Em formação

Os níveis de expressão gênica correspondem necessariamente aos níveis de ativação de proteínas?

Os níveis de expressão gênica correspondem necessariamente aos níveis de ativação de proteínas?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Tenho visto muitas pesquisas sobre os mecanismos moleculares de doenças / fenótipos usarem medidas de RNA como um 'proxy' para o nível de proteína disponível na célula. Isso é realmente válido?

Meu problema com a suposição de que os níveis de RNA se correlacionam com os do produto ativo (ou seja, a proteína) é que um muito de regulação pós-tradução ocorre, incluindo a ligação do cofator e fosforilação, para citar apenas 2. Alguém sabe de algum estudo que tenha examinado a correlação entre os níveis de RNA e os níveis de proteína, e separadamente nas correlações entre os níveis de RNA e ativo proteína?

Faz sentido para mim que o RNA se correlacione com a proteína certamente, mas se isso se relaciona com a função ativa das proteínas é o que me pergunto - ou seja, pode haver um pool que é reabastecido quando os níveis de proteína caem, mas as proteínas são apenas realmente ativo por curtos períodos em resposta a estímulos específicos. Então, alguém sabe de algum estudo que investigou a correlação entre os níveis de RNA e os níveis de proteína e, separadamente, as correlações entre os níveis de RNA e a proteína ativa?


Atualização (04.07.12)

Não aceitei nenhuma resposta ainda porque nenhuma aborda minha pergunta sobre os níveis de ativação de proteínas, mas admito o excelente ponto de Daniel de que as proteínas não são todas ativadas da mesma maneira; alguns estão constantemente ativos, alguns requerem fosforilação (vários locais?), alguns parceiros de ligação ... etc! Portanto, um estudo que analise a ativação 'global' ainda não é possível. No entanto, esperava que alguém pudesse ter lido alguns exemplos específicos.

Hoje encontrei uma revisão não publicada por Nancy Kendrick de 10 estudos que analisaram a correlação entre mRNA e proteína abundância - ainda não se relacionando com ativação. No entanto, ela termina o artigo da seguinte maneira;

A conclusão dos dez exemplos listados acima parece inevitável: os níveis de mRNA não podem ser usados ​​como substitutos para os níveis de proteína correspondentes sem verificação.

Se esta é sua conclusão sobre os níveis de proteína, então qualquer correlação entre a ativação da proteína e a abundância de mRNA parece improvável (como regra. Alguns níveis de proteína Faz correlacionar com o RNA - veja o artigo).

Ainda estou interessado em quaisquer respostas que forneçam informações sobre exemplos específicos de ativação de proteínas e níveis de mRNA - parece altamente improvável que não existam tais estudos, mas ainda não consegui encontrar nenhum!


Foi bem estabelecido que a abundância de mRNA serve como um substituto pobre para a abundância de proteínas na maioria dos casos. Este artigo sobre levedura e este artigo sobre câncer estabelecem isso, embora usando técnicas mais antigas (SAGE e microarrays, respectivamente), enquanto esta revisão mais recente discute o tópico à luz de tecnologias mais recentes (por exemplo, RNA-seq).

Talvez a dificuldade em explorar a correlação entre os níveis de mRNA e os níveis de proteínas maduras ativas é que ainda sabemos muito pouco sobre tantas proteínas e o que as torna ativas e maduras versus inativas, prematuras, etc. Nem todas as proteínas precisam de pós-tradução modificações para ficarem ativas, mas algumas o fazem. Atualmente, isso é investigado em uma base muito detalhada de proteína por proteína (até onde eu sei), portanto, reunir dados suficientes para um estudo em grande escala pode levar muito tempo. Por outro lado, há uma variedade de métodos de alto rendimento (cada vez mais acessíveis) para medir a abundância de milhares de espécies de RNA simultaneamente. Acho que as pessoas estão usando os níveis de mRNA para estimar a expressão não porque seja o curso de ação mais biologicamente convincente, mas sim porque é muito mais fácil, mais acessível e de maior rendimento (o que está na moda atualmente).


Este estudo em E.coli é útil para definir alguns problemas adicionais em jogo aqui, em um sistema onde as modificações pós-tradução são basicamente um problema. Os autores vêem claramente uma correlação entre o mRNA e os níveis de proteína (Fig. 3C) e teorizam que as diferenças na taxa de tradução e no turnover da proteína são responsáveis ​​pelas diferenças no nível de proteína para dois genes com nível de mRNA semelhante.

Eles investigam o problema em um nível de célula única e não encontram nenhuma correlação entre o nível de mRNA de uma única célula e o nível de proteína para um determinado gene (Fig. 4). Isso é atribuído à separação em escala de tempo entre o turnover do mRNA (geralmente alguns minutos) e o turnover da proteína (em muitos casos, a degradação é tão lenta que o turnover da proteína é impulsionado pela diluição / divisão celular). Uma maneira de entender isso é que há várias "gerações" de mRNA contribuindo para a população de proteínas em um determinado momento, o que não é inconsistente com o dogma central. No entanto, este resultado levanta sérios problemas para o uso de mRNA como um proxy para proteína na comparação de células únicas.

No entanto, geralmente, em populações de bactérias, o uso de mRNA como proxy para proteínas funciona muito bem, especialmente ao comparar os níveis de um gene sob perturbações. A menos que acreditemos que a tradução ou a degradação da proteína sejam afetadas, o nível de mRNA deve ser um bom proxy, embora possa haver problemas com o uso disso quantitativamente porque a regulação muitas vezes não é linear (ou seja, o mRNA duplo não produz proteína dupla). Veja, por exemplo, regulação de sRNA.


As assinaturas de proteínas correspondem aos resultados de sobrevivência de pacientes com melanoma estágio III da AJCC

Os resultados para pacientes com melanoma com doença em estágio III diferem amplamente, mesmo dentro da mesma subcategoria. As assinaturas moleculares que predizem o prognóstico com mais precisão são necessárias para estratificar os pacientes de acordo com o risco. As análises proteômicas foram usadas para identificar proteínas diferencialmente abundantes em extratos de amostras excisadas cirurgicamente de pacientes com metástases em linfonodos de melanoma em estágio IIIc. A análise de amostras de pacientes com resultados de sobrevivência ruins (n ​​= 14, & lt1 ano) e bons (n ​​= 19, & gt4 anos) identificou 84 proteínas que eram diferencialmente abundantes entre os grupos de prognóstico. A análise de monitoramento de reação selecionada subsequente verificou 21 proteínas como biomarcadores potenciais para a sobrevivência. Pacientes com mau prognóstico são caracterizados por níveis aumentados de proteínas envolvidas no metabolismo de proteínas, metabolismo de ácidos nucléicos, angiogênese, desregulação da energia celular e processos de metilação, e níveis diminuídos de proteínas envolvidas na apoptose e resposta imune. Essas proteínas são capazes de classificar os pacientes em estágio IIIc em subgrupos de prognóstico (P & lt 0,02). Este é o primeiro relato de potenciais marcadores prognósticos do melanoma em estágio III usando análises proteômicas. A validação desses marcadores de proteína em coortes maiores de pacientes deve definir assinaturas de proteínas que permitem uma melhor estratificação de pacientes com melanoma em estágio III.

Significado

Pacientes com melanoma em estágio III podem ter resultados muito diferentes. Atualmente, para pacientes em estágio IIIc, o risco de progressão e resposta à terapia não pode ser previsto. Marcadores prognósticos adicionais para estratificação de risco precisa são necessários. Descrevemos aqui a primeira análise de proteoma de metástases em linfonodos de pacientes em estágio IIIc com sobrevida pobre e boa. Identificamos 84 proteínas que mudam entre os dois grupos de sobreviventes. Vários marcadores identificados foram validados com alta concordância usando espectrometria de massa de monitoramento de reação selecionada. As assinaturas de proteínas obtidas classificam os pacientes com melanoma em dois grupos de prognóstico e podem auxiliar no prognóstico do melanoma metastático.


