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O que é a taxa de captura de núcleos de multipleto?

O que é a taxa de captura de núcleos de multipleto?


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Conheci essa terminologia em uma publicação.https: //core.ac.uk/download/pdf/226940818.pdf. Está na última frase do segundo parágrafo do texto. Tentei pesquisar, mas não obtive uma definição conclusiva. É um parâmetro importante durante o processamento de dados snRNA-seq?


É a taxa de captura de múltiplos núcleos. Eles falam sobre isso na seção suplementar perto do final do artigo. Eles diluíram a amostra processada para obter uma estimativa de 2.000 núcleos por microlitro. Eles então querem que a máquina processe núcleos individuais, mas não podem dizer a partir dos resultados se dois ou mais núcleos são processados ​​simultaneamente (o que daria um sinal misto). É por isso que eles estimam a taxa de múltiplos núcleos usando um experimento separado com núcleos de uma mistura de células de camundongo e humanas.


Sequenciamento de DNA direcionado altamente multiplexado de núcleos únicos

Os métodos de sequenciamento de DNA de uma única célula são desafiados pela cobertura física deficiente, altas taxas de erros técnicos e baixo rendimento. Para resolver esses problemas, desenvolvemos um protocolo de sequenciamento de DNA de célula única que combina classificação de fluxo de núcleos únicos, amplificação de deslocamento múltiplo limitado no tempo (MDA), preparação de biblioteca de baixa entrada, código de barras de DNA, captura direcionada e sequenciamento de próxima geração (NGS). Esta abordagem representa uma grande melhoria em relação ao nosso papel anterior de sequenciamento de núcleo único (SNS) Nature Protocols em termos de geração de dados de cobertura mais alta (& gt90%), permitindo assim a detecção de variantes de todo o genoma em células de mamíferos individuais na resolução de par de bases. Além disso, agrupando 48-96 bibliotecas de célula única para captura direcionada, esta abordagem pode ser usada para sequenciar muitas bibliotecas de célula única em paralelo em uma única reação. Este protocolo reduz muito o custo do sequenciamento de DNA de uma única célula e pode ser concluído em 5 a 6 dias por usuários avançados. Este protocolo de sequenciamento de DNA de célula única tem amplas aplicações para estudar células raras e populações complexas em diversos campos da pesquisa biológica e da medicina.

Bonecos

Visão geral do protocolo. Etapa 1: tecido ...

Visão geral do protocolo. Etapa 1: o tecido ou as células são lisados ​​e as suspensões nucleares são ...

Pipeline de processamento de dados. ( uma…

Pipeline de processamento de dados. ( uma ) Alinhamento de leituras de sequenciamento com a referência ...

Classificação de fluxo e gating para único ...

Triagem de fluxo e gating para isolamento de núcleo único. ( uma ) Os núcleos são classificados por fluxo ...

Controle de qualidade WGA usando qPCR…

Controle de qualidade WGA usando painéis qPCR. Para cada célula, uma série de ...

Distribuições de tamanho de inserção de biblioteca de DNA ...

A biblioteca de DNA insere distribuições de tamanho em diferentes etapas durante o protocolo. Microchip Bioanalyzer ...

Profundidade e largura da cobertura para ...

Profundidade e amplitude de cobertura para 46 células individuais multiplexadas. ( uma , b…

Métricas de taxa de erro técnico para ...

Métricas de taxa de erro técnico para 46 células simples multiplexadas. As taxas de erro técnico foram ...


O que é a taxa de captura de núcleos de multipleto? - Biologia

Scanner de vulnerabilidade rápido e personalizável baseado em DSL simples baseado em YAML.

O Nuclei é usado para enviar solicitações entre destinos com base em um modelo que leva a zero falsos positivos e fornece varredura rápida em um grande número de hosts. Nuclei oferece varredura para uma variedade de protocolos, incluindo TCP, DNS, HTTP, Arquivo, etc. Com modelos poderosos e flexíveis, todos os tipos de verificações de segurança podem ser modelados com Nuclei.

Temos um repositório dedicado que contém vários tipos de modelos de vulnerabilidade fornecidos por mais de 100 pesquisadores e engenheiros de segurança. Ele é pré-carregado com modelos prontos para usar usando o sinalizador -update-templates.

Mais métodos de instalação podem ser encontrados aqui.

Você pode baixar e atualizar os modelos de núcleos usando a bandeira de núcleos que baixa todos os núcleos-modelos do projeto Github, uma lista de modelos com curadoria da comunidade que estão prontos para uso.

O Nuclei foi projetado para ser usado com modelos personalizados de acordo com o destino e o fluxo de trabalho. Você pode escrever seus próprios cheques para seu fluxo de trabalho e necessidades específicas. Consulte o guia de modelagem de núcleos para escrever seus próprios modelos personalizados.

Isso exibirá ajuda para a ferramenta. Aqui estão todos os interruptores que ele suporta.

Procurando CVEs em uma determinada lista de URLs.

Exemplos mais detalhados de núcleos em execução podem ser encontrados aqui.

