumor primário envolvia a linha média. No entanto, a taxa de falha no pescoço contralateral também é maior para HPV +. [208] Daqueles que reaparecem neste local, quase todos foram tratados com sucesso (recuperados) por tratamento local adicional no pescoço oposto. [132]

Determinantes das taxas de metástase Editar

O HPV + não reduziu a taxa de metástases (cerca de 45% dos pacientes com progressão), que são predominantemente nos pulmões (70%), embora alguns estudos relatem uma taxa mais baixa. [209] [160] com taxas de recorrência à distância de 3 anos de cerca de 10% para pacientes tratados com radiação primária ou quimiorradiação. [210] Mesmo se ocorrer recorrência ou metástases, a positividade para HPV ainda confere uma vantagem. [12] [209] [211] Em contraste, o uso de tabaco é um fator prognóstico negativo independente, com diminuição da resposta à terapia, [156] [207] aumento das taxas de recorrência da doença e diminuição da sobrevida. [212] Os efeitos negativos do fumo aumentam com a quantidade fumada, principalmente se for maior que 10 anos-maço. [156] [207]

Preditores de sobrevivência Editar

Após a quimiorradiação Editar

Para pacientes como aqueles tratados com RTOG 0129 com quimiorradiação primária, nomogramas detalhados foram derivados desse conjunto de dados combinado com RTOG 0522, permitindo a previsão do resultado com base em um grande número de variáveis. Por exemplo, um colegial casado com 71 anos, não fumante e graduado no ensino médio com um status de desempenho (PS) de 0, sem perda de peso ou anemia e um T3N1 HPV + OPC esperaria ter uma sobrevida livre de progressão de 92% em 2 anos e 88% em 5 anos. Um solteiro de 60 anos, não-fumante, formado no ensino médio com um PS de 1, perda de peso e anemia e um T4N2 HPV + OPC teria uma expectativa de sobrevivência de 70% em dois anos e 48% em cinco anos. [213]

Após a cirurgia Editar

Informações menos detalhadas estão disponíveis para aqueles tratados principalmente com cirurgia, para os quais menos pacientes estão disponíveis, [120] bem como baixas taxas de recorrência (7–10%), mas recursos que têm sido tradicionalmente úteis na previsão do prognóstico em outras cabeças e cânceres de pescoço parecem ser menos úteis em HPV + OPC. [51] Esses pacientes são frequentemente estratificados em três grupos de risco: [92]

  • Baixo risco: Sem características patológicas adversas
  • Risco intermediário: T3 – T4 invasão primária, perineural ou linfovascular, N2 (AJCC 7) [a]
  • Alto risco: margens positivas, ECE

Desenvolvimento de outros cânceres Editar

Pacientes com HPV + OPC são menos propensos a desenvolver outros tipos de câncer, em comparação com outros pacientes com câncer de cabeça e pescoço. [30] Uma possível explicação para o impacto favorável do HPV + é "a menor probabilidade de ocorrência de amplificação do gene 11q13, que é considerada um fator subjacente à recorrência mais rápida e mais frequente da doença" [14] marcador para HPV-OPC, está associado a pior prognóstico. [8] Acredita-se que a coloração de p16 de alto grau seja melhor do que a análise de PCR de HPV na previsão da resposta à radioterapia. [63]

Recorrência regional após a cirurgia Editar

O risco de recorrência regional do câncer após o esvaziamento cervical é frequentemente estimado [163] a partir de uma grande série baseada em todos os cânceres de células escamosas aerodigestivas superiores. Nesta série, os riscos gerais em três anos por estágio patológico (AJCC 7) foram: [214]

Em 2015, o câncer de células escamosas da região de cabeça e pescoço foi o quinto câncer mais comum além do câncer de pele, globalmente, com uma incidência anual de 600.000 casos e cerca de 60.000 casos anualmente nos Estados Unidos e na Europa. [215] A incidência global de câncer de faringe em 2013 foi estimada em 136.000 casos. [12] [216] [217] Para 2008, a Carga Global de Doenças para OPC em 2008 é estimada em 85.000 casos, dos quais 22.000 foram atribuíveis ao HPV, uma fração atribuível populacional (PAF) de 26%. Destes, 17.000 eram do sexo masculino e 4.400 do feminino, 13.000 (60%) tinham entre 50 e 69 anos e a maioria dos casos (15.000) ocorreram em regiões desenvolvidas em comparação com as regiões em desenvolvimento (6.400). [218] [2] As taxas de incidência padronizadas por idade (ASR) diferem consideravelmente por região e país (Vejo de Martel et al., 2017 Fig. 2b). [218] ASRs para 2012 foram mais altos na Europa (Hungria 3.0) e América do Norte (Estados Unidos 1.7), mas muito mais baixos na África (≤ 0,3), Ásia (≤ 0,6), América Latina (≤ 0,4) e Oceania (≤ 0,2) (exceto Australásia, Austrália 0,9). [219] [218] Os números médios estimados de casos e ASR para os EUA no período de 2008 a 2012 foram de 15.738 e 4,5, respectivamente. HPV + OPC foi muito mais comum em homens do que mulheres (12.638, 7,6 e 3.100, 1,7). A faixa etária de maior incidência foi de 60-69 anos e foi maior em caucasianos do que em outras raças. [220]

