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Conjunto de dados de imagens microscópicas antes e depois da coloração?

Conjunto de dados de imagens microscópicas antes e depois da coloração?


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Estou procurando um conjunto de dados de imagens microscópicas distribuído gratuitamente. Espero encontrar um conjunto de dados que apresentasse imagens histológicas antes e depois da coloração (por exemplo, H&E ou algum outro padrão, de preferência). Tenho pesquisado em vários bancos de dados, mas não consigo encontrar um conjunto adequado. Espero que o tamanho da amostra seja de pelo menos cerca de 100. Sugestões?


O cérebro de mosca virtual (http://www.virtualflybrain.org/site/stacks/index.htm) é um excelente banco de dados de mosca (Drosófila) seções do cérebro, que podem ser processadas / anotadas / destacadas eletronicamente para mostrar diferentes áreas do cérebro da mosca como uma sobreposição sobre as imagens originais.

Alternativamente, você pode usar BrainTrap (http://fruitfly.inf.ed.ac.uk/braintrap/) para a expressão de proteínas na mosca (Drosófila) cérebro usando seções cerebrais. Outro banco de dados que tem manchas de prata de Drosófila as seções do cérebro são o banco de dados flybrain (http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/). Este banco de dados também contém modelos 3D de diferentes estruturas cerebrais de mosca e muito mais!

Tenho certeza de que existem muitos bancos de dados semelhantes, mas esses são os que eu conhecia, que são amplamente usados ​​no Drosófila comunidade.


Coloração de espécimes microscópicos

Em seu estado natural, a maioria das células e microrganismos que observamos ao microscópio carecem de cor e contraste. Isso torna difícil, senão impossível, detectar estruturas celulares importantes e suas características distintivas sem tratar artificialmente as amostras. Já aludimos a certas técnicas envolvendo manchas e corantes fluorescentes e, nesta seção, discutiremos técnicas específicas para a preparação de amostras com mais detalhes. Na verdade, vários métodos foram desenvolvidos para identificar micróbios específicos, estruturas celulares, sequências de DNA ou indicadores de infecção em amostras de tecido, sob o microscópio. Aqui, vamos nos concentrar nas técnicas mais relevantes clinicamente.


Definição de lactofenol algodão azul

Lactophenol Blue Solution ou Lactophenol algodão azul é um meio de montagem úmido e agente de coloração que é usado para a preparação de lâminas microscópicas de fungos para exame. Os elementos fúngicos são tingidos de azul intenso.

Você pode estar pensando, por que devemos aprender esta técnica ou qual é o propósito desta técnica.

Nós vamos, é bastante simples.

Os fungos são um tipo de organismo eucariótico e se dividem em dois grupos principais que são leveduras e fungos. Eles contêm quitina em sua parede celular. Eles têm uma estrutura microscópica e é por isso que não podemos vê-los a olho nu. Podemos vê-los ao microscópio, colorindo-os com manchas apropriadas.

Essas células fúngicas são úteis e prejudiciais ao ser humano porque produzem muitos antibióticos, produtos naturais e também usados ​​no processo de fermentação industrial. As células fúngicas são prejudiciais no sentido de que causam doenças humanas, produzem substâncias tóxicas e também prejudicam plantações importantes.

É muito importante examinar as espécies de fungos, para que possamos controlá-las ou possamos produzir medicamentos para infecções fúngicas. Antes do exame das células fúngicas ao microscópio, precisamos colori-las, o que é uma etapa importante.

A coloração de células fúngicas pode ser feita por este Lactofenol Algodão Azul. Estes são alguns exemplos de fungos Rhizopus, Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Candida, Mucor etc. Aqui vamos corar células fúngicas com a ajuda do método Lactofenol Algodão Azul, esta técnica de coloração também é chamada de montagem de fungo.

Embora existam muitos critérios na identificação de fungos, como características culturais, tolerância à temperatura, perfis nutricionais e vários testes bioquímicos, os esquemas de classificação modernos enfatizam características morfológicas microscópicas que são estáveis ​​e exibem variação mínima. A identificação definitiva de fungos é baseada na forma, método de produção e organização dos esporos (ontogenia dos conídios).


Soluções de microscopia para histologia e histopatologia

Patologia, histopatologia ou histologia tem como objetivo estudar a manifestação da doença pelo exame microscópico da morfologia do tecido. Na patologia, a amostra a ser examinada ao microscópio geralmente é o resultado de uma cirurgia, biópsia ou autópsia após a fixação, limpeza / inclusão e corte da amostra de tecido. Alternativamente, o processamento da seção congelada com um criostato é feito quando resultados rápidos são necessários (por exemplo, durante a cirurgia) ou a fixação seria prejudicial para as estruturas alvo, como lipídios ou certos antígenos. As seções de tecido após a fixação e inclusão em cera são normalmente cortadas em fatias de dois a cinco mícrons de espessura com um micrótomo antes da coloração e transferidas para uma lâmina de vidro para exame com microscópio óptico. Os espécimes típicos em patologia são cólon, rim, pâncreas, colo do útero, pulmão, mama, próstata ou tecido conjuntivo.