O Nuclei oferece um grande número de recursos que são úteis para os engenheiros de segurança personalizarem o fluxo de trabalho em suas organizações. Com as variedades de recursos de varredura (como DNS, HTTP, TCP), os engenheiros de segurança podem criar facilmente seu conjunto de verificações personalizadas com o Nuclei.

  • Variedades de protocolos suportados: TCP, DNS, HTTP, Arquivo, etc
  • Alcance etapas complexas de vulnerabilidade com fluxos de trabalho e solicitações dinâmicas.
  • Fácil de integrar ao CI / CD, projetado para ser facilmente integrado ao ciclo de regressão para verificar ativamente a correção e o reaparecimento da vulnerabilidade.

Para caçadores de recompensas:

O Nuclei permite que você personalize sua abordagem de teste com seu próprio conjunto de verificações e execute facilmente seus programas de recompensa de bug. Além disso, os núcleos podem ser facilmente integrados em qualquer fluxo de trabalho de digitalização contínua.

  • Projetado para ser facilmente integrado ao fluxo de trabalho de outra ferramenta.
  • Pode processar milhares de hosts em poucos minutos.
  • Automatize facilmente sua abordagem de teste personalizado com nosso YAML DSL simples.

Verifique nossos outros projetos de código aberto que podem se encaixar em seu fluxo de trabalho de recompensa de bug: github.com/projectdiscovery, também hospedamos atualização diária de dados DNS no Chaos.

Para pentesters:

Os núcleos melhoram imensamente como você aborda a avaliação de segurança, aumentando os processos manuais repetitivos. As consultorias já estão convertendo suas etapas de avaliação manual com o Nuclei, o que lhes permite executar um conjunto de sua abordagem de avaliação personalizada em milhares de hosts de maneira automatizada.

Os pen-testers obtêm todo o poder de nossos modelos públicos e recursos de personalização para acelerar seu processo de avaliação e, especificamente, com o ciclo de regressão, onde você pode facilmente verificar a correção.

  • Crie facilmente sua lista de verificação de conformidade, conjunto de padrões (por exemplo, OWASP Top 10).
  • Com recursos como fuzz e fluxos de trabalho, etapas manuais complexas e avaliações repetitivas podem ser facilmente automatizadas com o Nuclei.
  • Fácil de testar novamente a correção da vulnerabilidade apenas executando novamente o modelo.

Para desenvolvedores e organizações

O Nuclei foi construído com a simplicidade em mente, com modelos apoiados pela comunidade por centenas de pesquisadores de segurança, ele permite que você fique atualizado com as ameaças de segurança mais recentes usando a varredura contínua do Nuclei nos hosts. Ele é projetado para ser facilmente integrado ao ciclo de testes de regressão, para verificar as correções e eliminar vulnerabilidades que ocorram no futuro.

  • CI / CD: Os engenheiros já estão utilizando Nuclei em seu pipeline de CI / CD, o que lhes permite monitorar constantemente seus ambientes de preparação e produção com modelos personalizados.
  • Ciclo de regressão contínua: Com o Nuclei, você pode criar seu modelo personalizado em cada nova vulnerabilidade identificada e colocá-lo no motor Nuclei para eliminar o ciclo de regressão contínuo.

Temos um tópico de discussão em torno disso, já existem alguns programas de recompensa de bugs dando incentivos aos hackers para escrever modelos de núcleos a cada envio, que os ajuda a eliminar a vulnerabilidade em todos os seus ativos, bem como eliminar o risco futuro de reaparecimento em produções . Se você estiver interessado em implementá-lo em sua organização, sinta-se à vontade para entrar em contato conosco. Teremos o maior prazer em ajudá-lo no processo de introdução, ou você também pode postar no tópico de discussão para obter ajuda.

Obrigado a todos os incríveis colaboradores da comunidade por enviarem PRs. Verifique também os projetos de código aberto semelhantes abaixo que podem se encaixar no seu fluxo de trabalho:

Nuclei é distribuído sob licença MIT


Análise do comportamento em ratos de laboratório 1

Ian Q. Whishaw,. Bryan Kolb, em The Laboratory Rat (segunda edição), 2006

E. Comportamento Social

O comportamento social pode ser definido como todo comportamento que influencia ou é influenciado por outros membros da mesma espécie. O termo, portanto, abrange todas as atividades sexuais e reprodutivas e todos os comportamentos que tendem a aproximar os indivíduos, bem como todas as formas de comportamento agressivo (Grant, 1963). É tradicional descrever o comportamento sexual separadamente (ver o material a seguir) e, nos últimos anos, o comportamento agressivo também passou a ser visto como uma forma separada de comportamento social (ver o material a seguir). É geralmente reconhecido que o comportamento social não é um comportamento unitário com uma base neurológica unitária. Em vez disso, diferentes aspectos do comportamento social têm diferentes bases neurais e endócrinas (Moyer, 1968). Portanto, é necessário examinar o comportamento social em várias situações diferentes antes de concluir que um determinado tratamento produziu uma mudança geral no comportamento social. As mudanças comportamentais podem ser específicas da situação.