Os pacientes com HPV + OPC tendem a ser mais jovens do que os pacientes com HPV em geral. [221] A apresentação clínica também está mudando do paciente "típico" com câncer de cabeça e pescoço com idade avançada e uso de substâncias importantes. [12] Por outro lado, os pacientes com câncer de HPV + são mais jovens (4ª a 6ª décadas), do sexo masculino (proporção 8: 1) com nenhum ou apenas um histórico mínimo de tabagismo, geralmente caucasianos, atingiram níveis de escolaridade mais altos, são casados ​​e têm renda mais alta . [222] Os fatores de risco para HPV-OPC e HPV + OPC tendem a ser independentes, com exceção do tabagismo, que tem um efeito adverso em ambos. [11] Os recursos de apresentação também são diferentes entre HPV + e HPV-OPC. Os tumores HPV + têm lesões primárias menores (menos de 4 cm), mas doença nodal mais avançada, resultando em estadiamento TNM mais alto. Isso, por sua vez, pode superestimar a gravidade do estado da doença. [223] [224]

Tendências Editar

Tem havido uma tendência global de aumento da incidência de OPC, particularmente na América do Norte e no norte da Europa, mas mesmo em Taiwan, que tem uma taxa muito alta para todos os cânceres da região de cabeça e pescoço, as taxas de OPC aumentaram mais rapidamente entre 1995 e 2009 do que qualquer outro local de câncer. [225] [226] A carga global de HPV + OPC aumentou de 22.000 em 2008 para 29.000 em 2012, e o PAF de 26% para 31%, [218] e é considerado uma epidemia. [44] Nos Estados Unidos, o número estimado de casos foi de 12.410 em 2008, [227] 13.930 em 2013 [228] e 17.000 em 2017. [229] Desses casos, o câncer de HPV + tem aumentado em comparação com o câncer de HPV, mas o aumento em HPV + OPC excede o declínio em HPV-OPC resultando em um aumento geral em OPC. [11] O aumento na incidência de câncer de faringe contrasta com um declínio marginal em outros cânceres de cabeça e pescoço. [230] Como resultado, o câncer mais comum de cabeça e pescoço mudou da laringe para a orofaringe. [120] Uma pesquisa de 23 países entre 1983 e 2002 mostrou um aumento no carcinoma de células escamosas da orofaringe que foi particularmente notável em homens jovens em países economicamente desenvolvidos. [217] [12] No Reino Unido, a incidência de câncer oral e orofaríngeo em homens aumentou 51%, de 7 / 100.000 para 11 / 100.000 entre 1989 e 2006. [230] Nos EUA, há uma incidência crescente de HPV associado câncer orofaríngeo, [231] No início de 1980, o HPV + era responsável por apenas 7,5% dos casos nos EUA, mas em 2016 isso era 70%, [12] [232] [233] [234] talvez como resultado da mudança de comportamentos sexuais, diminuição da popularidade das tonsilectomias, melhor avaliação radiológica e patológica e mudanças na classificação. [235] [236] [237] Os cânceres de amígdala e orofaríngeo aumentaram na predominância masculina entre 1975 e 2004, apesar das reduções no tabagismo. [238] HPV-OPC diminuiu com a diminuição das taxas de tabagismo de 1988 a 2004, enquanto HPV + OPC aumentou quase 7,5% ao ano de cerca de 16% de todos os casos de OPC no início dos anos 1980 para quase 70% em 2004. [222] [239] O declínio do tabagismo pode estar relacionado à diminuição da proporção de cânceres HPV negativos, enquanto as mudanças na atividade sexual podem ser refletidas no aumento da proporção de cânceres HPV positivos. [222] Recentemente, nos EUA, a OPC associada ao HPV representa cerca de 60% dos casos de OPC [159] [240] em comparação com 40% na década anterior. [230] Em 2007, nos EUA, a incidência de OPC geral, incluindo não associada ao HPV, é de 3,2 casos por 100.000 homens / ano e 1,9 por 100.000 todos os sexos / ano. [241] Isso torna o HPV + OPC um dos cinco cânceres que aumentaram em incidência nos EUA desde 1975. [242] O maior aumento na incidência ocorreu em pacientes com menos de 50 anos. [243]

O aumento na incidência de OPC associado ao HPV também é observado em outros países, como a Suécia, com uma incidência de mais de 80% em 2007 para câncer nas amígdalas, [244] [245] Finlândia [246] e República Tcheca. [247] Parceiros de pacientes com câncer orofaríngeo positivo para HPV não parecem ter infecção por HPV oral elevada em comparação com a população em geral. [248] Na Austrália, a incidência de OPC associada ao HPV foi de 1,56 casos por 100.000 homens / ano (2001–2005), aumentando de 19% (1987–90) para 47% (2001–05) e 63,5% (2006–2010 ) [249] [40] No Canadá, a porcentagem de casos de OPC atribuíveis ao HPV aumentou de 47% em 2000 para 74% em 2012. [250]