Embora vários procedimentos de coloração para tecidos humanos / animais e vegetais tenham sido desenvolvidos já no século 17, foi o médico alemão Rudolf Virchow quem está sendo considerado o pai da histopatologia moderna. Virchow percebeu o potencial das novas técnicas de microscópio emergentes do século 19 para sua pesquisa inovadora, publicou uma vasta quantidade de escritos científicos e criou uma coleção impressionante de milhares de lâminas de amostras histopatológicas, construindo assim a base da histologia moderna e da pesquisa do câncer.

A preparação da lâmina para histologia começa com a fixação da amostra de tecido. Esta é uma etapa crucial na preparação do tecido e seu objetivo é evitar a autólise e a putrefação do tecido. Para melhores resultados, as amostras de tecido biológico devem ser transferidas para o fixador imediatamente após a coleta, geralmente em formalina tamponada neutra a 10% por 24 a 48 horas. Após a fixação, as amostras são aparadas com um bisturi para permitir que se encaixem em um cassete de tecido devidamente rotulado que é armazenado em formalina até o início do processamento.

A primeira etapa do processamento é a desidratação, que envolve a imersão da amostra em concentrações crescentes de álcool para remover a água e a formalina do tecido. A limpeza é a próxima etapa, na qual um solvente orgânico como o xileno é usado para remover o álcool e permitir a infiltração com cera de parafina. A incorporação é a etapa final, onde as amostras são infiltradas com o agente de incorporação - geralmente cera de parafina, que fornece uma matriz de suporte que permite cortes muito finos. Um micrótomo é usado para cortar seções de tecido extremamente finas do bloco na forma de uma fita, seguindo a coloração histoquímica (normalmente hematoxilina e eosina - "coloração HE") para fornecer contraste às seções de tecido, tornando as estruturas de tecido mais visíveis e mais fáceis de avaliar . Em certos casos, as colorações imunohistoquímicas (IHC), como HER2 ou Ki-67, são necessárias para análises posteriores.


3. Preparação da grade

Assim que a amostra estiver pronta, ela deve ser preparada para geração de imagens por EM. Para obter imagens com elétrons, um microscópio é mantido sob alto vácuo, no qual as amostras biológicas hidratadas desidratam rapidamente. Assim, para obter a imagem de um espécime biológico, ele deve ser fixado, de preferência em um estado nativo (ou parecido com o nativo). Outra consideração é a espessura da amostra. Em alguns casos, a amostra pode ser muito espessa para que os elétrons sejam & # x02018transmitidos & # x02019, um pré-requisito para a transmissão EM e, portanto, a amostra pode precisar ser processada para torná-la mais fina. A escolha da técnica de preparação é determinada, em última análise, pela natureza da amostra e pela resolução necessária para o insight biológico pretendido, mas os métodos comuns incluem coloração negativa, inclusão / corte de plástico e vitrificação.

As grades EM têm tradicionalmente 3,05 & # x000a0mm de diâmetro e são feitas de uma malha de metal como cobre, ouro, níquel, molibdênio ou ródio. As grades de cobre são mais comumente usadas, mas os suportes de ouro estão se tornando mais comuns, especialmente quando as células devem ser cultivadas diretamente na grade, pois não são tóxicas para as células. A malha de metal apóia o filme na parte superior. O tamanho da malha, ou número de quadrados na grade, é definido como o número de quadrados em uma polegada. Por exemplo, uma grade de malha 200 tem 20 quadrados em cada direção e uma malha de 300 30 quadrados. As grades de malha 200 & # x02013400 são mais comumente usadas para crio-EM. Sobre o suporte de metal é depositado um filme de suporte, diferentes filmes de suporte são usados ​​para diferentes fins (Seção 3.3). Tamanhos de malha mais finos fornecem mais suporte para o filme, mas quando a grade é inclinada, as barras podem bloquear o feixe. Portanto, grades de 200 malhas são mais comumente usadas para coleta de dados em série de inclinação.

3.1. Coloração negativa

Uso típico: O alto contraste e a velocidade de preparação da grade de amostras com coloração negativa o torna ideal para avaliar a pureza da amostra, concentração, heterogeneidade e flexibilidade conformacional. Reconstruções 3D de baixa resolução a partir de dados corados também podem fornecer modelos iniciais para estudos crio-EM de alta resolução.