A maioria dos estudos de comportamento social em roedores geralmente utiliza algum tipo de teste de interação livre em que um grupo de sujeitos é alojado em uma grande gaiola de grupo, muitas vezes com várias câmaras interconectadas (Lubar et al., 1973). Uma versão menos natural tem animais emparelhados em uma situação nova, muitas vezes repetidamente ao longo dos dias (Latane, 1970). Em ambas as situações, o comportamento é gravado em vídeo e pode ser analisado calculando comportamentos específicos, como o tempo de contato, ou escrevendo uma descrição detalhada dos comportamentos, conforme descrito por Grant e Mackintosh (1963). Outros comportamentos, como vocalizações (Francis, 1977) ou marcação de urina (Brown, 1975), também podem ser registrados.


Psicofarmacologia

Pádraig Wright, Michael F. O & # x27Neill, em Core Psychiatry (Terceira Edição), 2012

Serotonina

Os neurônios serotonérgicos se originam nos núcleos dorsal e mediano da rafe no tronco cerebral (Fig. 39.2). Eles se projetam para a medula e medula espinhal, o cerebelo, o sistema límbico e estriado e o córtex. Acredita-se que os sistemas serotonérgicos sejam essenciais para o sono, o apetite e o humor porque:

A função serotonérgica reduzida pode causar insônia e depressão

A função serotonérgica aprimorada pode causar redução do apetite e perda de peso

A maioria dos medicamentos de AD aumenta a neurotransmissão serotonérgica.

Bioquímica

A serotonina (5HT) é sintetizada a partir do triptofano e degradada pela MAO em ácido 5-hidroxiindolacético (Fig. 39.3). Os subtipos de receptores serotonérgicos incluem 5HT 1A – 1F, 5HT2A – 2C, 5HT3, 5HT4, 5HT5A – 5C, 5HT6 e 5HT7.

Aspectos clínicos

Inibidores seletivos da recaptação de 5HT (SSRI), drogas da AD, como a fluoxetina, aumentam a concentração sináptica de 5HT ao inibir sua recaptação para o neurônio pré-sináptico pelo transportador 5HT. Os TCAs como a amitriptilina têm um efeito semelhante, enquanto a maioria dos TCAs também promovem a liberação de 5HT na sinapse. Os IMAOs aumentam a 5HT sináptica ao inibir a MAO, sua enzima catalítica.

As anfetaminas aumentam a 5HT sináptica, causando sua liberação na sinapse, enquanto a dietilamina do ácido lisérgico (LSD) e a psilocibina são 5HT1A e 5HT2A e HT 2C agonistas parciais.


MÉTODOS

Cepas e cultura que não envelhecem

Usamos o seguinte C. elegans cepas neste estudo: PD4810 (lmn-1: GFP, ccIs4810 [pJKL380.4 Plmn-1::lmn-1:: gfp ::lmn-1 3′UTR + pMH86 dpy20(+)]), YG751 (lmn-1-GFP:unc-84 null [pJKL380.4 Plmn-1 :: lmn-1 :: gfp :: lmn-1 3′UTR + pMH86 dpy20 (+) unc-84 (e1174)]). C. elegans as cepas foram mantidas e manipuladas sob condições padrão, conforme descrito anteriormente (Brenner, 1974). As cepas foram cruzadas pelo menos três vezes para garantir um fundo limpo.

Cultura de nematóides e alongamento

C. elegans as cepas foram branqueadas em NaOH 0,06 M, solução de hipoclorito de sódio a 0,5%. A sincronização de L1 foi realizada incubando os embriões em placas de meio de crescimento de nematóide vazio (NGM) por 18 h a 20 ° C. Nemátodos L1 foram lavados em tampão M9 (3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1M MgSO4, H2O a 1 l esterilizar em autoclave) e semeado novamente em placas contendo um gramado fino de bactérias OP50 / RNAi. Nemátodos sincronizados com L4 tardios foram coletados em tubos Eppendorf e lavados três vezes. Para apoiar a adesão, 0,2% de polil-lisina (Sigma P2636) foi adicionado em igual volume e suplementado com 10 µl de solução anti-desbotamento (9 partes de glicerol, 1 parte de solução salina tamponada com fosfato 10X, 0,1 parte de 20% (wt / vol ) n-propilgalato (Sigma P3130) em dimetilsulfóxido). Os nematóides puderam se estabelecer por alguns minutos.

Os nemátodos foram transferidos para o centro de uma folha quadrada de silício de 4 ″ x 4 ″ (cortada de 12 ″ x 12 ″, membrana de silício NRV G / G 40D de 0,005 ″, SMI) em 20 gotículas separadas. Os nemátodos foram então cobertos por uma segunda folha de silicone e as bolhas de ar retidas foram removidas. Os nemátodos “ensanduichados” foram colocados num dispositivo de alongamento (Zuela et al., 2016) e montado no topo de um microscópio invertido (microscópio invertido Nikon Eclipse Ti-U, equipado com um Nikon S Plan fluor ELWS 40X / 0,60 para experimentos PD4810 e um Plan Apo VC 20X / 0,75 para experimentos YG751). O alongamento equiaxial foi realizado dentro do plano conjugado do microscópio e a gravação de lapso de tempo (câmera Andor Zyla 4.2 sCMOS controlada com software NIS Elements 4.5.00) foi realizada tanto em contraste de fase de campo brilhante quanto em canais de fluorescência (luz Nikon Intensilight C-HGFI fonte e conjunto de filtros Chroma ET-EGFP [FITC / Cy2]).