HPV de alto risco prejudica a via de recombinação homóloga

Quase todos os cânceres cervicais são causados ​​por infecções por alfa-papilomavírus (αHPV) de alto risco. As infecções por HPV também podem causar tumores em outras áreas do trato genital ou da orofaringe e geralmente levam décadas para se desenvolver. Os tumores tornam-se altamente instáveis ​​geneticamente à medida que progridem, e acredita-se que grande parte dessa instabilidade seja causada por dois oncogenes HPV, HPV E6 e E7. A proteína E6 viral promove a degradação do supressor de tumor p53, enquanto E7 inativa o pRB, um regulador chave do ciclo celular, levando a célula a uma entrada desregulada na fase S. Tanto o p53 quanto o pRB são necessários para interromper o ciclo celular e reparar os danos ao DNA, portanto, supõe-se que os oncogenes E6 e E7 interrompam o reparo do DNA. Além disso, foi demonstrado que E6 e E7 interagem com BRCA1, uma proteína chave no reparo de quebra de fita dupla (DSB). No entanto, o mecanismo pelo qual E6 e E7 interrompem o reparo do DNA não foi estabelecido. Neste artigo do Laboratório da Dra. Denise Galloway (Divisão de Biologia Humana), o autor principal Dr. Nick Wallace (agora professor na Universidade Estadual do Kansas) e colegas demonstram como E6 e E7 prejudicam o reparo de DNA de fita dupla por meio de vários mecanismos.

Os autores mostraram pela primeira vez que os oncogenes HPV16 E6 e E7 interrompem o reparo de DSB em queratinócitos humanos. HPV16 é o HPV oncogênico mais comum e o tipo usado para esta publicação daqui em diante, E6 e E7 se referirá a HPV16 E6 e E7. Os pesquisadores expressaram os genes E6 e E7 simultaneamente e separadamente e descobriram que as células com um ou ambos os genes expressos tinham níveis mais elevados de fosfo-H2AX (p-H2AX), um marcador de DSBs. Além disso, quando irradiaram as células para causar mais danos ao DNA, as células de controle repararam os DSBs muito mais rápido do que as células que expressam E6 e / ou E7. Os focos de P-H2AX se resolveram nas células controle em cerca de 4 horas, enquanto as células que expressam E6 e E7 levaram até 24 horas, e mesmo assim, o p-H2AX permaneceu.

O reparo do DSB pode ocorrer de duas maneiras. Se uma sequência homóloga estiver presente, a recombinação homóloga (HR) pode ocorrer usando a fita ininterrupta como modelo. Se nenhuma sequência homóloga estiver presente, a união final não homóloga é a alternativa, em que as fitas são fundidas novamente, deixando mais espaço para erros. Usando uma linha de células U2OS (uma linha de células de osteossarcoma ósseo) modificada com um cassete repórter DR-GFP que só expressa GFP se o reparo de HR estiver funcionando corretamente, os autores mediram a HR em células que expressam E6 e E7 e descobriram que estava prejudicada, especialmente quando E6 foi expresso. A expressão de E6 sozinho prejudicou a HR em 50%.

O Laboratório Galloway relatou anteriormente que nos vírus β-HPV de menor risco, o E6 interrompe a HR ao diminuir a expressão de BRCA1 e BRCA2. Os autores testaram essa possibilidade, mas descobriram que a abundância das proteínas HR BRCA1, BRCA2, RAD51 e RPA70 não foram alteradas ou aumentadas nas células que expressam um ou ambos os oncogenes virais. A regulação positiva de várias proteínas HR após a expressão de E6 e E7 sugere que a via de HR poderia ser regulada positivamente em tumores HPV + do paciente. Os autores analisaram a expressão de mRNA de genes de reparo de HR de 86 HPV + tecido tumoral cervical e 58 amostras de controle saudáveis ​​do banco de dados NCBI Gene Expression Omnibus (GEO). Eles descobriram que os níveis de expressão de mRNA de genes de reparo de HR eram significativamente maiores no tecido de malignidade cervical, confirmando uma regulação positiva da via de HR em tumores HPV +.

Uma vez que a expressão das proteínas HR não foi prejudicada, os autores investigaram a seguir a cinética da formação do complexo de reparo de HR para determinar se os complexos estavam ativos. A formação do complexo de reparo HR não foi prejudicada após a expressão de E6 ou E7, conforme observado por microscopia de imunofluorescência (IF). Para entender melhor o que estava acontecendo nesses complexos de reparo, os autores analisaram a relação cinética entre as proteínas HR. Eles compararam o momento do recrutamento de RPA70, RAD51, BRCA1 e BRCA2 com o que é relatado na literatura e não encontraram alterações significativas indicativas de comprometimento do complexo de reparo quando os oncogenes do HPV foram expressos.

Se a expressão das proteínas HR e a formação do complexo de reparo não forem prejudicadas, E6 e E7 devem interromper o reparo DSB por outro mecanismo. A recombinação homóloga depende da disponibilidade de uma sequência homóloga e, portanto, só pode ser concluída nas fases S e G2 do ciclo celular. Os autores levantaram a hipótese de que a expressão de E6 e E7 estava de alguma forma causando a formação de focos de reparo durante a parte errada do ciclo celular. Eles usaram microscopia IF para examinar em qual parte do ciclo celular os focos de RPA estavam se formando. A ciclina A foi utilizada como marcador das fases S e G2 e a ciclina E para o G1. Os focos de RPA se formaram com muito mais frequência em células negativas para ciclina A quando E6 e E7 foram expressos, sugerindo que os focos de reparo estavam se formando em G1 quando nenhuma sequência homóloga estava presente. Isso foi confirmado por citometria de fluxo.