Introdução

A sobrevida de 5 anos para melanoma clinicamente localizado (American Joint Committee on Cancer, AJCC estágios I e II) varia de 97 a 53%, enquanto o prognóstico para melanoma metastático é pobre, com taxas de sobrevida de 5 anos variando de 70 a 39% para pacientes com envolvimento de linfonodos (AJCC estágio III) e 18 a 6% para pacientes com metástases à distância (AJCC estágio IV) (Balch et al., 2009). Pacientes com doença em estágio III podem ter resultados muito diferentes, particularmente aqueles com metástases nodais volumosas (estágio IIIc de AJCC). Alguns pacientes têm longa sobrevida após os tratamentos atuais, enquanto outros com um estágio AJCC idêntico sobrevivem menos de 6 meses. Atualmente, o prognóstico baseado em fatores histológicos e clínicos é insatisfatório para prever o risco de progressão da doença e resposta à terapia adjuvante. A dificuldade na classificação do melanoma em subgrupos prognósticos e na seleção de tratamentos se reflete na falha em melhorar os resultados da doença avançada. Marcadores prognósticos adicionais são necessários para fornecer diagnósticos e prognósticos mais precisos.

Os fatores histológicos e clínicos usados ​​para o diagnóstico do melanoma são de uso limitado. Os biomarcadores podem fornecer informações prognósticas adicionais com base nos mecanismos moleculares de transformação e progressão da doença. Uma revisão sistemática resume o uso de biomarcadores de proteína visualizados por imunohistoquímica para prever o resultado do melanoma (Rothberg et al., 2009). O perfil da expressão gênica do melanoma produziu uma enorme quantidade de informações que levam à definição de assinaturas moleculares para a progressão da doença (Haqq et al., 2005 Jaeger et al., 2007 Timar et al., 2010), recorrência e sobrevivência (Bogunovic et al., 2009). Por exemplo, o perfil de expressão gênica global foi usado para classificar melanomas de estágio IV de AJCC em quatro subtipos associados a parâmetros biológicos, como pigmentação e resposta imune, com correlação significativa com resultados clínicos (Jonsson et al., 2010). Além disso, as assinaturas de expressão gênica podem prever resultados clínicos em pacientes com melanoma em estágio III (John et al., 2008). Recentemente, em um estudo paralelo a este artigo, Mann et al. (2013) relataram que a presença de mutações BRAF e NRAS, e a ausência de um perfil de transcriptoma relacionado ao sistema imunológico, previu um resultado ruim em pacientes com melanoma em estágio III. O fenótipo de uma célula ou tecido se correlaciona diretamente com os níveis de proteína e suas modificações pós-tradução, mas eles podem não se correlacionar com os níveis de mRNA (Gygi et al., 1999). Vários estudos têm buscado identificar assinaturas de proteínas associadas à progressão da doença do melanoma (Bougnoux e Solassol, 2013).

A análise proteômica de amostras de melanoma de grandes coortes de pacientes é um desafio e pode ser limitada pela falta de tecido fresco. Estudos proteômicos anteriores sobre melanoma usaram principalmente linhas celulares (Bougnoux e Solassol, 2013) que limitam a relevância clínica. Embora uma série de estudos tenham analisado proteomas séricos para identificar biomarcadores de melanoma (Findeisen et al., 2009 Mian et al., 2005), houve poucos estudos proteômicos envolvendo espécimes cirúrgicos, provavelmente devido ao acesso limitado a quantidades adequadas de amostras. MALDI MS dirigido por histologia foi usado para identificar proteínas diferencialmente abundantes de 69 amostras de linfonodos contendo melanoma metastático (estágio III) e 17 controles, linfonodos livres de tumor (Hardesty et al., 2011). Foram identificadas assinaturas de proteínas que permitiram a classificação do tumor e do tecido linfático normal. Apesar dos extensos esforços usando imuno-histoquímica, expressão gênica e perfil de proteína, existem poucos biomarcadores prognósticos validados que predizem o prognóstico independentemente de parâmetros clínicos e patológicos mais facilmente avaliados (Balch et al., 2009 Schramm e Mann, 2011). Alguns estudos sugerem que a proteína S-100B tem valor prognóstico para melanoma em estágio III (Kruijff et al., 2009), mas apenas a lactato desidrogenase sérica (LDH) foi validada como um fator prognóstico independente para melanoma em estágio IV (Deichmann et al. ., 1999). Novos marcadores de prognóstico para patologia diagnóstica de rotina são necessários.

Aqui, nós descrevemos as primeiras análises proteômicas de metástases em linfonodos de pacientes com melanoma em estágio IIIc com resultados de sobrevida ruins e bons. Plataformas complementares de descoberta proteômica, eletroforese em gel de diferença de fluorescência bidimensional (DIGE), marcadores isobáricos para quantificação relativa e absoluta (iTRAQ) e cromatografia líquida bidimensional acoplada a espectrometria de massa em tandem (2DLC-MS / MS) foram usados ​​para identificar diferencialmente proteínas abundantes entre os grupos de sobreviventes. Alguns desses marcadores prognósticos potenciais foram validados usando espectrometria de massa de monitoramento de reação selecionada (SRM) com um método ortogonal de quantificação de proteínas. As assinaturas de proteínas obtidas classificam os pacientes com melanoma nos dois grupos de prognóstico. Proteínas abundantes diferencialmente identificadas aqui fornecem informações sobre os mecanismos moleculares associados a resultados de sobrevida insatisfatórios e, quando validadas de forma independente, devem permitir uma estratificação de risco mais precisa de pacientes com melanoma em estágio III de AJCC.


Biologia para Cursos AP

O controle da expressão gênica em células eucarióticas ocorre em que nível (is)?
uma. apenas o nível transcricional
b. níveis epigenéticos e transcricionais
c. níveis epigenéticos e transcricionais e translacionais
d. níveis epigenéticos e transcricionais, translacionais e pós-traducionais

Problema 2

O que as figuras X e Y no gráfico ilustram?
uma. Transcrição e tradução em uma célula eucariótica (figura X) e uma célula procariótica (figura Y).
b. Transcrição e tradução em uma célula procariótica (figura X) e uma célula eucariótica (figura Y).
c. Transcrição em uma célula eucariótica (figura X) e tradução em uma célula procariótica (figura Y).
d. Transcrição em uma célula procariótica (figura X) e tradução em uma célula eucariótica (figura Y)

Problema 3

Se a glicose estiver ausente, mas a lactose estiver presente, o operon lac será:
uma. ativado
b. reprimido
c. parcialmente ativado
d. mutado

Problema 4

.O que aconteceria se a sequência do operador do operon lac contivesse uma mutação que impedisse a proteína repressora de se ligar ao operador?
uma. Na presença de lactose, o operon lac não será transcrito.
b. Na ausência de lactose, o operon lac será transcrito.
c. O complexo cAMP-CAP não aumentará a síntese de RNA.
d. A RNA polimerase não se liga ao promotor.

Problema 5

O que aconteceria se a sequência do operador do operon trp contivesse uma mutação que impedisse a proteína repressora de se ligar ao operador?
uma. Na ausência de triptofano, os genes trpA-E não serão transcritos.
b. Na ausência de triptofano, apenas os genes trpE e trpD serão transcritos.
c. Na presença do triptofano, os genes trpA-E serão transcritos.
d. Na presença de triptofano, o gene trpE não será transcrito.

Problema 6

O que são modificações epigenéticas?
uma. a adição de alterações reversíveis às proteínas histonas e DNA
b. a remoção de nucleossomos do DNA
c. a adição de mais nucleossomos ao DNA
d. mutação da sequência de DNA

Problema 7

Qual das seguintes afirmações sobre a regulação epigenética é falsa?
uma. A carga da proteína histona torna-se mais positiva quando grupos acetil são adicionados.
b. As moléculas de DNA são modificadas nas ilhas CpG.
c. A metilação do DNA e das histonas faz com que os nucleossomos se compactem fortemente.
d. A acetilação da histona resulta no empacotamento solto dos nucleossomos.

Problema 8

Qual das afirmações a seguir é verdadeira para as mudanças epigenéticas?
uma. Eles apenas permitem a expressão gênica.
b. Eles permitem o movimento das histonas.
c. Eles mudam a sequência de DNA.
d. Eles são sempre hereditários.