Processamento de imagens, análises mecânicas e estatísticas

Nemátodos inteiros (canal de campo claro) e núcleos (canal de fluorescência EGFP) foram segmentados usando ImageJ. Conforme descrito no texto principal, a área projetada, o comprimento do contorno e as distâncias foram calculados usando as ferramentas ImageJ. As análises viscoelásticas e o ajuste da curva foram realizados conforme descrito em detalhes no texto principal usando Matlab-2018a (Mathworks).

Perturbações de drogas do citoesqueleto

Latrunculin-A (Lat-A Sigma L5163) foi recentemente diluída em meio M9 a 5 mM. Cinco gotas (150 µl no total) foram adicionadas ao gramado de bactérias OP50 das placas NGM para atingir a cobertura total e deixadas para secar. Nemátodos L1 sincronizados foram colocados no topo das placas imersas com a droga a 20 ° C por 24 h até atingir o estágio de desenvolvimento apropriado (L4 tardio).

Experimentos de RNAi

O knockdown de RNAi de genes alvo foi realizado através da alimentação de bactérias, conforme descrito anteriormente (Timmons et al., 2001). Escherichia coli clones foram obtidos das bibliotecas Vidal e Ahringer RNAi (Kamath e Ahringer, 2003 Kim et al., 2005). O clone L4440 foi usado como um controle de vetor vazio. Lmn-1 e unc-84 knockdown foi realizado usando os vetores DY3.2 e F54B11.3, respectivamente. Especificamente, nemátodos L1 de sincronização foram transferidos para placas de alimentação a 20 ° C e os experimentos foram realizados no estágio final de L4, conforme descrito acima.

Experimentos de alongamento de envelhecimento

L1 PD4810 sincronizados foram colocados em placas NGM a 20 ° C por 24 h, até atingir o estágio final L4. Nemátodos L4 tardios (D0) foram extraídos por colheita para experimentos subsequentes. Os nematóides restantes foram incubados a 20 ° C por mais 12 h até atingir o estágio adulto. Nemátodos adultos foram transferidos por colheita em novas placas NGM e incubados a 20 ° C. Os nemátodos adultos de dois dias (D2) foram extraídos colhendo 36 h após a transferência para experiências subsequentes. Os restantes nemátodos foram transferidos por colheita para novas placas NGM e incubados durante 48 h adicionais a 20 ° C. Nemátodos adultos de quatro dias (D4) foram então extraídos por colheita para experimentos subsequentes. Nemátodos extraídos foram transferidos para gotículas M9 e colocados em uma placa de NGM sem sementes por 10 min para remover bactérias OP50 residuais. Os nemátodos foram então transferidos para uma única gota de 1 µl contendo 3: 1 M9: mistura anti-desbotamento e colocados no centro de uma folha de silício quadrada de 4 "x 4". O alongamento do nemátodo foi realizado colocando uma segunda membrana no topo e montada no aparelho de alongamento como descrito acima. Cada faixa etária consistia de 20 nematóides.

Western blotting

Para eliminar a contribuição do Ce-lamin embrionário para a calibração dos níveis de Ce-lamin em adultos em todas as faixas etárias, usamos a cepa de nematóide CF512 estéril sensível à temperatura [(b26) II fem-1 (hc17) IV]. Embriões CF512 branqueados foram sincronizados conforme descrito acima. Os nemátodos L1 foram transferidos para OP50 contendo placas NGM e incubados a 25 ° C durante 24 h. 150 nematóides L4 tardios (D0) foram coletados para Western blotting e os nematóides restantes foram transferidos para novas placas de NGM e incubados a 25 ° C (24 h) seguido por 20 ° C (24 h). 150 nematóides de 2 dias de idade (D2) foram coletados para Western blotting. Os restantes nemátodos foram transferidos para novas placas NGM e incubados a 20 ° C (48 h). 150 nemátodos com quatro dias de idade (D4) foram recolhidos para Western blotting.

Western blotting foi realizado conforme descrito anteriormente (Towbin et al., 1979 Banco et al., 2011). Resumindo, as amostras de nemátodos foram lavadas três vezes em tampão M9 e imersas em 100 µl de tampão M9. Os nemátodos foram lisados ​​pela adição de uma mistura de 900 µl de tampão de lise RIPA (Tris-Cl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, EGTA 0,5 mM, Triton X-100 a 1%, desoxicolato de sódio 0,1%, SDS 0,1%, 140 mM NaCl), inibidor de protease X25 (coquetel de inibidor de protease cOmplete por Sigma Aldrich) e fluoreto de fenilmetilsulfonil 0,1 M (PMSF Sigma P7626) em proporções de volume de 95: 4: 1. As soluções de lisado de nemátodes foram centrifugadas a 2.000 rpm durante 2 min. O sobrenadante foi removido e o sedimento foi dissolvido em 200 µl de tampão de lise RIPA-PI-PMSF. As amostras foram submetidas a quatro ciclos de congelamento-descongelamento em nitrogênio líquido e sonicação (sonicador Sonics Vibra Cell com um modelo CV33 microtip em 34% de amplificação 4 × 10 s períodos de sonicação). As amostras foram submetidas a dois ciclos de congelamento e descongelamento e centrifugadas a 7500 rpm por 5 min a 4 ° C. O sobrenadante foi coletado e transferido para um novo tubo Eppendorf para uso.