Enquanto investigavam a formação do complexo de reparo, os pesquisadores notaram a expressão de RAD51 sustentada por muito tempo após a irradiação. Isso sugeriu que o RAD51 pode estar formando complexos de reparo improdutivos ao se localizar longe dos DSBs. Usando microscopia IF, os autores determinaram que 50-60% de RAD51 parecia estar localizado longe de focos de p-H2AX. Os autores então criaram um único DSB persistente em células U2OS e rastrearam o recrutamento RAD51. Em células que expressam E6, RAD51 foi recrutado apenas 50% do tempo para o DSB em comparação com as células de controle. Em células que expressam E7, RAD51 foi localizado corretamente na maioria das células, sugerindo que este fenótipo é dirigido por E6.

O genoma viral é denominado epissoma. Para o HPV, é uma sequência circular de DNA de fita dupla. A integração desse epissoma é uma etapa limitadora da taxa comum em doenças malignas associadas ao HPV. Para que o epissoma seja integrado ao genoma do hospedeiro, tanto o DNA do hospedeiro quanto o epissoma devem incorrer em DSBs.Os autores descobriram que o epissoma viral foi integrado ao genoma do hospedeiro em uma taxa mais alta nas células que expressam E6 do que nas células de controle. Provavelmente, isso se deve ao fato de que os DSBs foram mais prevalentes nas células que expressam o oncogene e os DSBs oferecem uma oportunidade maior de integração epissomal.

Os oncogenes do HPV alteram a resposta celular às quebras de DNA de cadeia dupla: os HPV E6 e E7 promovem a recombinação homóloga durante os pontos do ciclo celular em que a via não pode ser concluída devido à falta da cromátide irmã. Isso sugere que as proteínas virais inibem a via de junção de extremidades não homólogas. Além de prejudicar a recombinação homóloga ao permitir que a via se inicie durante o G1, o HPV E6 também atenua esse reparo diretamente pela localização incorreta de RAD51 de lesões de DNA. Cortesia gráfica do Dr. Nick Wallace.

Este artigo fornece uma nova estrutura mecanística para a interrupção do oncogene HPV16 E6 e E7 do reparo DSB, levando ao aumento da instabilidade do genoma em doenças malignas do HPV + (Figura 1). “Este trabalho foi feito exclusivamente em células que expressam oncogenes do HPV 16, mas as implicações são provavelmente mais amplas”, diz o primeiro autor, Dr. Nicholas Wallace. “A maioria dos cânceres associados ao HPV é causada por um de dois HPVs (HPV 16 e HPV 18). Esses HPVs são notavelmente semelhantes, especialmente no que diz respeito à dependência de máquinas de reparo de DNA para replicar seus genomas. Especulamos que a desregulação da recombinação homóloga descrita aqui seria compartilhada entre o HPV 16 e 18. Se estivermos corretos, a maioria dos cânceres HPV + terá uma capacidade reduzida de reparar quebras de DNA de fita dupla por meio da via de recombinação homóloga. ”

O trabalho descrito neste artigo demonstra um importante potencial terapêutico. Como explica Nicholas Wallace, "Como os tumores de mama e ovário com defeitos na via [do reparo homólogo] são extremamente sensíveis a uma classe de quimioterápicos conhecidos como inibidores de PARP, temos esperança de que nosso trabalho apoiará o uso dessas drogas contra o HPV associado cânceres. ”

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O financiamento para este trabalho foi fornecido pelo National Cancer Institute e pelo National Institute of General Medical Sciences.


O material eletrônico suplementar está disponível online em https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.c.3917971.

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Fundo

Vírus do papiloma humano A família (HPV) agrupa um número heterogêneo de vírus capazes de infectar epitélios estratificados escamosos e causar papilomas benignos, verrugas e lesões anogenitais, dependendo do genótipo viral, tempo de persistência e possível integração no genoma do hospedeiro eucariótico. O vírus também se correlaciona com doenças malignas da orofaringe, aumentando fortemente devido às mudanças de comportamento sexual [1].

A vacina contra o HPV, a primeira desenvolvida em 1991, até agora representa, com suas formulações 2, 4 e 9 valentes, a melhor forma de prevenir e controlar a infecção e a progressão do câncer genital que são mediadas principalmente por HPV 16 e 18 de alto risco oncoproteínas. Dez anos de ensaios clínicos de fase III revelaram sua eficácia ideal com taxas de sucesso variando de 90 a 100%, embora sejam confirmados por um período geral de 20 anos de evidências clínicas [2, 3].

Apesar disso e das medidas de rastreamento rigorosas, o câncer anogenital, promovido principalmente pela superexpressão das oncoproteínas α-HPV16 E6 e E7 de alto risco que desestabilizam o genoma do hospedeiro ao longo do tempo após a infecção primária [4,5,6], ainda representa o quarto tumor mais comum e segunda maior causa de morte entre mulheres no mundo, com cerca de mais de 5 mil casos novos / ano, conforme evidenciado pela Organização Mundial da Saúde (OMS).

A fidelidade da replicação celular é o resultado do DDR do host. Ao contrário de muitos vírus de DNA que promovem seu ciclo de vida por meio da inativação DDR, os HR-HPVs estimulam a proliferação de células, apesar do DDR ativado. Por que e como isso ocorre foi apenas parcialmente elucidado.

Embora muitas pesquisas tenham sido publicadas na área [7,8,9], novos insights são necessários para aprofundar a replicação e as propriedades desestabilizadoras do genoma hospedeiro do vírus, desde as fases iniciais do processo de tumorigênese, a fim de descobrir novos Terapias-alvo para pacientes infectados com HPV não vacinados e para aqueles nos quais a vacinação não é a abordagem correta.