Problema 9

A ligação do que é necessário para o início da transcrição?
uma. uma proteína
b. DNA polimerase
c. RNA polimerase
d. um fator de transcrição

Problema 10

Qual seria o resultado de uma mutação que impedisse a produção de proteínas de ligação ao DNA?

uma. diminuição da transcrição porque os fatores de transcrição não se ligam aos locais de ligação da transcrição
b. diminuição da transcrição porque os intensificadores não seriam capazes de se ligar aos fatores de transcrição
c. aumento da transcrição porque os repressores não seriam capazes de se ligar às regiões promotoras
d. aumento da transcrição porque a RNA polimerase seria capaz de aumentar a ligação às regiões promotoras

Problema 11

O que resultará da ligação de um fator de transcrição a uma região potenciadora?
uma. diminuição da transcrição de um gene adjacente
b. aumento da transcrição de um gene distante
c. alteração da tradução de um gene adjacente
d. iniciação do recrutamento de RNA polimerase

Problema 12

Qual das seguintes opções está envolvida no controle pós-transcricional?
uma. controle de splicing de RNA
b. ubiquitinação
c. Clivagem proteolítica
d. fosforilação

Problema 13

Acredita-se que o gene A esteja associado ao daltonismo. A proteína correspondente ao gene A é isolada. A análise da proteína recuperada mostra que, na verdade, existem duas proteínas diferentes que diferem em peso molecular que correspondem ao gene A. Qual é uma das razões pelas quais podem haver duas proteínas correspondentes ao gene?
uma. Uma proteína tinha um cap 5 'e uma cauda poli-A em seu mRNA, e a outra proteína não.
b. Uma proteína tinha uma UTR 5 'e uma UTR 3' em seu RNA, e a outra proteína não.
c. O gene foi emendado alternativamente.
d. O gene produziu moléculas de mRNA com estabilidade diferente.

Problema 14

A ligação de uma proteína de ligação a RNA mudará a estabilidade da molécula de RNA de que maneira?
uma. aumentar
b. diminuir
c. nem aumentar nem diminuir
d. aumentar ou diminuir

Problema 15

Uma mutação no 5'UTR que evita que qualquer proteína se ligue à região irá:
uma. aumentar ou diminuir a estabilidade da molécula de RNA
b. impedir a tradução da molécula de RNA
c. prevenir o splicing da molécula de RNA
d. aumentar ou diminuir o comprimento da cauda poli-A

Problema 16

Modificações pós-tradução de proteínas podem afetar qual dos seguintes?
uma. splicing de mRNA
b. 5’capping
c. 3’poliadenilação
d. modificações químicas

Problema 17

Uma mutação é encontrada em eIF-2 que prejudica o início da tradução. A mutação pode afetar todas as funções do eIF-2, exceto uma. Qual deles não seria afetado?
uma. A mutação impede que o eIF-2 se ligue ao RNA.
b. A mutação impede que o eIF-2 seja fosforilado.
c. A mutação impede que o eIF-2 se ligue ao GTP.
d. A mutação impede que o eIF-2 se ligue à subunidade ribossômica 40S

Problema 18

A adição de um grupo ubiquitina a uma proteína faz o quê?
uma. aumenta a estabilidade da proteína
b. diminui a tradução da proteína
c. aumenta a tradução da proteína
d. marca a proteína para degradação

Problema 19

Como são chamados os genes causadores do câncer?
uma. genes de transformação
b. genes supressores de tumor
c. oncogenes
d. protooncogenes

Problema 20

As terapias direcionadas são usadas em pacientes com um determinado padrão de expressão gênica. Uma terapia direcionada que evite a ativação do receptor de estrogênio no câncer de mama seria benéfica para que tipo de paciente?
uma. pacientes que expressam o receptor EGFR em células normais
b. pacientes com uma mutação que inativa o receptor de estrogênio
c. pacientes com superexpressão de ER alfa em suas células tumorais
d. pacientes com superexpressão de VEGF, o que ajuda na angiogênese tumoral

Problema 21

Em um novo tratamento para o câncer, um vírus do resfriado é geneticamente modificado para se ligar, entrar e se replicar nas células, fazendo com que elas se rompam. O vírus do resfriado modificado não pode se replicar quando a proteína p53 do tipo selvagem está presente na célula. Como esse tratamento trata o câncer sem prejudicar as células saudáveis?
uma. O vírus modificado apenas infecta e entra nas células cancerosas.
b. O vírus modificado se replica em células normais e cancerosas.
c. O vírus modificado apenas infecta e entra nas células normais.
d. O vírus modificado se replica apenas em células cancerosas.

Problema 22

Uma droga projetada para reativar genes silenciados em células cancerosas resultaria em quê?
uma. prevenir a metilação de DNA e desacetilação de histonas
b. prevenir a metilação de DNA e acetilação de histonas
c. prevenir desacetilação de DNA e metilação de histonas
d. prevenir acetilação de DNA e desmetilação de histonas

Problema 23

Quais são os reguladores positivos do ciclo celular que podem causar câncer quando chamados de mutantes?
uma. genes de transformação
b. genes supressores de tumor
c. oncogenes
d. genes mutados

Problema 24

O que melhor distingue as células procarióticas das eucarióticas?
uma. Os procariontes possuem um núcleo, enquanto os eucariotos não, mas os eucariotos apresentam maior
compartimentalização que permite maior regulação da expressão gênica.
b. As células eucariotas contêm um núcleo, enquanto os procariontes não, e os eucariotos apresentam maior
compartimentalização que permite maior regulação da expressão gênica.
c. As células procarióticas são menos complexas e realizam expressão gênica altamente regulada, enquanto
eucariotos realizam expressão gênica menos regulada.
d. As células eucarióticas são mais complexas e realizam expressão gênica menos regulada, enquanto
as células procarióticas realizam uma expressão gênica altamente regulada.

Problema 25

Qual afirmação está correta a respeito da distinção entre expressão gênica procariótica e eucariótica?
uma. Os procariotos regulam a expressão gênica no nível da transcrição, enquanto os eucariotos regulam a
níveis múltiplos, incluindo epigenético, transcricional e translacional.
b. Os procariotos regulam a expressão gênica no nível da tradução, enquanto os eucariotos regulam no nível da transcrição para manipular os níveis de proteína.
c. Os procariotos regulam a expressão gênica com a ajuda de repressores e ativadores, enquanto os eucariotos regulam a expressão degradando os transcritos de mRNA, controlando assim a proteína
níveis.
d. Os procariotos controlam os níveis de proteínas usando modificações epigenéticas, enquanto os eucariotos controlam os níveis de proteínas regulando a taxa de transcrição e tradução.

Problema 26

Todas as células de um organismo compartilham o genoma. No entanto, durante o desenvolvimento, algumas células se desenvolvem em
células da pele, enquanto outras se desenvolvem em células musculares. Como as mesmas instruções genéticas podem resultar em dois tipos de células diferentes no mesmo organismo? Explique completamente sua resposta.

Problema 27

Qual das afirmações a seguir descreve a transcrição procariótica do operon lac?
uma. Quando a lactose e a glicose estão presentes no meio, a transcrição do operon lac é
induzido.
b. Quando a lactose está presente, mas a glicose está ausente, o operon lac é reprimido.
c. A lactose atua como um indutor do operon lac quando a glicose está ausente.
d. A lactose atua como um indutor do operon lac quando a glicose está presente.

Problema 28

O operon lac consiste em regiões regulatórias, como o promotor, bem como os genes estruturais lacZ, lacY e lacA, que codificam para proteínas envolvidas no metabolismo da lactose. Qual seria o resultado de uma mutação em um dos genes estruturais do operon lac?
uma. A mutação em genes estruturais irá interromper a transcrição.
b. O lacY mutado produzirá uma proteína $ beta $ galactosidase anormal.
c. O lacA mutado produzirá uma proteína que transferirá um grupo acetil para $ beta $ galactosidase.
d. A transcrição continuará, mas a lactose não será metabolizada adequadamente.

Problema 29

Em algumas doenças, a alteração das modificações epigenéticas desliga genes que são normalmente expressos.
Hipoteticamente, como você poderia reverter esse processo para ativar esses genes novamente?