Os níveis de proteína total foram calibrados usando o ensaio de ácido bicinconínico (BCA) (kit ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay, OD medido com leitor de placa múltipla multimodo sinergy 2 da BioTek). As amostras foram executadas em um gel de poliacrilamida SDS a 9%, transferidas para uma membrana de nitrocelulose e manchadas usando anticorpo anti-Ce-lamin (Keyhole limpet hemocyanin (KLH) - peptídeo C-terminal conjugado de Ce-lamin VEFSESSDPSDPADRC soro 3932, sangramento 6, diluição de 1: 1000). Imagens de quimioluminescência foram adquiridas (Vilber Fusion FX). Os níveis de Ce-lamin foram quantificados medindo as intensidades de banda total normalizadas para os níveis de proteína total.


Dados estendidos Fig. 1 Amostra e contribuição da doença de tipos de células capturados por snRNA-seq.

uma, Imagens representativas selecionadas de suspensões nucleares (controle, n = 9) após ultracentrifugação e antes da captura por 10x Genomics confirmando contra-coloração nuclear DAPI com presença de núcleos DAPI + menores e maiores. Observe que os núcleos maiores são co-corados com anticorpo anti-NeuN, confirmando a origem neuronal (pontas de seta brancas). b, Colori t-SNE gráficos mostrando o número de genes (esquerda) e UMIs (direita) por núcleos capturados de amostras de controle e MS. c, Colori t-SNE plot visualizando núcleos de diferentes estágios de lesão com base no clássico estadiamento de lesão MS patológica. Controle agudo, agudo crônico-ativo crônico, crônico inativo ctrl. d, Colori t-SNE gráficos visualizando núcleos de amostras com diferentes níveis de desmielinização cortical de camada superior e profunda, bem como desmielinização subcortical. e, Representante t-SNE gráficos com genes marcadores específicos do tipo de célula para células progenitoras OL, células do estroma incluindo pericitos, células endoteliais e leucócitos. Para tGráficos -SNE, dados mostrados de 9 amostras de controle e 12 amostras de MS e um total de 48.919 núcleos.

Dados estendidos Fig. 2 Mudanças moleculares em subtipos de neurônios corticais em lesões de EM.

uma, NORAD e PPIA padrões de expressão em neurônios corticais e subtipos gliais selecionados. Observe a expressão da linha de base de NORAD e PPIA em subtipos neuronais versus gliais e suprarregulação preferencial de ambos NORAD e PPIA em ENs da camada cortical superior (L2 – L3 EN (EN-L2-3) e L4 EN (EN-L4)) em tecido de lesão MS versus neurônios excitatórios e inibitórios da camada cortical profunda (L5 – L6 EN (EN- L5-6) e IN-SST). Para todos t-SNE e gráficos de violino, os dados são mostrados a partir de 9 amostras de controle e 12 amostras de MS. Para tGráficos -SNE, dados de 48.919 núcleos são mostrados. Para gráficos de violino L2 – L3 EN, L4 EN e L5 – L6 EN, os dados são mostrados de 6.120, 3.125 e 3.058 núcleos. Os gráficos de caixa dentro dos gráficos de violino representam a mediana e o desvio padrão da expressão do gene. b, Visualização de termos GO enriquecidos em células L2 – L3 EN, L4 EN e L5 – L6 EN com base na análise DGE (regressão linear de modelo misto). O teste binomial com correção de FDR foi usado para calcular FDR corrigido P valores usando genes diferencialmente expressos em núcleos L2 – L3 EN, L4 EN e L5 – L6 EN (n = 428, 364 e 327, respectivamente).

Dados estendidos Fig. 3 Neurônio cortical e análise de subtipo de linfócitos em lesões de EM.

uma, t-SNE plotagens para expressão específica de subtipo de neurônio de RORB, THY1, NRGN, SST, SV2C e PVALB (deixou). LAST (controle, n = 5) mostrando expressão específica de camada de neuronal RORB na camada cortical intermediária 4 e expressão generalizada do marcador de neurônio piramidal THY1 com enriquecimento na camada 5 observe que SST-expressando INs preferencialmente mapear para camadas corticais profundas. Estudos de co-expressão (controle, n = 5) com SYT1 confirmar a expressão neuronal de RORB, THY1 e SST (pontas de setas pretas). b, Mapa de calor com agrupamento hierárquico de transcritos associados a linfócitos, permitindo subcluster de linfócitos em células T, células B e células plasmáticas com base na expressão do gene marcador (canto superior esquerdo). t-SNE gráficos para células B típicas (células plasmáticas) e genes marcadores de células T enriquecidos em aglomerados de linfócitos (canto superior direito). Imunohistoquímica para proteína adaptadora de células T SKAP1 (ponta de seta preta marca SKAP1 + células T) juntamente com transcriptômica espacial para células B associadas IGHG1 que codifica a imunoglobulina G1 (IgG1) (pontas de seta magenta em baixo à esquerda) observe a expressão aumentada do gene marcador associado às células plasmáticas MZB1 (canto superior esquerdo) e enriquecimento preferencial de MZB1 + e IGHG1-expressão de células plasmáticas (pontas de setas brancas, embaixo à direita) em tecido meníngeo inflamado versus infiltração mista de células T e B em punhos perivasculares de lesões subcorticais (embaixo). Uma ressalva a essas descobertas é o número relativamente pequeno de amostras de tecido de MS, que limitou nossa capacidade de agrupar as populações de células T. Para t-SNE plotagens (uma, b) e clustering hierárquico (b), os dados são mostrados a partir de 9 amostras de controle e 12 amostras de MS. Para t-SNE gráficos, dados mostrados para todos os 48.919 núcleos para agrupamento hierárquico, os dados são mostrados de 53 núcleos no agrupamento de células B. Para hibridização in situ e experimentos de imunohistoquímica em b, imagens representativas mostradas a partir de seções de tecido individuais (controle, n = 4 MS, n = 7).