Relatórios bem estabelecidos demonstram que HR-HPVs podem amplificar eficientemente seu genoma graças à capacidade independente, mas cooperativa das oncoproteínas E6 e E7 para manipular o DDR e reparar a maquinaria das células epiteliais do hospedeiro alvo [10,11,12,13,14] , ativado logo após o estresse replicativo induzido por oncogene, levando à instabilidade genômica (GIN) e progressão do câncer [15,16,17,18].

É bem conhecido que a oncoproteína HR-HPV16 E6 é altamente expressa durante as fases iniciais da infecção e responsável pela degradação do p53, através da maquinaria do proteassoma, através da ligação com E6AP, um domínio HECT da ubiquitina ligase [19]. Tanto E6 quanto E6AP sozinhos são incapazes de ligar p53, sugerindo que sua interação é crucial para a degradação de p53 [20,21,22], de fato, a análise da estrutura revela que tal ligação induz mudanças conformacionais em E6AP que permitem a ligação com p53 [23].

A ligação de E6AP depende de uma curta sequência aminoacídica rica em leucina, chamada de motivo de ligação LXXLL quando deletado e / ou mutado, a formação do complexo E6-E6AP é evitada, falhando assim em atingir p53 para degradação [21, 23,24,25] .

Da mesma forma, E7 aumenta DDR através de vários mecanismos: competindo com a interação E2F1-pRb, levando assim à inativação de pRb e promoção, mediada por E2F1, da tradução de genes de DDR, por ligação às proteínas semelhantes a pRb CBP / p300 e p107, que também abrigam a sequência LXXLL e por meio da interação e ativação de várias proteínas DDR.

Por causa da interação E6 e E7 com vários motivos de ligação LXXLL contendo proteínas [26,27,28,29,30], hipotetizamos sua ligação também a um dos motivos LXXLL contidos em sensores de dano de DNA.

Nessas bases, mostramos evidências experimentais para apoiar nossa teoria usando um epitélio infectado em 3D reconstruído in vitro [31,32,33,34], feito de queratinócitos transduzidos por HPV16E6E7 e já consolidado para estudo de HPVs, como um substituto de um in vivo lesão. As colorações de H / E e imunofluorescência para os principais marcadores virais (HPV16-DNA, E6 e E7), sensores DSBs γH2A.X e 53BP1 e ciclinas (E2 e B1) foram feitas primeiramente para reproduzir, dentro do modelo 3D, o que existe em vivo acontece.

Posteriormente, apesar da existência de muitos alvos de sensor de dano de DNA, como 53BP1, bem conhecido mediador / adaptador DDR, MDC1 (mediador de DNA Damage Checkpoint 1), BRCA1 (Breast Cancer 1, early start), TOPBP1 (Topoisomerase II-binding protein 1) e Claspin, supomos que E6 e E7 poderiam interferir diretamente apenas na atividade de 53BP1, uma vez que todos eles se ligam respectivamente a p53 e pRb para o controle de decisões de destino de células antitumorigênicas e para sua rápida degradação e inativação mediada por proteassoma, respectivamente.

Depois de destacar a co-expressão E6 e E7 com 53BP1 por análise IF, [35,36,37,38,39,40,41] e encontrar a presença de um motivo de ligação LXXLL dentro do domínio 53BP1 BRCT2 (LKVLL), finalmente evidenciamos a interação complexa e direta entre as oncoproteínas E6 e E7 HPV16 com 53BP1 via sistema PLA altamente específico e sensível in situ [42,43,44,45,46], ensaio bem conhecido e validado capaz de identificar e caracterizar interações em proteínas nativas em seu contexto correto de tecido / célula sob condições quase naturais / fisiológicas.


Terapêutica visando Oncoplayers E6 e E7

Conforme discutido no segmento anterior, E6 e E7 são os principais oncoplayers que conduzem o processo de tumorigênese cervical mediada por HPV através do estabelecimento de todas as seis marcas do câncer. Assim, E6 e E7 representam os alvos mais eficazes para a terapêutica, pois podem garantir a erradicação de todas as células do câncer cervical, eliminando uma ou todas as características do câncer. A próxima seção nesta revisão discute as várias abordagens usadas na pesquisa clínica atual para direcionar E6 / E7 para terapias eficazes e mais seguras do câncer cervical e foi representada graficamente na Figura 3.

Figura 3. Diferentes abordagens terapêuticas usadas para direcionar a expressão e atividade de E6 / E7 para impedi-los de estabelecer as marcas registradas do câncer cervical.