Problema 30

O Flowering Locus C (FLC) é um gene responsável pela floração em certas plantas. O FLC se expressa em novas mudas, o que impede a floração. Após a exposição a baixas temperaturas, a expressão de FLC diminui e a planta floresce. A FLC é regulada por meio de modificações epigenéticas. Que tipo de modificações epigenéticas estão presentes em novas mudas e após a exposição ao frio?
uma. Em novas mudas, as acetilações das histonas estão presentes na exposição ao frio, ocorre a metilação.
b. Em novas mudas, desacetilações de histonas estão presentes na exposição ao frio, ocorre metilação.
c. Em novas mudas, metilação de histonas estão presentes na exposição ao frio, ocorre acetilação.
d. Em novas mudas, metilação de histonas estão presentes na exposição ao frio, ocorre desacetilação

Problema 31

Uma mutação na região do promotor pode alterar a transcrição do gene. Descreva como isso pode acontecer.
uma. Os promotores mutados diminuem a taxa de transcrição, alterando o local de ligação para o fator de transcrição.
b. Os promotores mutados aumentam a taxa de transcrição, alterando o local de ligação para o fator de transcrição.
c. Os promotores mutados alteram o local de ligação para fatores de transcrição para aumentar ou diminuir o
taxa de transcrição.
d. Os promotores mutados alteram o local de ligação para fatores de transcrição e, assim, cessam a transcrição do gene adjacente.

Problema 32

O que poderia acontecer se uma célula tivesse muito de um fator de transcrição de ativação presente?
uma. A taxa de transcrição aumentaria, alterando a função celular.
b. A taxa de transcrição diminuiria, inibindo as funções celulares.
c. A taxa de transcrição diminui devido ao entupimento dos fatores de transcrição.
d. A taxa de transcrição aumenta devido ao entupimento dos fatores de transcrição.

Problema 33

3. A via de transcrição $ wnt $ é responsável por mudanças importantes durante o desenvolvimento animal. Com base na via de transcrição mostrada abaixo. Neste diagrama, as setas indicam a transformação de uma substância em outra. Linhas quadradas, ou as linhas sem pontas de seta, indicam inibição do produto abaixo da linha. Com base nisso, como o aumento da expressão do gene $ wnt $ afetaria a expressão de Bar-1?
FIGURA 16.16

Problema 34

Descreva como os RBPs podem impedir que miRNAs degradem uma molécula de RNA.
uma. RBPs podem se ligar primeiro ao RNA, evitando assim a ligação do miRNA, que degrada o RNA.
b. RBPs ligam o miRNA, protegendo assim o mRNA da degradação.
c. Os RBPs metilam o miRNA para inibir sua função e, assim, interromper a degradação do mRNA.
d. Os RBPs direcionam a degradação do miRNA com a ajuda de um complexo de proteína DICER.

Problema 35

Como os estímulos externos podem alterar o controle pós-transcricional da expressão gênica?
uma. Os raios ultravioleta podem alterar a metilação e acetilação das proteínas.
b. As proteínas de ligação ao RNA são modificadas por meio da fosforilação.
c. Estímulos externos podem causar desacetilação e desmetilação do transcrito.
d. Os raios ultravioleta podem causar dimerização das proteínas de ligação ao RNA.

Problema 36

As modificações de proteínas podem alterar a expressão gênica de várias maneiras. Descreva como a fosforilação de proteínas pode alterar a expressão gênica.
uma. A fosforilação de proteínas pode alterar a tradução, transporte de RNA, estabilidade de RNA ou modificação pós-transcricional.
b. A fosforilação de proteínas pode alterar a replicação de DNA, divisão celular, reconhecimento de patógenos
e estabilidade do RNA.
c. As proteínas fosforiladas afetam apenas a tradução e podem causar câncer ao alterar o p53
função.
d. As proteínas fosforiladas afetam apenas o transporte de RNA, a estabilidade do RNA e a pós-tradução
modificações.

Problema 37

Mudanças nas modificações epigenéticas alteram a acessibilidade e a transcrição do DNA. Descreva como
estímulos ambientais, como a exposição à luz ultravioleta, podem modificar a expressão gênica.
uma. Os raios ultravioleta podem causar metilação e desacetilação dos genes que podem alterar a acessibilidade e a transcrição do DNA.
b. Os raios ultravioleta podem causar fosforilação e acetilação do DNA e das histonas, o que pode alterar as capacidades de transcrição do DNA.
c. Os raios ultravioleta podem causar metilação e fosforilação das bases do DNA, que podem tornar-se dimerizadas, impossibilitando a acessibilidade do DNA.
d. Os raios ultravioleta podem causar metilação e acetilação das histonas, tornando o DNA mais compactado e levando à inacessibilidade.

Problema 38

Novos medicamentos estão sendo desenvolvidos para diminuir a metilação do DNA e prevenir a remoção de grupos acetil das proteínas histonas. Explique como essas drogas podem afetar a expressão gênica para ajudar a matar as células tumorais.
uma. Essas drogas mantêm as formas desmetilada e acetilada do DNA para manter “ligada” a transcrição dos genes necessários.
b. As formas desmetilada e acetilada do DNA são revertidas quando o gene silenciado é expresso.
c. A droga metila e acetila os genes silenciados para ativá-los novamente.
d. As drogas mantêm a metilação e a acetilação do DNA para silenciar genes sem importância nas células cancerosas.

Problema 39

Como a compreensão do padrão de expressão do gene em uma célula cancerosa pode dizer algo sobre essa forma específica de câncer?
uma. Compreender os padrões de expressão gênica em células cancerosas identificará os genes defeituosos, o que é útil para fornecer o tratamento medicamentoso relevante.
b. Compreender a expressão gênica ajudará a diagnosticar células tumorais para terapia com antígenos.
c. O perfil do gene identificaria os genes-alvo dos patógenos causadores do câncer.
d. Pacientes com câncer de mama que não expressam EGFR podem responder à terapia anti-EGFR.

Problema 40

Explique o que é medicina personalizada e como ela pode ser usada para tratar o câncer.
uma. Os medicamentos personalizados variam com base no tipo de mutações e no padrão de expressão do gene.
b. Os medicamentos são administrados com base no tipo de tumor encontrado no corpo de um indivíduo.
c. Os medicamentos personalizados são fornecidos com base apenas nos sintomas do paciente.
d. Os medicamentos tendem a variar dependendo da gravidade e do estágio do câncer.

Problema 41

Qual das alternativas a seguir é encontrada tanto em procariotos quanto em eucariotos?
uma. Caudas poli-A 3 ’
b. 5 'caps
c. promotores
d. íntrons

Problema 42

A enzima ployadenilato polimerase catalisa a adição de monofosfato de adenosina às extremidades 3 'dos ​​mRNAs para formar uma cauda poli-A. Se a enzima fosse bloqueada de forma que não pudesse funcionar, o resultado seria:
uma. aumento da estabilidade do mRNA em eucariotos e diminuição da estabilidade do mRNA em procariotos
b. diminuição da estabilidade do mRNA em eucariotos e nenhum efeito em procariotos
c. nenhum efeito em eucariotos e aumento da estabilidade do mRNA em procariotos
d. nenhum efeito em eucariotos e diminuição da estabilidade do mRNA em procariotos

Problema 43

Descreva duas maneiras pelas quais a regulação gênica difere e duas maneiras pelas quais ela é semelhante em procariotos e eucariotos.
uma. Os procariontes mostram tradução co-transcricional, enquanto os eucariotos realizam a transcrição antes
à tradução em ambos os tipos de células, a regulação ocorre por meio da ligação de fatores de transcrição, ativadores e repressores.
b. Os procariontes realizam a transcrição antes da tradução, enquanto os eucariotos mostram a tradução cotranscricional (os processos ocorrem na mesma organela).
c. Os procariontes mostram a tradução co-transcricional que é regulada antes da tradução, enquanto os eucariotos realizam a transcrição antes da tradução, que é regulada apenas no nível da transcrição. Em ambos os domínios, fatores de transcrição, ativadores e repressores fornecem regulação.
d. Os procariotos mostram tradução co-transcricional que ocorre no núcleo, enquanto os eucariotos
mostram a transcrição antes da tradução. Em ambos os tipos de células, a regulação ocorre usando fatores de transcrição, ativadores e repressores.

Problema 44

Digestão da lactose em $ E $. coli começa com sua hidrólise pela enzima $ beta $ -galactosidase. O gene que codifica $ beta $ -galactosidase, lacZ, é parte de um operon regulado coordenadamente que contém outros genes necessários para a utilização da lactose. Qual das figuras a seguir descreve corretamente as interações no operon $ lac $ quando a lactose não está sendo utilizada?