Vantagens: Alta velocidade de preparação da amostra e bom contraste da amostra. Além disso, existe a capacidade de marcar com anticorpos ou ouro para auxiliar ainda mais os estudos funcionais e determinar a estequiometria. A grade pode ser facilmente mantida por muitos anos e refeita.

Desvantagens: Estruturas limitadas a resolução modesta (& # x0223c & # x0003e20 & # x000a0 & # x000c5), topologia de superfície apenas, possibilidade de artefatos de coloração, incompatível com alguns tampões e / ou reagentes.

A coloração negativa é um método comum para examinar uma amostra, especialmente complexos macromoleculares, em temperatura ambiente. Muitas variações da técnica de coloração negativa foram documentadas desde o final dos anos 1950, usando várias manchas de metais pesados ​​diferentes [18]. Normalmente, as amostras são adsorvidas em um filme de suporte de carbono contínuo fino (& # x0223c10 & # x000a0nm) que foi tornado hidrofílico (Seção 3.3). Em seguida, é corado com uma solução de sal de metal pesado, comumente 1 & # x020132% (w / v) de acetato de uranila ou formato de uranila e enxugado para garantir uma camada fina de mancha, sem que a mancha migre para o lado posterior da grade. Alguns componentes tampão comuns (Tabela 1) são conhecidos por afetar adversamente a qualidade da coloração. No entanto, uma grande diluição de uma amostra concentrada com um tampão compatível imediatamente antes da aplicação na grade é a maneira mais fácil de melhorar isso. Se isso não for possível, lavar a grade antes da coloração também é uma opção. O processo de coloração desidrata rapidamente a amostra e envolve-a na coloração (onde a amostra é visualizada pela ausência de coloração, a coloração negativa ocorre onde a própria amostra fica manchada, ocorre a coloração positiva) (Fig. 2). A casca resultante de átomos de metal pesado gera contraste de amplitude e uma relação sinal / ruído (SNR) relativamente alta (a formação da imagem em TEM foi revisada em [12]). A profundidade correta da coloração deve ser alcançada para uma imagem ideal, com informações sendo perdidas quando a coloração é muito profunda ou muito rasa. A desidratação da amostra e sua deformação durante a adsorção são desvantagens da preparação da amostra com coloração negativa. Além disso, a resolução das imagens manchadas é limitada pelo tamanho do grão da mancha, que determina o quão bem o envelope da mancha reflete a estrutura do objeto [19]. O uso de um filme de suporte de carbono contínuo pode resultar em amostras adotando uma orientação preferencial na grade, complicando a determinação da estrutura 3D devido à falta de visualizações. Apesar desses problemas, as amostras com coloração negativa podem gerar dados 3D e fornecer uma visão biológica inestimável [20], [21]. Por exemplo, a coloração negativa pode ser usada para elucidar a ligação de inibidores de moléculas pequenas em questão de semanas [22], avaliar mudanças conformacionais [23], [24], estabilidade do complexo [25] e estequiometria / posição de subunidade [26], [27]. O processo de coloração negativa foi totalmente revisado em [28].

Coloração positiva e negativa com sais de metais pesados. Na coloração negativa (A), a coloração envolve totalmente o complexo macromolecular na micrografia, o complexo aparece branco em um fundo escuro. A coloração positiva (B) resulta em uma pequena quantidade de mancha formando uma camada fina ao redor da molécula, o que significa que a amostra parece escura contra um fundo claro.

A coloração negativa também pode ser combinada com a vitrificação (Seção 3.2), em uma técnica de preparação de amostra conhecida como coloração crio-negativa. Este método combina o alto contraste de usar uma mancha de metal pesado com os efeitos protetores da preservação criogênica (Revisado em [29]).

3.2. Vitrificação

As técnicas de preparação de amostras, como coloração e inclusão de plástico, envolvem a desidratação de espécimes biológicos, o que basicamente os remove de seu ambiente aquoso nativo. A crio-imobilização preserva esse ambiente aquoso, enquanto também melhora os danos da radiação [30]. A imagem de amostras imobilizadas criogenicamente por EM é conhecida como crio-EM. A amostra deve ser congelada extremamente rapidamente, a uma taxa de & # x0223c10 6 & # x000a0 & # x000b0C / s, de modo que a água dentro e ao redor da amostra seja fixada em um estado vítreo [31]. Se o congelamento ocorrer muito lentamente ou a amostra for subsequentemente aquecida acima de & # x02212137 & # x000a0 & # x000b0C, a temperatura na qual a água se desvitrifica [31], o gelo cristalino é formado. Em nossa experiência, aquecer a amostra mais do que & # x0223c & # x02212160 & # x000a0 & # x000b0C pode resultar em gelo de má qualidade. A contaminação por gelo compromete a integridade estrutural da amostra, pois os cristais retiram as moléculas de água das conchas de hidratação da amostra ou da própria amostra (Fig. 3). A formação de gelo cristalino também degrada a qualidade da imagem à medida que difratam elétrons. A contaminação também pode ocorrer durante o processo de congelamento, como gelo hexagonal, que pode ser reduzido trabalhando em ambientes com umidade controlada e minimizando a contaminação do gelo no nitrogênio líquido.