Vacinas direcionadas ao papilomavírus humano E6 / E7

Além das vacinas profiláticas, que podem ativar o sistema imunológico do corpo para prevenir a ocorrência do câncer cervical, a pesquisa clínica moderna está se concentrando no desenvolvimento de vacinas terapêuticas, que podem ser usadas para tratar o câncer mesmo em estágios malignos avançados. Ao contrário das vacinas preventivas que são desenvolvidas contra as proteínas do capsídeo L1 ou L2 que são inativadas ou deletadas durante a integração do genoma do HPV no genoma celular, as vacinas terapêuticas têm como alvo as oncoproteínas E6 e E7, que são expressas por um período mais longo na vida ciclo do HPV e representam a marca registrada mais significativa de qualquer célula infectada por HPV. Assim, as vacinas profiláticas deixam de funcionar uma vez que o HPV se instala, mas as vacinas terapêuticas podem atingi-los mesmo nos estágios mais avançados. As vacinas terapêuticas pretendem transmitir imunidade mediada por células para matar as células infectadas, em vez de introduzir anticorpos neutralizantes no sistema como as vacinas profiláticas. As vacinas terapêuticas podem ser categorizadas com base em sua fonte de desenvolvimento, como vetor bacteriano ou viral vivo, peptídeo ou proteína e ácido nucleico ou baseado em células (revisado por Chabeda et al., 2018). Várias dessas vacinas estão sendo pesquisadas e atualmente em ensaios clínicos (fase I / II / III) para câncer cervical. Vacinas como ADXS11-OO1 (Lm-LLo-E7), INO-3112, HPV16-SLP e TA-CIN + GPI-0100 foram preparadas para direcionar as proteínas HPV16 / 18 E6 / E7 para tratar os cânceres cervicais em estágio avançado. Eles estão em fase de testes clínicos ou já os concluíram. Algumas das vacinas também foram preparadas especificamente para infecção por HPV persistente e lesão intraepitelial escamosa de baixo grau, como PDS0101 e ProCervix, ou especificamente para lesão intraepitelial cervical (CIN) / lesão intraepitelial escamosa de alto grau como GX-188E, pNGVL4a-CRT / E7 (desintoxicação), PepCan + Candin, etc.(revisado por Yang et al., 2016).

Tecnologias de edição de genoma para atingir E6 / E7

Com o advento das ferramentas de edição do genoma, a região do HPV-E6 / E7 do genoma do HPV ou seus respectivos mRNAs podem ser direcionados especificamente para a cura do câncer cervical. As técnicas de edição de genes usadas para abordagens terapêuticas começaram com o uso de oligonucleotídeos antisense, ribozimas, DNAzimas, siRNA (pequeno RNA de interferência), shRNA (short hairpin RNA) e assim por diante. Estudos recentes desenvolveram técnicas mais fortes para silenciar de forma eficiente a expressão de E6 / E7, como nucleases de dedo de zinco (ZFN), nucleases efetoras semelhantes a ativadores de transcrição (TALENs) e o ARN de nuclease associada à repetição palindrômica curta regularmente interespaçada (CRISPR / Cas9) -endonuclease guiada. Isso pode ajudar a reduzir a taxa de mortalidade do câncer cervical, uma vez que os estágios avançados do câncer, que continham o genoma do HPV integrado e não podiam ser tratados, agora podem ser tratados com as tecnologias avançadas de manipulação de genes.

Terapia baseada em ácido nucléico

A terapia baseada em ácido nucléico se baseia no uso de moléculas de DNA ou RNA antisense para interromper a expressão e / ou atividade dos genes E6 e E7, o que poderia prevenir a progressão desse câncer. Eles incluem o uso de oligonucleotídeos antisense, oligonucleotídeos catalíticos e interferência de RNA. Por um lado, os oligonucleotídeos catalíticos (isto é, DNAzimas e Ribozimas) podem clivar o mRNA alvo, enquanto os oligonucleotídeos antisense e pequenas moléculas de RNA interferente (siRNA) levam à inibição da tradução dos transcritos alvo.

Ribozimas

Ribozimas são enzimas de RNA, que são capazes de hibridizar com a sequência alvo e clivá-la com a ajuda de seu núcleo catalítico. Embora estejam abundantemente presentes na natureza, eles podem ser sintetizados artificialmente para atingir especificamente os genes causadores de doenças, como E6 / E7. Várias formas deles estão presentes, mas os recombinantes sintetizados são geralmente ribozimas em gancho ou ribozimas de cabeça de martelo na natureza. Por exemplo, estudos (Zheng et al., 2002, 2004) mostraram que ribozimas de cabeça de martelo direcionadas a transcritos HPV16 E6 / E7 resultaram em perda de crescimento celular em vitro e o crescimento do tumor em camundongos nus na Vivo após apoptose. Outro estudo mostrou uma ribozima direcionada a E6AP em células HeLa para aumentar a resposta apoptótica e danos ao DNA induzidos por mitomicina-C (Kim et al., 2003).

Oligonucleotídeos anti-sentido

Os oligonucleotídeos anti-sentido estão em torno

Sequência de 20 nucleotídeos sintetizada complementar ao mRNA alvo. Resulta na inibição da tradução para prevenir a síntese de proteínas que aumentam a doença. Esses oligonucleotídeos antisense podem interromper fisicamente a ligação entre o ribossomo e o mRNA ou ativar a Rnase H endógena para clivar o mRNA alvo. Várias tentativas foram feitas para sintetizar oligonucleotídeos antisense eficazes, tais como oligonucleotídeos antisense de fosfodiéster ou análogos de fosforotioato seguidos por metilfosfonato, etilfosfonato ou modificações de ligação peptídica no período inicial, que mostraram maior suscetibilidade a nucleases. Assim, a ciência moderna surgiu com oligonucleotídeos antisense resistentes a nuclease altamente eficazes, incluindo ácidos nucleicos de peptídeo (PNAs), oligômeros morfolino de fosforodiamidato (PMOs) e ácidos nucleicos bloqueados (LNAs), que restauram a capacidade de recrutamento de RNase H. Vários estudos relataram o uso de oligonucleotídeos antisense direcionados a diferentes regiões dos transcritos E6 / E7 com vários métodos de entrega, que mostraram resultados promissores na inibição da progressão do câncer. em vitro e na Vivo (revisado por Bharti et al., 2018). Demonstrou-se que induzem apoptose por meio da regulação positiva de p53 e pRb, ocasionando redução da aparência neoplásica. As regiões de direcionamento de oligonucleotídeos anti-sentido de E6AP também mostraram potencial inibidor de tumor (Beer-Romero et al., 1997). Um novo estudo desenvolveu um oligonucleotídeo antisense combinado com um complexo de Ru (rutênio) fotorreativo, que poderia ter como alvo E6 em células SiHa infectadas com HPV 16, resultando na inibição eficiente do crescimento celular em culturas em monocamada e tridimensionais (Reschner et al., 2013) .