Problema 45

Qual seria o resultado de uma mutação na proteína repressora que a impediu de se ligar à lactose?
uma. O repressor se liga à lactose quando ela é removida do operador.
b. O repressor irá ligar o operador na presença de lactose.
c. O repressor não liga o operador na presença de lactose.
d. O repressor não ligará o operador na ausência de lactose.

Problema 46

Que tipo de modificação pode ser observada no gene GR em todos os ratos recém-nascidos?
uma. O DNA terá muitas moléculas de metila.
b. O DNA terá muitas moléculas de acetila.
c. O DNA terá poucos grupos metil.
d. As histonas terão muitos grupos acetil.

Problema 47

Que tipo de modificação será observada no gene GR em ratos altamente nutridos?
uma. O DNA terá muitas moléculas de metila.
b. O DNA terá muitas moléculas de acetila.
c. O DNA terá poucos grupos metil.
d. As histonas terão poucos grupos acetil.

Problema 48

O nível de transcrição de um gene é testado criando deleções no gene, conforme mostrado na ilustração. Esses genes modificados são testados quanto ao seu nível de transcrição: $ (++) $ níveis normais de transcrição $ (+) $ níveis baixos de transcrição $ (+++) $ níveis altos de transcrição. Qual deleção está em um potenciador envolvido na regulação do gene?
uma. deleção 1
b. deleção 2
c. deleção 3
d. deleção 4

Problema 49

Qual deleção está em um repressor envolvido na regulação do gene?
uma. deleção 1
b. deleção 2
c. deleção 3
d. deleção 4

Problema 50

O diagrama fornecido mostra diferentes regiões (1-5) de uma molécula de pré-mRNA, uma molécula de mRNA maduro e a proteína correspondente ao mRNA. Uma mutação em que região tem maior probabilidade de causar danos à célula?
uma. 1
b. 2
c. 3
d. 5

Problema 51

A que as regiões 1 e 5 correspondem?
uma. exons
b. íntrons
c. promotores
d. untranslated regions

Problem 52

What are regions 1 through 5 in the diagram?
uma. 1, 3, and 5 are exons 2 and 4 are introns.
b. 2 and 4 are exons 1,3, and 5 are introns.
c. 1 and 5 are exons 2, 3, and 4 are introns.
d. 2, 3, and 4 are exons 1 and 5 are introns.

Problem 53

A mutation results in the formation of the mutated maturemRNA as indicated in the diagram. Describe what type of mutation occurred and what the likely outcome of the mutation is.
uma. Mutation in the GU-AG sites of introns produced a non-functional protein.
b. A transversion mutation in the introns led to alternative splicing, producing a functional protein.
c. A transversion mutation in the GU-AG site mutated this mRNA, producing a non-functional protein.
d. Transition mutations in the introns could produce a functional protein.

Problem 54

The diagram illustrates the role of p53 in response to UV exposure. What would be the result of a mutation in the p53 gene that inactivates it?
uma. Skin will peel in response to UV exposure.
b. Apoptosis will occur in response to UV exposure.
c. No DNA damage will occur in response to UV exposure.
d. No peeling of skin will occur in response to UV exposure.

Problem 55

Which of the following will not occur in response to UV exposure if a p53 mutation inactivates the p53
proteína?
1. Damage to DNA
2. p53 activation
3. p21 activation
4. Apoptosis
uma. 1, 2, and 3
b. 3 and 4
c. 3
d. 2, 3, and 4

Problem 56

What happens when tryptophan is present?
uma. The repressor binds to the operator, and RNA synthesis is blocked.
b. RNA polymerase binds to the operator, and RNA synthesis is blocked.
c. Tryptophan binds to the repressor, and RNA synthesis proceeds.
d. Tryptophan binds to RNA polymerase, and RNA synthesis proceeds.

Problem 57

What happens in the absence of tryptophan?
uma. RNA polymerase binds to the repressor
b. the repressor binds to the promoter
c. the repressor dissociates from the operator
d. RNA polymerase dissociates from the promoter

Problem 58

Anabaena is a simple multicellular photosynthetic cyanobacterium. In the absence of fixed nitrogen, certain newly developing cells along a filament express genes that code for nitrogen-fixing enzymes and become nonphotosynthetic heterocysts. The specialization is advantageous because some nitrogen-fixing enzymes function best in the absence of oxygen. Heterocysts do not carry out photosynthesis but instead provides adjacent cells with fixed nitrogen and receives fixed carbon and
reduced energy carriers in return. As shown in the diagram above, when there is low fixed nitrogen in the environment, an increase in the concentration of free calcium ions and 2-oxyglutarate stimulates the expression of genes that produce two transcription factors (NtcA and HetR) that promote the expression of genes responsible for heterocyst development. HetR also causes production of a
signal, PatS, that prevents adjacent cells from developing as heterocysts. Based on your understanding of the ways in which signal transmission mediates cell function, which of the following predictions is most consistent with the information given above?
uma. In an environment with low fixed nitrogen, treating the Anabaena cells with a calciumbinding compound should prevent heterocyst differentiation.
b. A strain that overexpresses the patS gene should develop many more heterocysts in a low nitrogen environment.
c. In an environment with abundant fixed nitrogen, free calcium levels should be high in all cells,
preventing heterocysts from developing.
d. In environments with abundant fixed nitrogen, loss of the hetR gene should induce heterocyst
desenvolvimento.

Problem 59

Which of the following statements about Anabaena is false?
uma. Decreasing the concentration of free calcium ions will prevent heterocyst development.
b. In the presence of fixed nitrogen, NtcA will not be expressed.
c. Low fixed nitrogen levels result in increased PatS levels.
d. A mutation in NtcA that makes it nonfunctional will also allow adjacent cells to develop as heterocysts.

Problem 60

The operon model describes expression in prokaryotes. Describe this model and the essential difference in the way in which expression is regulated in eukaryotes.


Prokaryotic Transcription Regulation

Visão geral

  • Prokaryotic gene expression is regulated primarily at the level of transcription.
  • Prokaryotic genes are organized into groups called operons.
  • Transcription regulation is primarily through inducing or repressing the operons.
  • Genes are always on in the absence of other factors (e.g., repressors)

Operons

Operons are clusters of coregulated genes plus all the components that come together to regulate those genes. Operons contain 2 primary regions of DNA sequences:

  • Regulatory region contains:
    • Promoter: binds sigma factor and RNA polymerase to initiate transcription
    • Operator: a DNA sequence that can bind a repressor
      • Repressor: proteins that prevent RNA polymerase from moving down the gene
      • Transcription is inhibited when repressors bind to their operators.
      • Often contains multiple genes for several different proteins
      • These genes are either all turned on or all turned off.

      Example of a prokaryotic operon:
      Prokaryotic gene expression is regulated primarily at the level of transcription.
      Operons are clusters of coregulated genes in prokaryotes.

      Inducible operons

      Inducible operons are operons that are off in the “normal” state and turn on under certain conditions. A common example is the lac operon in Escherichia coli. Under normal circumstances, E. coli uses glucose for energy. When glucose is unavailable and/or lactose is present, the presence of lactose induces the lac operon:

      • Coding region: contains genes involved in lactose metabolism
      • Regulatory region codes for:
        • A repressor
        • An activator: catabolite activator protein (CAP)

        Lac operon:
        In the presence of lactose, expression is activated.

        Gene regulation via the lac repressor:

        • Lactose prevents the binding of the repressor to the operator sequence
        • In the presence of lactose: repressor is unable to bind → transcription of the genes can occur
        • When lactose is absent: repressor binds to the operator sequence → transcription is inhibited because the RNA polymerase is blocked
        • Therefore, the presence of lactose induces the transcription of genes for lactose metabolism.

        Gene regulation via the CAP activator:

        • When glucose is low: CAP is produced → binds to the enhancer region (see “Enhancer sequences” below) → activates/accelerates transcription
        • When glucose is abundant: CAP is not produced → transcription is not enhanced

        Repressible operons

        Repressible operons are operons that are on in the “normal” state and turn off under certain conditions. The trp operon is a common example:


        Hormônios are the messenger molecules of the endocrine system. Endocrine hormones travel throughout the body in the blood. However, each hormone affects only certain cells, called target cells. UMA Célula Alvo is the type of cell on which a hormone has an effect. A target cell is affected by a particular hormone because it has receptor proteins that are specific to that hormone. A hormone travels through the bloodstream until it finds a target cell with a matching receptor it can bind to. When the hormone binds to a receptor, it causes a change within the cell. Exactly how this works depends on whether the hormone is a hormônio esteróide ou um non-steroid hormone.