Exemplos de gelo vítreo e não vítreo. A) Gelo vítreo vazio (barra de escala 50 e # x000a0nm). B) Gelo hexagonal (barra de escala 400 e # x000a0nm). C) Grande cristal de gelo (seta branca) (barra de escala 400 e # x000a0nm). D) Provável contaminação com etano (barra de escala 200 e # x000a0nm).

Embora o cryo-EM esteja em desenvolvimento desde a década de 1970, o grande número de estruturas de alta resolução depositadas nos últimos dois anos tem promovido um aumento do interesse pela técnica [32], [33], [34], [35], [ 36]. Aqui, métodos de crio-imobilização são discutidos.

3.2.1. Mergulhe no congelamento

Uso típico: uma ampla gama de amostras, de pequenas (& # x0223c150 & # x000a0kDa) macromoléculas a células eucarióticas inteiras podem ser vitrificadas e fotografadas por crio-EM.

Vantagens: a amostra é visualizada em um estado semelhante ao nativo. O processamento de dados pode gerar informações estruturais 3D de alta resolução.

Desvantagens: As amostras biológicas devem ter imagens com baixas doses de elétrons para evitar danos de radiação resultando em contraste insuficiente. Às vezes, não é trivial otimizar a distribuição da amostra e a espessura do gelo.

Para amostras finas, como suspensões de macromoléculas, cristais 2D ou 3D muito pequenos, células pequenas e a borda fina de células maiores, a crioimobilização pode ser alcançada por blotting para gerar uma película fina de líquido contendo a amostra e, em seguida, congelar rapidamente mergulhando em um criogênio (Fig. 4). Os criogênios mais amplamente usados ​​são etano ou propano líquido, resfriado por nitrogênio líquido [37]. O congelamento por mergulho de amostras finas é usado para uma ampla gama de espécimes. Para cada um, a camada de gelo deve ser o mais fina possível, sem distorcer a amostra e ao mesmo tempo incorporar totalmente a partícula, para maximizar o contraste da amostra. A falha em incorporar totalmente a amostra pode levar a danos de radiação preferenciais na amostra fora da camada de gelo. Blotting e mergulho podem ser alcançados com dispositivos simples, muitas vezes construídos internamente [38]. No entanto, esses dispositivos muitas vezes lutam para fornecer resultados consistentes dentro e entre os lotes de grades preparadas. Vários instrumentos comerciais estão disponíveis que alcançam resultados mais reprodutíveis, incluindo modelos da FEI, Leica e Gatan (Tabela 2). Os aparelhos de congelamento disponíveis comercialmente oferecem diferentes recursos que podem ser benéficos ao trabalhar com certas amostras. Por exemplo, o blotting de um só lado pode ser vantajoso ao preparar grades de células aderentes. O mata-borrão nos dois lados pode resultar na separação de algumas células da grade e para o papel mata-borrão. O blotting de um lado pode ser realizado a partir do & # x02018 lado posterior & # x02019 da cintura, onde as células não estão aderidas, contornando os problemas causados ​​pelo blotting dos dois lados. Além disso, alguns complexos macromoleculares podem se beneficiar de um controle de temperatura e / ou umidade baixa (& # x0003c5 & # x000a0 & # x000b0C) na câmara de congelamento. Essas considerações podem influenciar a escolha do aparelho de congelamento, onde houver opção disponível.

Imagem em escala múltipla por cryo-EM. A) Células eucarióticas (barra de escala 6 e # x000a0 e # x003bcm). B) Células procarióticas (barra de escala 0,5 e # x000a0 e # x003bcm). C) Organelas isoladas, neste caso microssomas (barra de escala 200 & # x000a0nm). D) Lipossomas sintéticos (barra de escala 100 e # x000a0nm) E) Vírus (barra de escala 50 e # x000a0nm). F) Complexos macromoleculares (barra de escala 25 e # x000a0nm).

Mesa 2

Comparação de dispositivos de congelamento por imersão disponíveis comercialmente.