Interferência de RNA

A interferência de RNA é um modo comparativamente avançado de edição do genoma, que utiliza moléculas de RNA de fita dupla (denominadas como pequenos RNA-siRNA interferentes ou RNA-shRNA em gancho curto) para silenciar os oncogenes alvo E6 e E7. Várias abordagens usaram esta técnica para silenciar E6 / E7 parcial ou completamente, o que provocou senescência celular por meio do acúmulo de p53, hipofosforilação de pRb, crescimento celular inibido em monocamadas e crescimento independente de ancoragem levando a resultados apoptóticos. Resultados semelhantes também foram observados na Vivo estudo em que o crescimento do tumor foi reduzido após silenciamento de E6 / E7. HPV16-E7 shRNA quando programado induziu degradação de ambos os transcritos e proteínas E6 e E7, resultando no acúmulo de p53 celular, p21 e hipofosforilação de pRb. Em última análise, a perda de E6 e E7 resultou em apoptose (Sima et al., 2008). O silenciamento de E6 / E7 mediado por siRNA também foi encontrado para sensibilizar as células para a morte celular induzida por cisplatina (Tan et al., 2012). Uma revisão de Togtema et al. (2018) pesquisou mais de 25 dados experimentais analisando mais de 60 siRNAs preparados sinteticamente visando HPV16 E6, todos os quais foram considerados eficazes na inibição do crescimento do tumor. em vitro e na Vivo. A porcentagem de knockdown E6 apresentou variação (

10% a cerca de 80%) dependendo da sequência dos oncogenes direcionados, a concentração molar de siRNA usada, o modo de entrega celular, o modelo celular usado para o estudo e assim por diante (Togtema et al., 2018).

Assim, todas as formas de terapias baseadas em ácido nucleico, quando direcionadas aos oncogenes E6 e E7, trazem redução eficiente na progressão do câncer cervical por meio de vias semelhantes de inibição do crescimento celular e apoptose.

Edição de genoma com nucleases programáveis

Nucleases programáveis, incluindo nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases efetoras semelhantes a ativadores de transcrição (TALENs) e sistemas CRISPR-Cas9 podem ser usados ​​para direcionar a doença causando oncogenes como E6 e E7 para anular completamente sua atividade a fim de restringir e retroceder o crescimento do tumor cervical. A edição do genoma usando qualquer um dos procedimentos acima envolve o uso de domínios de ligação de DNA específicos de sequência combinados com unidades de clivagem de DNA não específicas, que levam a mudanças precisas no gene de interesse. A eficiência da tecnologia usada depende da especificidade da sequência e da afinidade das nucleases, que podem ser programadas em conformidade.

Nucleases de dedo de zinco

As nucleases de dedo de zinco (ZFNs) são endonucleases artificiais programadas por fusão de proteínas de dedo de zinco de ligação ao DNA com o domínio de clivagem de DNA FokI (Kim et al., 1996). Quando duas ZFNs programadas artificialmente se dimerizam ao se ligarem ao DNA, elas formam uma nuclease FokI ativa, que pode clivar a sequência alvo por meio de indução de quebra de fita dupla. As quebras de fita dupla introduzidas podem levar à morte celular através da via programada de apoptose ou levar à ativação do mecanismo de reparo do DNA. Normalmente, a junção de extremidades não homólogas é recrutada, o que introduz várias mutações nos genes-alvo. Isso resulta na regressão da doença causada pelos genes-alvo. ZFNs foram usados ​​pela primeira vez contra o gene E2 do HPV, o que impediu o vírus de se replicar dentro da célula hospedeira (Mino et al., 2009, 2013). Mais tarde, os ZFNs foram personalizados para atingir o gene HPV-E7, que interrompeu com sucesso o DNA do HPV e inibiu o crescimento das células de câncer cervical positivas para HPV 16/18 em vitro, e foram diagnosticados com apoptose. Eles também provaram ser clinicamente mais eficientes, pois também podem estabelecer seu efeito terapêutico em modelo de camundongo com xenoenxerto (Ding et al., 2014). Shankar et al. (2018) relataram que não conseguiram inibir com sucesso a expressão e a atividade de E6 usando ZFNs, uma vez que nenhuma sequência alvo correspondente poderia ser obtida usando um software de computador disponível publicamente. Assim, eles usaram TALENs em vez do mesmo propósito.