        Steroid Hormones

        Steroid hormones are made of lipids, such as phospholipids and cholesterol. They are fat soluble, so they can diffuse across the plasma membrane of target cells and bind with receptors in the cytoplasm of the cell (see Figura abaixo). The steroid hormone and receptor form a complex that moves into the nucleus and influences the expression of genes, essentially acting as a transcription factor. Examples of steroid hormones include cortisol and sex hormones.

        A steroid hormone crosses the plasma membrane of a target cell and binds with a receptor inside the cell.

        Non-Steroid Hormones

        Non-steroid hormones are made of amino acids. They are not fat soluble, so they cannot diffuse across the plasma membrane of target cells. Instead, a non-steroid hormone binds to a receptor on the cell membrane (see Figura abaixo). The binding of the hormone triggers an enzyme inside the cell membrane. The enzyme activates another molecule, called the segundo mensageiro, which influences processes inside the cell. Most endocrine hormones are non-steroid hormones, including insulin and thyroid hormones.

        A non-steroid hormone binds with a receptor on the plasma membrane of a target cell. Then, a secondary messenger affects cell processes.


        Manipulating Cx43 expression triggers gene reprogramming events in dermal fibroblasts from oculodentodigital dysplasia patients

        Oculodentodigital dysplasia (ODDD) is primarily an autosomal dominant disorder linked to over 70 GJA1 gene [connexin43 (Cx43)] mutations. For nearly a decade, our laboratory has been investigating the relationship between Cx43 and ODDD by expressing disease-linked mutants in reference cells, tissue-relevant cell lines, 3D organ cultures and by using genetically modified mouse models of human disease. Although salient features of Cx43 mutants have been revealed, these models do not necessarily reflect the complexity of the human context. To further overcome these limitations, we have acquired dermal fibroblasts from two ODDD-affected individuals harbouring D3N and V216L mutations in Cx43, along with familial controls. Using these ODDD patient dermal fibroblasts, which naturally produce less GJA1 gene product, along with RNAi and RNA activation (RNAa) approaches, we show that manipulating Cx43 expression triggers cellular gene reprogramming. Quantitative RT-PCR, Western blot and immunofluorescent analysis of ODDD patient fibroblasts show unusually high levels of extracellular matrix (ECM)-interacting proteins, including integrin α5β1, matrix metalloproteinases as well as secreted ECM proteins collagen-I and laminin. Cx43 knockdown in familial control cells produces similar effects on ECM expression, whereas Cx43 transcriptional up-regulation using RNAa decreases production of collagen-I. Interestingly, the enhanced levels of ECM-associated proteins in ODDD V216L fibroblasts is not only a consequence of increased ECM gene expression, but also due to an apparent deficit in collagen-I secretion which may further contribute to impaired collagen gel contraction in ODDD fibroblasts. These findings further illuminate the altered function of Cx43 in ODDD-affected individuals and highlight the impact of manipulating Cx43 expression in human cells.

        Palavras-chave: collagen connexin43 extracellular matrix fibroblast gap junctional intercellular communication oculodentodigital dysplasia.


        MATERIAIS E MÉTODOS

        Stimuli

        Opsonized bacteria were prepared as described previously [20]. Briefly, cultures of E. coli K-12 strain R594supO grown overnight in Luria-Bertani medium were diluted 1:100 and further incubated for 2 h at 37°C. The bacteria were then opsonized with 20% (v/v) complement factor C7-deficient human serum (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in Hanks’ balanced salt solution (HBSS) without calcium and magnesium (Life Technologies, Grand Island, NY) at 37°C for 20 min. Serum deficient in C7 was used to avoid complement-induced cell lysis. Opsonized bacteria were washed twice in HBSS with 10% heat-inactivated, low-endotoxin fetal calf serum (HyClone, Logan, UT) and were resuspended at 1 × 10 10 /mL in HBSS. LPS (from E. coli 026:B6 Sigma Chemical Co.) and fMLP (Sigma Chemical Co.) were dissolved in HBSS.

        Isolation and stimulation of leukocytes

        Neutrophils were isolated from venous blood (freshly drawn at 8–9 am ) of healthy volunteers, using dextran sedimentation and centrifugation through Ficoll-Paque Plus (Pharmacia, Uppsala, Sweden), as described previously [20]. Morphologically, the neutrophil preparations were more than 99% pure except for the presence of 1–3% eosinophils and <0.75% monocytes. Freshly purified neutrophils, ∼2.5 × 10 8 cells for each time point, were suspended at ∼2 × 10 6 ml − 1 in 80–100 ml RPMI medium (Life Technologies), supplemented with 10% heat-inactivated donor serum (from a previous blood draw, frozen after heat-inactivation at 56°C for 30 min). Neutrophils were equilibrated to room temperature, then stimulated by addition of opsonized E. coli (20:1 ratio of E. coli to neutrophils), fMLP (10 − 7 M), or LPS (10 ng/mL), and incubated at 37°C with gentle agitation in a temperature-controlled water bath. For each time-course, a time-zero control was harvested before stimulation and subsequent samples at 10, 20, 30, and 60 min of incubation, plus a 120-min time-point for E. coli and LPS. Rapid chilling and then centrifugation at 1100 g at 4°C terminated the incubation. Because of inter-donor differences in gene expression [25], we adopted a repeated-measures design of the experiments to treat the data as within-subjects variables to isolate each set of time-points for each neutrophil isolation from each donor. Each stimulation time-course was repeated at least three times with different donors.

        Human monocytes were prepared and stimulated as described previously [26]. In brief, peripheral blood mononuclear cells were separated from leukopheresis samples by Ficoll-Paque density gradient centrifugation and allowed to adhere onto serum-coated, plastic, six-well, tissue-culture dishes (2×10 6 cells/well) for 2 h at 37°C in a 5% CO2 incubator. Nonadherent cells were removed by gentle washes, and half the wells with the purified monocytes adhering to the plastic were harvested for total RNA using RNAeasy (Qiagen, Valencia, CA). Monocytes were immunostained with anti-CD-14 antibody to assure ≥95% purity.

        The manufacturer certified all reagents—serum, buffers, media, and containers—as nonpyrogenic. Peripheral blood and leukopheresis samples were obtained from normal adult volunteers. The University of Massachusetts Medical Center Committees on Protection of Human Subjects in Research (Worcester) and Yale University Human Investigation Committee (New Haven, CT) approved all procedures and consent forms at their respective sites.

        RNA sampling and oligonucleotide array hybridization

        Total RNA was extracted from neutrophils by a guanidine HCl method, as described previously [27, 28]. RNA samples were digested with DNase I at 37°C for 30 min and cleaned by passage through RNeasy mini-spin columns (Qiagen). Running aliquots on native agarose gels monintored the quality of RNA. Each RNA sample (10 μg) was used as starting material for cRNA preparation, as described previously [29]. In vitro transcription by T7 RNA polymerase (Ambion, Austin, TX) was performed in a nucleotide triphosphate mixture containing the biotinylated reagents Bio-11-CTP and Bio-16-UTP (Enzo Life Sciences, Famingdale, NY). Labeled cRNA samples and fragmentations were checked on native agarose gels, and 15 μg fragmentation products were hybridized to HG_U95A version 2 GeneChip arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA), according to the manufacturer's instructions.