ModeloControle de umidade na câmaraControle de temperatura na câmaraControle automático da temperatura do etanoModalidade de blottingInformações adicionais
Leica EM GP& # x02713& # x02713& # x02713De um ladoEstereomicroscópio opcional para monitorar o blotting
Gatan Cryo-mergulho 3& # x02715
(Câmara fixada em 98%)
& # x02715
(Opera em temperatura ambiente)
& # x02713Simples e dupla faceCâmara de umidade removível
FEI Vitrobot& # x02713& # x02713& # x02715Dupla faceAtualmente o dispositivo de congelamento por mergulho mais comum.

Em muitas instalações, uma ampla variedade de amostras são preparadas usando o mesmo instrumento de congelamento por mergulho. Deve-se ter cuidado para descontaminar o dispositivo adequadamente após o uso, por exemplo, com etanol 70% (v / v). Para amostras que representam um risco biológico, os freezers de mergulho podem ser colocados em um gabinete de biossegurança. Isso protege o usuário contra aerossóis e permite que o dispositivo seja fumigado, aumentando a biossegurança.

3.2.2. Congelamento de alta pressão

Uso típico: Espécimes espessos, como a região nuclear de células eucarióticas, seções de tecido e organismos inteiros, como Caenorhabditis elegans, que não podem ser preparados por congelamento por mergulho.

Vantagens: a amostra é preservada em um estado semelhante ao nativo. Pode resultar em informações estruturais 3D de alta resolução.

Desvantagens: Para ser visualizado por TEM, ou seja, tornar-se transparente para o elétron, a amostra deve ser seccionada ou afinada por moagem por feixe de íons focalizado (FIB) após o congelamento. Existe o potencial de gerar artefatos neste processo, e pode ser tecnicamente desafiador.

Embora as amostras mais finas do que a borda de células grandes possam ser vitrificadas por congelamento por mergulho, as amostras mais espessas (& # x0003c1 & # x000a0 & # x003bcm), como as regiões nucleares e perinucleares de células eucarióticas, ou seções de tecido podem experimentar alguma formação de gelo cristalino durante o congelamento por mergulho. Para essas amostras, o congelamento de alta pressão (HPF) é uma alternativa eficaz. HPF envolve aumentar a pressão da amostra para & # x0223c2000 & # x000a0bar enquanto diminui a temperatura usando nitrogênio líquido [39]. Para amostras & # x0003e100 & # x000a0 & # x003bcm de espessura até & # x0223c300 & # x000a0 & # x003bcm de espessura, eles podem ser vitrificados usando HPF, mas devem ser subsequentemente seccionados para serem finos o suficiente para TEM. O seccionamento pode ser realizado em condições criogênicas, o que proporciona a melhor preservação da amostra. Esta técnica, conhecida como microscopia crioeletrônica de cortes vítreos (CEMOVIS), usa crio-ultramicrotomia com faca de diamante para produzir cortes de 40 & # x02013100 & # x000a0nm de espessura [40], [41], [42]. É uma técnica útil, capaz de obter imagens de espécimes espessos em um estado semelhante ao nativo, mas é tecnicamente extremamente desafiadora. Uma abordagem alternativa comum é realizar a substituição por congelamento na amostra, o que permite o corte e a imagem em temperatura ambiente [43], [44]. A substituição por congelamento envolve o aquecimento gradual da amostra e a substituição da água por acetona. A amostra pode então ser tingida, incorporada em resina e seccionada. A substituição por congelamento apresenta menos artefatos do que a incorporação de plástico tradicional, mas pequenos cristais de gelo se formam, causando o rearranjo das estruturas celulares, e a coloração não é uniforme, portanto a interpretação das imagens pode ser um desafio.

Uma alternativa ao seccionamento é o uso de fresamento FIB para reduzir a espessura da amostra [45], [46]. A moagem de FIB é realizada em amostras hidratadas congeladas em um instrumento EM / FIB de varredura de feixe duplo [47]. Um feixe de íons focalizado é rasterizado pela superfície da amostra, removendo os átomos da superfície em um processo conhecido como sputtering. O microscópio eletrônico de varredura (MEV) permite o monitoramento simultâneo e não destrutivo do processo de moagem [47]. Os íons de gálio são comumente usados ​​por causa de sua volatilidade e baixo ponto de fusão [47]. O feixe de íons é gerado por uma fonte de íons de metal líquido e liberado por um eletrodo de extração. Lentes e aberturas eletromagnéticas são usadas para focar o feixe de íons e defletores para controlar o padrão de fresamento. A moagem de FIB pode introduzir artefatos, pois o material pulverizado pode redepositar na superfície da amostra, embora um dispositivo anticontaminador resfriado e devidamente posicionado possa reduzir isso. As taxas de fresamento diferenciais também podem produzir listras ou cortinas em toda a superfície, e também pode ocorrer aquecimento / desvitrificação local. No entanto, as condições foram estabelecidas onde as temperaturas não aumentam o suficiente para que isso seja um problema de rotina [48]. Etapas específicas podem ser tomadas para garantir uma superfície lisa durante a moagem, como o uso de um sistema de injeção de gás para criar uma camada organometálica de platina cobrindo a amostra, que a protege de alguns artefatos causados ​​por pulverização catódica irregular durante a moagem [49]. A moagem de FIB pode ser usada em conjunto com a geração de imagens por MEV, como em imagens de face de bloco em série, ou a amostra moída transferida para um TEM [45], [46]. Desde o primeiro experimento crio-FIB bem-sucedido em 2003 [50], fluxos de trabalho foram desenvolvidos para melhorar e otimizar a técnica, incluindo no local preparação crio-lamela de células cultivadas em grades EM. A tecnologia Cryo-FIB ainda está desenvolvendo um desenvolvimento particularmente interessante é a implementação de microscopia de luz correlativa em combinação com moagem FIB [51].