Nuclease Efetora Tipo Ativador de Transcrição

Nucleases efetoras semelhantes a ativadores de transcrição (TALENs) são proteínas de fusão programáveis ​​constituídas por uma região de translocação N-terminal, segmentos de repetição central de 33 & # x201335 resíduos que podem se ligar ao DNA de uma maneira específica de sequência e uma unidade C-terminal que carrega o sinal de localização nuclear (NLS) junto com a endonuclease 8 FokI (Wyman e Kanaar, 2006 Gaj et al., 2013 Qu et al., 2013). Em 2015, uma equipe liderada por Hu et al. (2015) relataram pela primeira vez que a edição do genoma mediada por TALEN dos oncogenes HPV E6 / E7 pode inibir com sucesso o crescimento do tumor, induzir apoptose e reduzir a capacidade tumorigênica de células infectadas por HPV, ambos em vitro e na Vivo. Eles encontraram resultados semelhantes em células infectadas com HPV16 (SiHa) e HPV18 (HeLa) em vitro. Next Shankar et al. (2017) rastreados para pares de TALEN para direcionar o exon E7 do genoma do HPV usando o software SAPTA. O par TALEN que foi sequenciado e sintetizado direcionou a 44ª posição ao 103º nucleotídeo abrangendo a região inicial do exon I de E7 e tinha 19 sítios de ligação em cada lado de uma região espaçadora. Os pares TALEN selecionados editaram efetivamente o genoma E7 do HPV de células SiHa infectadas com HPV16, conforme encontrado no transcrito e no nível de proteína. Resultou em um aumento correspondente na quantidade de pRb e uma diminuição em p14ARF, os alvos a jusante seguindo uma via necrótica de morte celular, conforme mostrado através da regulação positiva de RIP-1, Ciclofilina A e LDH-A. No devido tempo, outro estudo de Shankar et al. (2018) relataram que a edição mediada por TALEN de HPV16 E6 não produziu nenhuma atividade de edição, enquanto E7 poderia ser derrubado com sucesso em células CasKi infectadas por HPV16. O TALEN direcionado para E6 era composto por 18 módulos em ambos os braços espaçados por uma região de 19 nucleotídeos, enquanto o TALEN direcionado para E7 continha 18 módulos em ambas as extremidades separadas por um intervalo de 21 nucleotídeos. Portanto, nucleases programáveis ​​devem ser projetadas para ter capacidade de nocaute eficiente dependendo da especificidade da sequência e de modo que os efeitos fora do alvo sejam minimizados a fim de estabelecer seu imenso potencial terapêutico.

Clustered Regularly Interspace Short Palindromic Repeats-Cas9

Repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente intercaladas (CRISPR) -Cas9 é uma nova ferramenta de edição de genoma originalmente observada como parte do sistema imunológico adaptativo em sistemas bacterianos para combater os ácidos nucleicos estranhos (Hsu et al., 2014 Makarova et al., 2015 Wright et al., 2016). Ao contrário dos sistemas ZFN e TALEN em que os domínios de proteína precisam ser manipulados, os sistemas CRISPR-Cas são comparativamente mais simples, pois envolvem o uso de um RNA guia único, que pode guiar a endonuclease Cas9 para introduzir quebras de fita dupla no gene alvo específico, levando ao knockdown do gene por meio do uso de maquinário de reparo do hospedeiro celular. Assim, terapeuticamente evoluiu para ganhar a atenção científica no tratamento da progressão do câncer infectado por HPV. Vários estudos relataram o uso de silenciamento E6 / E7 mediado por CRISPR-Cas9 para regredir a progressão do câncer cervical. Os RNAs guia podem ser programados de acordo com os segmentos específicos de exon dos oncogenes E6 / E7. Assim, o silenciamento mediado por CRISPR-Cas9 de oncogenes E6 e E7 em células SiHa / CasKi infectadas com HPV 16 e células HeLa infectadas com HPV 18 levou à inibição do crescimento, interrupção do ciclo celular e morte celular através da restauração de p53 e pRb (Hsu et al., 2014 Kennedy et al., 2014). Mais tarde, Yoshiba et al. (2018) tentaram direcionar E6 usando o sistema CRISPR-Cas9 entregue por meio do vetor AAV tipo 2 e tiveram sucesso na introdução de várias mutações no oncogene E6. E6 quando silenciado levou à redução do crescimento do tumor, ambos em vitro e na Vivo junto com um aumento no status de p53, finalmente levando ao modo apoptótico de morte celular.

Embora essas tecnologias de edição de genoma de ponta tenham um imenso potencial terapêutico, mas não sejam facilmente acessíveis. Além disso, os sistemas de entrega também permanecem um grande obstáculo devido à carga negativa, tamanho grande e baixa penetração da membrana (Bharti et al., 2018). Uma vez que o câncer cervical afeta principalmente as mulheres de setores populacionais subdesenvolvidos, a aplicabilidade dessas técnicas de edição do genoma em terapias clínicas permanece uma questão importante. A busca por terapêuticas eficazes e de baixo custo ainda é um grande foco de pesquisa para ajudar as pessoas com camadas financeiras precárias, ou seja, aquelas que geralmente têm câncer de colo do útero.


Informação sobre o autor

Afiliações

Departamento de Cirurgia Oral e Maxilofacial, Charles R Drew University of Medicine & amp Science, Los Angeles, 90059, CA, EUA

Huidong Yuan, Fenghua Fu, Jiaying Zhuo, Wei Wang e Xuan Liu

Departamento de Otorrinolaringologia, Charles R Drew University of Medicine & amp Science, Los Angeles, 90059, CA, EUA

Departamentos de Medicina e Microbiologia, Imunologia e Genética Molecular, UCLA AIDS Institute, Los Angeles, 90095, CA, EUA


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