Dados estendidos Fig. 4 Análise de agrupamento de astrócitos e oligodendrócitos e transcriptômica espacial em lesões de MS.

uma, Padrões de expressão espacial diferencial de GFAP astroglial em desmielinização subcortical versus cortical por imunohistoquímica (esquerda) t-SNE gráficos visualizando genes específicos de astrócitos correspondentes a todos (RFX4), protoplasmático (SLC1A2, GPC5) e astrócitos fibrosos ou reativos (GFAP, CD44) Quantificação de RFX4 + sinais de hibridização in situ por núcleos em GM e WM de validação de amostras de controle RFX4 como um marcador astrócito canônico (controle, n = 5) quantificação de GPC5 + e CD44 + sinais de hibridização in situ por RFX4 + astrócitos valida GPC5 como GM protoplasmático e CD44 como marcador WM fibroso. Mann-Whitney bicaudal você-testes foram realizados. Os dados são média ± s.e.m. b, Upregulation of astroglial CRYAB, MT3 (pontas de seta pretas) e transcrição do receptor de endotelina tipo B EDNRB (ponta de seta branca) em astrócitos reativos em lesões subcorticais. c, tGráficos -SNE mostrando expressão específica de OL de genes que codificam mielina MBP, CNP e fator de transcrição ST18 observe a co-expressão de ST18 com PLP1 em WM de controle por hibridização in situ. d, Visualização de termos GO enriquecidos em OLs de mielinização com base na análise de DGE. O teste binomial com correção de FDR foi usado para calcular FDR corrigido P valores usando 151 genes diferencialmente expressos em OLs. e, Estudos transcriptômicos espaciais de co-expressão que confirmam a regulação positiva do transcrito 90 da proteína de choque térmico HSP90AA1 em ambos os progenitores (PDGFRA-expressivo) e mielinizante (PLP1-expressando) OLs nas bordas da lesão (PPWM, pontas de seta pretas). O asterisco preto indica um vaso sanguíneo. Para t-SNE e gráficos de violino, dados mostrados a partir de 9 amostras de controle e 12 amostras de MS. Para gráficos de violino de astrócitos, 1.571 núcleos de controle e 3.810 MS são mostrados. Os gráficos de caixa dentro dos gráficos de violino representam a mediana e o desvio padrão da expressão do gene. Para hibridização in situ e experimentos de imuno-histoquímica, imagens representativas de três seções de tecido de controle e quatro MS individuais são mostradas.

Dados estendidos Fig. 5 Análise de agrupamento de subtipos de microglia ativados e fagocitando.

A análise de agrupamento hierárquico identifica vários subtipos de microglia homeostáticos e específicos para MS ativada de acordo com os estágios da lesão inflamatória, permitindo o estadiamento transcriptômico dos subtipos de microglia. Aglomerados com genes enriquecidos são marcados e anotados com a – f (consulte a Tabela Suplementar 7 para obter a lista de genes). Observe que as células de fagocitose são identificadas pela presença de OL e genes codificados associados à mielina (cluster f na parte inferior do mapa de calor).

Dados estendidos Fig. 6 PCR para rato Mbp da preparação de mielina.

uma, Coloração de Coomassie representativa de homogenato de cérebro (Hom.) E mielina purificada (P.M.) de cérebro de rato adulto (esquerda). Western blots para proteína básica de mielina (Mbp), Mog, sinaptofisina (Syp) e neurofilamento de peso molecular pesado (NF-H) (centro). PCRs de proteína básica de mielina (Mbp) e sinaptofisina (Syp) transcrições em homogenato cerebral e frações purificadas de mielina (direita). b, Quantificação densitométrica de mielina e homogenatos preparados a partir de n = 4 hemisférios de rato independentes para Coomassie (proteína total), proteínas de Western blot e PCRs mostrados em uma de frações de mielina purificadas normalizadas para seus respectivos homogenatos. Os dados são mediana ± s.e.m. das quatro réplicas biológicas. Resultados semelhantes foram obtidos com homogenato de cérebro e frações purificadas de mielina não utilizadas neste estudo. P os valores foram calculados a partir de duas caudas dos alunos t-teste com a correção de Welch. P & lt0,05 foi considerado significativo.