3.3. Filmes de apoio

Uma consideração importante na preparação da grade é a escolha da grade e do filme de suporte. Para cryo-EM, filmes de carbono perfurados são geralmente usados, permitindo que a amostra seja fotografada em gelo suspenso entre os orifícios no filme de suporte de carbono. Filmes contínuos de carbono são usados ​​para coloração negativa. No entanto, em nossa experiência, as amostras podem ter afinidades dramaticamente diferentes para filmes de carbono. As propriedades da superfície do carbono podem ser alteradas por uma variedade de processos, incluindo exposição à radiação UV, descarga luminosa, polil-lisina ou tratamento com detergente [52], [53]. No crio-EM, alterar as propriedades de carga do filme de carbono pode alterar a partição da amostra nos orifícios, mas isso precisa ser otimizado para cada amostra. Algumas amostras têm uma afinidade muito alta para o filme de carbono, essas amostras às vezes se beneficiam de um filme de carbono fino e contínuo em camadas sobre o filme perfurado. Essa camada de carbono pode melhorar a distribuição de partículas, mas precisa ser fina (& # x0003c10 & # x000a0nm) para evitar a adição de ruído excessivo às imagens. Esses filmes finos de carbono também podem ser extremamente frágeis, portanto, há uma compensação entre a estabilidade do carbono e a espessura. Os filmes de carbono amorfo perfurados estão disponíveis comercialmente e podem consistir em matrizes regulares de orifícios de tamanhos iguais, como as grades Quantifoil & # x000ae e C-Flat & # x02122, ou irregulares, como no carbono lacey. Grades de filme de carbono perfurado com um filme de carbono contínuo ultrafino (3 & # x020135 & # x000a0nm) também podem ser adquiridos comercialmente ou fabricados internamente.

Filmes amorfos de suporte de carbono são amplamente usados, mas apresentam seus problemas. Eles podem ser inconsistentes entre os lotes e a qualidade do filme de carbono amorfo pode se deteriorar com o tempo. Além disso, a instabilidade dos filmes de carbono amorfo contribui para o movimento de partículas induzido pelo feixe, borrando a imagem da amostra [54]. Novos materiais estão sendo desenvolvidos para resolver esses problemas, incluindo filmes de suporte de ouro, grafeno e filmes de carboneto de silicone dopados, todos os quais parecem reduzir o movimento de partículas induzido por feixe [55], [56], [57]. Melhorias nos filmes de suporte têm o potencial de aumentar significativamente a qualidade da coleta de dados crio-EM inclinados e não inclinados.


Estrutura da ameba

Como mencionado, as amebas são eucariotos, o que significa simplesmente que têm uma membrana celular em torno de seu citoplasma e DNA que está devidamente empacotado no núcleo central.

Quando vistos sob o microscópio, esses aspectos do organismo são claramente visíveis, especialmente quando a amostra é tingida.

Algumas das outras organelas que são visíveis ao microscópio incluem:

* No que diz respeito à sua estrutura, as amebas se assemelham muito às células de animais superiores, como as dos seres humanos.


Medições e análise de dados

CellProfiler mede um grande número de recursos para cada célula ou compartimento subcelular identificado, incluindo área, forma, intensidade e textura (cada recurso é descrito no arquivo de dados adicionais 4). Isso inclui muitos recursos padrão [39, 40], mas também medidas complexas como recursos de forma de Zernike [41] e recursos de textura Haralick e Gabor [42–44], que são descritos em detalhes na ajuda online e no manual. Existem também módulos para medir vários recursos (por exemplo, intensidade, textura, saturação, desfoque, área ocupada por uma mancha) de uma imagem em sua totalidade. Uma limitação severa da maioria dos softwares comerciais é a incapacidade de se adaptar a novas questões biológicas pelo cálculo de novos recursos a partir de células identificadas [5]. Em contraste, o design modular do CellProfiler e o código-fonte aberto permitem medir rapidamente novos fenótipos celulares, conforme necessário.