        Data analysis

        Affymetrix MicroArray Suite version 5.0 managed raw data output, with average intensity (target signal) set as 150. The absolute expression (detection) analysis used the statistical algorithm of Microarray Suite 5.0. To reduce noise in E. coli time-course samples as a result of bacterial RNA contamination, raw signals were fitted to the Li and Hung [30] and Li and Wong [31] noise model, implemented in DNA chip-analyzer software (dChip http://www.dchip.org/). The probe-sensitivity index file generated from all of the non-E. coli time-course samples was applied to all data, including the E. coli samples, to generate model-based expression index (MBEI) values. The Log2-transformed MBEIs were first filtered by a flooring filter that is, at least one group (stimulus and time) needed to have signal values up to the average signal level of marginal calls [Log2(MBEI)=7 or MicroArray Suite 5.0 signal=128 (for details, see Table S1 in the online supplementary material)]. The floored MBEI data were used for an F-test of each time-course by significance analysis of microarrays (SAM) software [32], a multiple testing approach based on permutation resampling and designed for microarray analysis involving small numbers of replicates. The MBEI data without log transformation were used for a group-comparison analysis, implemented in dChip, which calculates weighted group means to reduce bias and uses a lower 90% confidence bound of relative change for filtering. The “Affy” package of the R project BioConductor (http://www.bioconductor.org/) [29, 33], which is based on different assumptions and uses a different normalization approach, was used to generate the median polish estimates of expression levels. The data normalized by Affy were subjected to filtering with same floor filter as described above and to the SAM multiclass test using F statistics with the same setting.

        Genes were classified as showing a significant change in expression level if they met the following criteria for an arbitrary threshold of relative change in comparisons of group means and a P-value threshold in statistical hypothesis testing: For at least for one time-point and stimulus, the weighted mean of the gene's expression level had a relative change ≥1.8-fold (lower 90% confidence bound-of-fold change) and an absolute difference ≥64 compared with its corresponding time-zero group and for at least one stimulation time-course, the gene must be rejected by SAM using F statistics with a false discovery rate set at 0.01.

        Genes with significantly different levels of expression over the time-course, as identified by the approach described above, were then subjected to hierarchical clustering to group the genes according to similarity defined by correlation coefficient. The k-means cluster was used to test the stability of the hierarchical clusters. The functional annotations of significant genes were organized with GoSurfer software (http://biosun1.harvard.edu/complab/gosurfer). Small, relevant branches and unresolved genes (with limited or ambiguous Gene Ontology annotation) were merged manually, based on information in National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) databases.

        Real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR)

        RT and PCR analysis using real-time PCR verified microarray findings for multiple genes [34]. Target regions for PCR primers were selected from the human oligonucleotide set for use in microarray and PCR measures of RNA designed by the Harvard-Lipper Center for Computational Genetics [35] (http://arep.med.harvard.edu/probes.htm) and based on the human UniGene dataset Build #158 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) or from Affymetrix probe selection regions within the target sequence of the Affymetrix HG_U133 set (http://www.affymetrix.com/analysis/download_center.affx), based on human UniGene Build #133. Primers were designed to yield amplicons of 100–150 bp.

        Aliquots of the same RNA samples used for microarray analyses served as templates for the RT reactions. First-strand cDNA was synthesized from 50 ng DNaseI-treated, total RNA using SuperScript II RT (Life Technologies, Rockville, MD). Quantitative PCR was performed on a Smart Cycler (Cepheid, Sunnyvale, CA), using SYBR Green I fluorescent dye (QuantiTech SYBR Green PCR, Qiagen). A comparative threshold cycle (Ct) method was used to process the real-time PCR data [36]. A panel of six constitutively expressed genes, most from the Affymetrix HG-U133A set normalization controls (http://www.affymetrix.com/support/technical/byproduct.affx?product=hgu133), was chosen as reference genes for normalization. Results were calculated as the normalized difference in Ct for a given time-point relative to the time-zero baseline (ΔΔCt), calculated by subtracting the Ct of the reference gene from the Ct of the target gene for each time point (ΔCt) and then subtracting the ΔCt, cb of time zero from the ΔCt, q of time-point. Amplicon size and specificity were verified by agarose gel electrophoresis.

        Principal component analysis of transcription factors

        To analyze the differences and similarities between neutrophils and monocytes in resting or activated states, we examined the expression profiles of 474 transcription factor genes that had at least one sample with an Affymetrix “present call”. We performed a principal component analysis among 31 datasets representing resting neutrophils, neutrophils stimulated with E. coli for 30 or 120 min, resting monocytes, and monocytes stimulated with E. coli for 120 min. As a preliminary step in searching for differentially expressed transcription factor genes among the five different cell types, we excluded 180 transcription factor genes for which we did not have complete data or genes that have Affymetrix “absent calls” in all samples. To verify that the 31 samples are separable into five distinctive groups, despite the expected sample similarities among related cell types, we visualized their distribution in a reduced, two-dimensional space. To reduce the dimensionality from 474 (the number of transcription factors used in profiling each sample), we used a variant of principal components analysis. This procedure allows projection of the data onto a two-dimensional space spanned by the two leading principal components, which are the linear combinations of the normalized expression values of the 474 transcription factors that capture most of the variance of the complete data.

        The projections of the samples onto the leading principal components are computed by applying the singular value decomposition technique on the transformed data matrix. The latter is obtained by a preprocessing, normalization step, as described recently [37]. We selected a normalization procedure based on the concept that two genes and likewise, two samples, whose expression profiles differ only by a multiplicative constant of proportionality, are really behaving in the same way. That is, we consider two genes (each represented by a row of the matrix) or two samples (represented by the columns of the matrix) to be equivalent if their expression profiles differ by a multiplicative constant. This adjustment involves independent rescaling of the rows and columns as described previously [37].

        To identify the differentially expressed transcription factors that have at least one cell type with a mean normalized-expression value significantly different from means of samples of other cell types, we applied a one-way ANOVA [38] and its nonparametric Kruskal-Wallis test [39]. Transcription factors that return P values <0.0001 using the classical ANOVA or <0.01 using its nonparametric version cast doubt on the null hypothesis that the means of all cell types are equal. Pequena P values suggest that at least one sample mean is significantly different than the other sample means. By applying the classical one-way ANOVA, we identified a subset of 96 transcription factors with P values <0.0001. In the ANOVA test, it is assumed that all sample populations have equal variance and are normally distributed (in addition to the assumption that all observations are mutually independent) therefore, we also applied the less-restrictive Kruskal-Wallis test on this subset of 96 genes. We found that 90% of genes have P values <0.001, indicating that both tests select similar lists of differentially expressed genes. Once we identified a differentially expressed transcription factor, we determined which pairs of the normalized expression means of the different cell types are significantly different using a multiple comparison procedure [40] based on Tukey's honestly significant difference criterion as a conservative test. This procedure is designed to provide an upper bound on the probability that any comparison will be incorrectly found significant. The output contains the estimated difference in means of each pair of cell types and an adjustable confidence interval for the difference, which we fixed at 99.99%. If the confidence interval does contain zero, the difference would not be significant at the 0.0001 level. Thus, if the confidence interval of the difference of means of two cell types does not contain zero, we considered the transcription factor to have significant differential expression between this pair of cell types.


        Conclusão

        Although stability regulation might reasonably be considered as a cellular measure to bridge the gap between the very rapid events of signal transduction and the longer term induction of cellular programs involving the coordinated transcription of batteries of new gene synthesis, the current data actually suggests otherwise. One of the goals in this work was to examine changes in gene expression due to altered transcription and those due to altered turnover across a time course allowing sufficient time for the resolution of time disparities between new mRNA synthesis and their appearance as measurable cellular pools. Sufficient time for effective transcription and even translation was clearly demonstrated by the example of NFKB1 mRNA induction followed by the transcription of its downstream targets. Patterns of stability regulated genes were, in this model system, non-random and surprisingly persistent throughout the entire time course suggesting that stability regulation was a major component in the control of gene expression for significant periods of time. The presence of highly active and global regulation of polyA mRNA levels by stability-altering mechanisms suggests a new significant level of regulation in the control of gene expression which spans wide phylogenetic distances from yeast [15] to humans, emphasizes a possible parsimonious role for new gene synthesis in response to changing cellular environments, and may help to explain some of the difficulties encountered in attempts to comprehensively correlate clustered changes in polyA mRNA with common promoter regulatory elements.


        Additional files

        Additional file 1: Figure S1.

        Data generated on naïve CD4+ T cells and memory CD4+ T cells. Basic metrics assaying the quality of generated data are provided for each dataset generated. (PDF 60 kb)

        Additional file 2: Figure S2.

        Sequence variants identified in the genome and classification of SNPs in protein coding regions. (A) Total number of SNPs, insertions, deletions and substitutions identified from whole genome sequencing data. (B) Proportion of synonymous and non-synonymous SNPs identified in the coding region of the genome among non-synonymous SNPs (nsSNPs), proportion of conservative and non-conservative homozygous and heterozygous changes are shown. (C) nsSNP frequency across various molecular classes of genes. (PDF 68 kb)

        Additional file 3: Figure S3.