Este trabalho foi apoiado pelo Laboratório Chave de Shenzhen de Regulamentação Genética e Biologia de Sistemas, Instituto Shenzhen-Hong Kong de Ciência do Cérebro-Instituições de Pesquisa Fundamental de Shenzhen (Concessão nº 2021SHIBS0002), Programa de Ciência e Tecnologia de Shenzhen (Concessão nº KQTD20180411143432337 e JCYJ20190809154407564), e Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grant No. 31970601, 31701237 e 31900431). Os autores agradecem ao Center for Computational Science and Engineering da SUSTech pelo suporte em recursos computacionais e agradecem ao SUSTech Core Research Facilities pelo suporte técnico.

WC e LF desenvolveram o conceito do projeto. LF, ZS, QZ, HC, YL e JZ projetaram e realizaram experimentos. GL realizou análises bioinformáticas. WL e WW ajudaram na realização de experimentos. WC, LF, GL e YH revisaram e discutiram os resultados. WC, LF e GL escreveram o manuscrito.


A desativação do coronavírus suíno antes do isolamento do ácido nucleico com temperatura superior a 56 ° C danifica seriamente a integridade do genoma

2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) é o patógeno do Corona Virus Disease 2019. A detecção de ácido nucléico de 2019-nCoV é um dos principais indicadores para diagnóstico clínico. No entanto, a taxa positiva é de apenas 30-50%. Atualmente, a tecnologia RT-PCR quantitativa fluorescente é usada principalmente para detectar 2019-nCoV. De acordo com as “Diretrizes Técnicas de Laboratório para Detecção 2019-nCoV (Quarta Edição)”, emitido pela National Health and Commission of China e “The Experts 'Consensus on Nucleic Acid Detection of 2019-nCoV” lançado pela Sociedade Chinesa de Medicina Laboratorial, o humano as amostras devem ser colocadas abaixo de 56 ° C ou mais para inativar os vírus, a fim de manter os inspetores da infecção do vírus antes que os ácidos nucléicos fossem isolados como o modelo de qRT-PCR. Neste estudo, demonstramos que o tratamento de inativação do vírus perturba seriamente a integridade do seu genoma ao usar o vírus da diarreia epidêmica suína (vacina), uma espécie de coronavírus, como modelo. Nossos resultados mostraram que apenas 50,11% dos modelos virais detectáveis ​​permaneceram após a inativação de 56 ° C por 30 minutos e apenas 3,36% permaneceram após a inativação de 92 ° C por 5 minutos quando as amostras foram preservadas por solução de Hank, uma de uma soluções de sal isotônico atualmente sugeridas. No entanto, os modelos detectáveis ​​de ácidos nucleicos virais podem ser inalterados após as amostras terem sido incubadas a 56 ° C ou mais se as amostras foram preservadas com uma solução otimizada para proteger o RNA de ser interrompido. Portanto, recomendamos realizar uma investigação sistemática sobre o impacto da inativação de alta temperatura na integridade do genoma de 2019-nCoV e desenvolver uma solução de preservação de amostra para proteger os modelos detectáveis ​​de ácidos nucleicos de 2019-nCoV de danos por inativação de alta temperatura.


A formação de um único núcleo no final da mitose

O objetivo da remontagem NE é a construção de um único núcleo de tamanho e forma apropriados. Fatores que influenciam a forma e o tamanho do núcleo são discutidos acima, mas o que determina a formação de um único NE em torno de toda a massa da cromatina? Na verdade, alguns organismos passam por estágios de desenvolvimento que são caracterizados pela formação inicial de vários núcleos menores. Por exemplo, durante as primeiras divisões embrionárias de Xenopus, ouriços-do-mar e poliquetas, NEs separados se formam em torno dos cromossomos individuais, criando estruturas chamadas cariômeros (Montag et al., 1988). Cada cariômero é capaz de replicação de DNA e possui um NE completo com uma lâmina nuclear e NPCs funcionais (Lemaitre et al., 1998). Uma vez que o estágio de blástula é alcançado, os cariômeros se fundem em um único núcleo. Por que os cariômeros se formam permanece um mistério, talvez eles facilitem a entrada rápida na fase S durante os ciclos celulares extremamente curtos do desenvolvimento embrionário inicial (Lemaitre et al., 1998 Lenart e Ellenberg, 2003). Igualmente fascinante é a questão do que determina a compartimentação separada dos cromossomos no embrião inicial. Existe um mecanismo que mantém os cromossomos separados para evitar sua captura dentro de um único envelope? Fatores relevantes podem incluir proteínas que estão envolvidas na compactação cromossômica, o comprimento do fuso mitótico nessas células extremamente grandes e os copiosos lipídios e proteínas de membrana que são sintetizados durante a embriogênese inicial (Lemaitre et al., 1998). É tentador especular que as mudanças na estrutura da membrana ER (ou seja, a proporção de túbulos para folhas) durante o desenvolvimento também podem contribuir, como discutido abaixo.