As medições são acessíveis de várias maneiras: usando as ferramentas integradas de visualização e plotagem de dados do CellProfiler (arquivo de dados adicionais 5) exportando em um formato de planilha delimitado por tabulação que pode ser aberto em programas como Microsoft Excel ou OpenOffice Calc exportando em um formato que pode ser importado para um banco de dados como Oracle ou MySQL ou diretamente no MATLAB.


Procedimento

Para a célula de pele de cebola

  • Retire uma pequena parte da casca da cebola
  • Coloque a casca da cebola no centro da lâmina
  • Deite as duas gotas de água sobre a casca da cebola. Isso é chamado de "montagem úmida"
  • Começando em uma das bordas, abaixe suavemente uma lamela sobre a casca da cebola
  • Bata suavemente no slide com um lápis para remover quaisquer bolhas de ar
  • Coloque uma gota de iodo em uma das bordas da lamela. Toque a borda oposta da lamela com uma toalha de papel para tirar a mancha sob a lamela
  • Coloque o slide no palco com baixa potência. Use o botão de ajuste grosso para focar
  • Gire o bocal para uma potência média. Use o botão de ajuste fino para focar. Observe o que você vê
  • Repita a etapa 8, mas desta vez mude para alta potência e desenhe o que você vê (use um lápis)
  • Depois de desenhar seus diagramas, gire a peça do nariz de volta para a potência baixa. Remova a lâmina e descarte o pedaço de cebola, e lave a lâmina e a lamela

Para a célula da bochecha

  • Pegue um palito limpo e raspe suavemente a parte interna da sua bochecha
  • Prepare uma montagem úmida como nas etapas 2-6. Em vez disso, use a solução de azul de metileno como corante

Mitose e Meiose - Parte B

Petra Vyplelová Miroslav Ovečka George Komis Jozef Šamaj, em Methods in Cell Biology, 2018

4.4 Imagem de arranjos de microtúbulos mitóticos de plantas com o sistema de varredura de ponto confocal Airyscan com resolução melhorada

A microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) equipada com o sistema Airyscan representa uma nova aplicação de uma abordagem de imagem de varredura pontual com resolução aprimorada. O sistema é equipado com um detector de 32 GaAsP que oferece alta sensibilidade e capacidade superior de coleta de luz. As amostras podem ser digitalizadas com o modo rápido, permitindo resolução temporal suficiente durante a aquisição espacial e temporal 3D. Alternativamente, um modo de alta resolução pode ser usado, permitindo uma resolução 3D melhorada para a aquisição de Z-pilhas. Levando em consideração essas melhorias técnicas, utilizamos a plataforma de microscopia LSM880 Airyscan (Carl Zeiss Microscopy) para a documentação do progresso mitótico em células do ktn1-2 mutante que expressa de forma estável o marcador de microtúbulo GFP-TUA6 (Komis et al., 2017). Defeitos na organização de arranjos de microtúbulos mitóticos em células em divisão causados ​​por mutação no KATANIN1 gene foram claramente documentados em comparação com o controle correspondente (Fig. 3).

Fig. 3. Análise comparativa de arranjos de microtúbulos durante a mitose e citocinese de células epidérmicas do pecíolo da folha em Arabidopsis thaliana plantas estavelmente transformadas com um 35S :: GFP: TUA6 construir entre plantas de tipo selvagem e um mutante nocaute ktn1-2, deficiente na proteína KATANIN 1 de corte de microtúbulos usando microscopia confocal de varredura a laser equipada com o sistema Airyscan. Organização de arranjos de microtúbulos típicos para estágios particulares de divisão celular em células da planta de tipo selvagem (A, C e E) e o ktn1-2 mutante (B, D e F). (A e B) Estreitamento da banda pré-pró-fase (PPB) no final da fase G2 do ciclo celular (estágio pré-pró-fase). Observe o arranjo unipolar e desorganizado dos microtúbulos PPB no ktn1-2 mutante (B). (C e D) Organização do fuso mitótico, não apresentando alterações estruturais entre o controle e ktn1-2 células mutantes. (E e F) Organização dos microtúbulos do fragmoplasto durante a citocinese. Em comparação com o controle (E), o fragmoplasto no ktn1-2 mutante tem formato anormal (F). Barra de escala: 5 μm.