        Distribution of assembled transcripts based on abundance (FPKM) and corresponding read density. The x-axis represents abundance threshold (FPKM) and y-axis represents read density. The red and green lines represent the Gaussian Mixture Model that was applied to assembled transcripts. The abundance threshold (represented by vertical dotted line) separates transcripts identified as true positives on the right (supported by more reads) from those identified as potential false positives on the left (supported by less reads). The two screenshots taken from genome browser demonstrates examples of high read density and low read density. (PDF 226 kb)

        Additional file 4: Table S1.

        A list of genes expressed in naïve CD4+ T cells. (XLSX 403 kb)

        Additional file 5: Table S2.

        A list of novel transcripts and novel spliced isoforms identified in naïve CD4+ T cells. (XLSX 9927 kb)

        Additional file 6: Table S3.

        A list of known and novel miRNAs identified in naïve CD4+ T cells. (XLSX 22 kb)

        Additional file 7: Figure S4.

        Example of a miRNA identified and the distribution of reads across a predicted hairpin structure. Putative novel miRNA identified from small RNA-Seq. Predicted stem loop structure, mature region and star regions are shown. (PDF 50 kb)

        Additional file 8: Table S4.

        A list of proteins identified in naïve CD4+ T cells. (XLSX 634 kb)

        Additional file 9: Table S5.

        A list of uncharacterized proteins annotated as open reading frames in public databases that were identified in naïve CD4+ T cells. (XLSX 16 kb)

        Additional file 10: Table S6.

        A list of genes displaying allele specific expression. (XLSX 15 kb)

        Additional file 11: Figure S5.

        Strategy employed for determining potential RNA editing sites . The workflow that was followed to filter out false positive RNA-editing sites is shown. Examples of false positives due to mismapping of reads and uncalled SNPs is demonstrated with sequence alignment. Abbreviations (SNP: single nucleotide polymorphism RDD: RNA-DNA difference CNV: copy number variation). (PDF 65 kb)

        Additional file 12: Figure S6.

        Proteogenomic pipeline. Custom protein databases that were used for searching tandem mass spectrometry data for proteogenomic annotation. (PDF 59 kb)

        Additional file 13: Table S7.

        A list of peptides supporting novel exons or exon extensions identified using proteogenomics strategy. (XLSX 9 kb)

        Additional file 14: Table S8.

        A list of known and novel signal peptide cleavage sites identified for membrane/secreted proteins expressed in naïve CD4+ T cells. (XLSX 11 kb)

        Additional file 15:Table S9.

        A list of annotated pseudogenes that encode proteins in naïve CD4+ T cells with the corresponding peptide evidence from proteomics data. (XLSX 9 kb)

        Additional file 16: Figure S7.

        Comparison of a protein’s abundance versus its transcriptional abundance. Scatterplot of protein abundance versus transcript abundance is shown. Transcript abundance is represented as FPKM (log2) on the x-axis and protein abundance is represented as normalized iBAQ (log2) on the y-axis. (PDF 487 kb)

        Additional file 17: Figure S8.

        Correlation between miRNA read count, transcript, and protein abundance. (A) Protein abundance versus miRNA read count. The x axis for each circle represents all miRNAs identified with a given read count while the y axis corresponds to the average iBAQ value of the genes targeted by those miRNAs with the specified read count. The dashed red line represents the iBAQ value of genes that are not targeted by any miRNAs identified in this study and serves as a background, reference level of protein expression. The black line is a linear regression of iBAQ values versus the miRNA read count. (B) Transcript abundance versus miRNA read count. The x axis for each circle represents all miRNAs identified with a given read count while the y axis corresponds to the average FPKM value of the genes targeted by those miRNAs with the specified read count. The dashed red line represents the FPKM levels of genes that are not targeted by any miRNAs identified in this study and serves as a background, reference level of transcript abundance. The black line is a linear regression of FPKM values versus miRNA read count. There is no obvious correlation between FPKM values and miRNA read counts. (PDF 150 kb)

        Additional file 18: Figure S9.

        DNA methylation pattern across various gene features on all protein coding genes in naïve CD4+ T cells. The x-axis represents various gene features in protein coding genes (TSS1500 - 1,500 bp upstream of transcription start site, TSS200 - 200 bp upstream of transcription start site, 5′ UTR – 5′ untranslated region, 1 st exon, gene body and 3′ UTR – 3′ untranslated region) and the y-axis represents beta value which is an estimate of methylation level. Box-Whisker plots show median methylation levels at each gene feature across all protein coding genes in naïve CD4+ T cells. (PDF 1313 kb)

        Additional file 19: Figure S10.

        Correlation of methylation level at different gene features with transcript and protein expression levels. (A) Promoter methylation level and corresponding transcript abundance Methylation levels are represented by Beta values and transcript abundance is represented by FPKM values. (B) Scatterplots showing methylation levels at different gene features and transcript abundance. Methylation levels are represented on the x-axis and transcript abundance is represented on the y-axis. The red dot represents the mean methylation levels and transcript abundances. Spearman’s correlation coefficent is represented below each scatterplot. (C) Promoter methylation level and corresponding protein abundance (iBAQ values from Fig. 4). (D) Scatterplots showing methylation levels at different gene features and protein abundance. Methylation levels are represented on the x-axis and protein abundance is represented on the y-axis. The red dot represents the mean methylation levels and protein abundances. Spearman’s correlation coefficent is represented below each scatterplot. (PDF 1087 kb)

        Additional file 20: Figure S11.

        Correlation of methylation and transcript levels of genes between memory and naïve CD4+ T cells. (A) Intersection of promoter methylation and mRNA expression data from naïve and memory T cells. Genes marked in red in the upper left quadrant showed significantly reduced expression in naïve CD4+ T cells due to promoter hypermethylation. Genes that showed the opposite trend are shown in the bottom right quadrant. (PDF 185 kb)

        Additional file 21: Table S10.

        A list of regulatory methylation sites derived from TCGA data. (XLSX 418 kb)

        Additional file 22: Table S11.

        Pathways enriched from Gene Set Analysis of genes correlating with TCGA dataset 1 or dataset 2. (XLSX 12 kb)

        Additional file 23: Figure S12.

        Concordance of this study with Komori et al. (A) Each blue dot represents the methylation level of a gene. On the x-axis are the methylation differences between memory and naïve cells measured by Komori et al. and on the y-axis are TSS200 methylation levels measured in this study. The r 2 value is a pearson’s correlation coefficient between the two datasets. (B) Each blue dot represents the methylation level of a gene. On the x-axis are the methylation differences between memory and naïve cells where Komori et al. provided quantitative values and on the y-axis are the TSS200 methylation levels measured in this study. The r 2 value is a pearson’s correlation coefficient between the two datasets. (C) Genes identified in Komori et al. as displaying inverse correlation between methylation levels and transcription are plotted. On the left axis and shown in blue are the log2 transformed fold change of transcript levels between memory and naïve cells measured by Komori et al. and on the right axis and shown in green are log2 transformed fold change of transcript levels between memory and naïve cells measured in this study. (D) The correlation between the log2 transformed fold changes of genes between memory and naïve cells measured in each study is shown. Each blue dot represents a gene and the r 2 is a pearson’s correlation coefficient. (PDF 1410 kb)

        Additional file 24: Figure S13.

        Cell surface proteins of naïve CD4+ T cells and their expression compared to resting memory CD4+ T cells (A) Cell surface proteins found in this study are compared against those found by Graessel et al. (B) iTRAQ measurements within this study are shown for cell surface proteins that Graessel et al. found to be increased in activated naïve CD4+ T cells. (PDF 75 kb)

        Additional file 25.

        Supplemental methods. (DOC 41 kb)

        Additional file 26: Figure S14.

        Purity of naïve CD4+ T cells and memory CD4+ T cells. (A) FACS-plot showing the purity of naïve CD4+ T cells. (B) FACS-plot showing the purity levels of memory CD4+ T cells. (PDF 71 kb)


        Assista o vídeo: Remendel - Resolução comentada - Aula 06 e 07 Parte 2 (Fevereiro 2023).