Sementes de linhagens transgênicas que expressam um marcador de microtúbulo apropriado (GFP-TUA6) são esterilizadas na superfície usando 70% (v / v) de etanol por 2 min seguido por 1% (v / v) de hipoclorito de sódio contendo 0,05% (v / v) de Tween 20 por 8 min. Após a lavagem, as sementes estéreis são semeadas na superfície de meio MS sem vitaminas e com 1% (p / v) de sacarose, pH ajustado para 5,7, solidificado com Phytagel na concentração de 0,6% (p / v). Após a estratificação das sementes a 4 ° C por 2–4 dias, elas são cultivadas em câmara de crescimento a 22 ° C, 50% de umidade e fotoperíodo de 16/8 h (luz / escuridão) em uma posição vertical para permitir o crescimento direto das raízes em a superfície do meio solidificado.

Em primeiro lugar, é necessário construir a câmara de observação usando uma lâmina de vidro e lamínula espaçadas com parafilme ou tiras de fita adesiva dupla. Uma gota de meio MS líquido com metade da força é colocada no meio da lâmina e uma muda selecionada é transferida para a gota. A amostra é ensanduichada entre a lâmina e a lamela com uma distância estável garantindo espaço suficiente para os jovens A. thaliana plantar. A microcâmara é selada nas laterais e bordas por tiras de parafilme para evitar a evaporação do meio MS líquido de meia força durante a imagem de lapso de tempo por mais de 1 h. Observação: A transferência das plantas selecionadas do meio de cultura para a lâmina de microscopia deve ser feita em condições estéreis na caixa de fluxo laminar.

Epidermal petiole cells of young first true leaf are suitable for observation of cell division in the green part of A. thaliana plantas. The most preferable plants are 6–7 days old for preparation of such sample. The plant must be entirely covered by the coverslip and young first true leaf must be positioned by abaxial (lower) leaf side parallel to the coverslip.

The example given here ( Fig. 3 ) was obtained using LSM880 with Airyscan (Carl Zeiss Microscopy). We used single-photon excitation with the 488 nm laser line and a 32 GaAsP detector for fluorescence detection. The superior light-collecting capacity of the Airyscan and the sensitivity of the GaAsP detector allowed setting laser power to a level not exceeding 2% of the range available. Observation of dividing cells was done with Plan-Apochromat 63 ×/1.4 NA oil immersion objective and data sets were analyzed with Zeiss Zen 2014 software (Blue Version).


Dataset of microscopic images before and after staining? - Biologia


This training process is to train the statistical color detection model based on visual selected color pixels. You can start training by selecting a Region of Interest (ROI) through a rectangular tool in imageJ and pressing Training button on main panel.

The left image is original DAB stained color image and the right image is the result image. Using the sliding bar presented in sub-panel (color Chooser), you can visually determine the reserved color pixels in the result image. Once all the desired color pixels of an image are reserved, you can record them by pressing Collection button in color Chooser panel. The model is then automatically calculated and created. In general, the training phase requires re-selecting the ROI on multiple training samples in order to obtain a wide range of shades of the target color. You can close the collected image and re-open a new one. When a new training image is added, the model is then re-calculated automatically based on the accumulated histograms.

At the end of collecting training samples, the created statistical model can be saved (Using Save Model button in color Chooser panel) and reused for subsequent detection. It is recommended to save the model as the .txt format. Please see those models we created in the Modelfolder. These model files are pre-defined color model for the detection of DAB stained brown color, brown color in elastin contained liver samples and Sirius Read (SR) stained pink color. Users can define their own models throung the Training step and put them in User Model folder.

By selecting those models or changing a new one, you can press the button Read User Model on the main panel to read them one by one. The Read Model button is set to read the default model H-DAB.txt for brown color detection.


Once you have read one color detection model (for example, the H-DAB. txt), simply press the Color button on the main panel. Then the tool will generate the detected result in a created new window.


For the nuclei segmentation and quantification, you can set those parameters before you press Nuclei button. The quantification consists of counting the positive nuclei and oval fitted nuclei segmentation. Instead, the contour is drawn at the edge of the detected positive nuclei. Unless customized parameters are set, this nuclei segmentation and quantification functions are automatically processed. Changing between the processes of Quantification to Segmentation, you can select the order through the drop-down menu.
In order to estimate the parameters for nuclei segmentation, you can use the square tool and ellipse tool in imageJ. The image on the left is fitted by a 44x44 square, and the image on the right is fitted by an ellipse that has 908 pixels inside. For the window size parameter, it is better to set as 25 pixels (half size of the window) which may cover the sizes of all nuclei. And the seed size, corresponding to the minimum size constraint, should be the half of small nucleus. In our dataset, the size of nuclei changes from 300 to 900 pixels, where we set 150 pixels as seed size.


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