Vários núcleos dentro de uma única célula também são observados em estados de doença e comumente ocorrem como micronúcleos em células cancerosas. Os micronúcleos resultam de quebra de cromossomo ou mitose imperfeita, quando um fragmento de cromossomo ou um cromossomo inteiro é separado da maior parte do DNA (Fig. 5) (Ford et al., 1988 Norppa e Falck, 2003). Após a remontagem NE, o DNA lagging é excluído do núcleo e torna-se encapsulado em seu próprio NE, completo com uma lâmina nuclear e NPCs (Walker et al., 1996). Os micronúcleos se acumulam espontaneamente nos linfócitos de uma maneira dependente da idade, mas também podem ser desencadeados por fatores ambientais, exposição a produtos químicos genotóxicos (Norppa e Falck, 2003) ou depleção de fatores necessários para a segregação cromossômica e união à placa metafásica (por exemplo, Goshima et al., 2003, Salina et al., 2003). Thus, the physical distance between chromosomes in telophase is clearly important for the encapsulation of all of the chromatin into a single NE.

Recent studies provide insight into how chromosomes might achieve the tight packing that ensures formation of a single nucleus. The highest degree of chromosome axial compaction occurs in late anaphase and requires dynamic microtubules and Aurora kinase. Interfering with this compaction by inhibiting either of these factors causes nuclear morphology defects, including the formation of multi-lobed nuclei (Mora-Bermudez et al., 2007). Interestingly, this defect in compaction did not result in the formation of multiple nuclei, suggesting that other factors are involved in either maintaining chromosome proximity or otherwise limiting the formation of multiple nuclei. More recently, the chromokinesin Kid was reported to be required for maximum compaction of anaphase chromosomes. When Kid was depleted from HeLa cells, chromosome compaction was altered, leading to the formation multi-lobed, wrinkled nuclei. The phenotype was even more severe in Kid –/– mouse zygotes, including the formation of multiple micronuclei (Ohsugi et al., 2008). Whereas Kid affects chromosome compaction in each cell division, it is required to prevent the formation of micronuclei only in oocyte meiosis and in the first few mitotic divisions. This is curious, and might suggest that extreme chromosome compaction is uniquely required to prevent the formation of multiple nuclei during the first few cell cycles. This further suggests that there are other, yet unidentified, factors involved in ensuring that only a single nucleus is formed at the end of mitosis.

The formation of micronuclei. (A) When all chromosomes (black) congress properly to the metaphase plate via the mitotic spindle (purple), a single NE (blue) is able to form around all of the DNA in telophase (top), resulting in a single nucleus in the ensuing interphase. However, when some DNA remains separate from the metaphase plate, such as lagging chromosomes that are not associated with the spindle, then that DNA fails to become encapsulated into the same NE and a micronucleus forms. (B) Micronucleus formed adjacent to the nucleus of a human buccal cell. DNA is shown in dark blue, and alpha-satellite DNA, which marks centromeres, the chromosomal sites of attachment to spindle microtubules, is shown in light blue. Note that the micronucleus does not contain alpha-satellite sequences, suggesting that the micronucleus was formed because of a failure in attaching to the spindle. Reprinted from Norppa and Falck (Norppa and Falck, 2003) with permission from Oxford University Press.

The formation of micronuclei. (A) When all chromosomes (black) congress properly to the metaphase plate via the mitotic spindle (purple), a single NE (blue) is able to form around all of the DNA in telophase (top), resulting in a single nucleus in the ensuing interphase. However, when some DNA remains separate from the metaphase plate, such as lagging chromosomes that are not associated with the spindle, then that DNA fails to become encapsulated into the same NE and a micronucleus forms. (B) Micronucleus formed adjacent to the nucleus of a human buccal cell. DNA is shown in dark blue, and alpha-satellite DNA, which marks centromeres, the chromosomal sites of attachment to spindle microtubules, is shown in light blue. Note that the micronucleus does not contain alpha-satellite sequences, suggesting that the micronucleus was formed because of a failure in attaching to the spindle. Reprinted from Norppa and Falck (Norppa and Falck, 2003) with permission from Oxford University Press.

The formation of multiple nuclei is also seen in C. elegans after depletion of the nucleoporin gp210, cyclin B, the GTPase Rab-5 or reticulon proteins (Audhya et al., 2007 Galy et al., 2008 Sonnichsen et al., 2005). Interestingly, a subset of these conditions also disrupts ER structure. Multiple nuclei are also formed after depletion of LPIN-1, the C. elegans homolog of lipin, an enzyme that is involved in fat metabolism and lipid synthesis (Golden et al., 2009). Similarly to the effect of Rab-5 or reticulon depletion, downregulation of LPIN-1 expression disrupts ER structure (Golden et al., 2009 Gorjanacz and Mattaj, 2009). Thus, although the distance between chromosomes clearly constitutes an important consideration in the formation of a single nucleus during telophase, the amount of membrane available, and its potential to adopt proper sheet and tubule structures, might also have an important role.

The limited flat membrane hypothesis

The above observations regarding NE assembly led us to propose the `limited flat membrane hypothesis' (Fig. 6). According to this hypothesis, the limiting factor for the surface area of the NE is the amount of ER membrane that can be converted into membrane sheets, and it is this requirement that contributes to the formation of a single nucleus at the end of open mitosis, or the formation of a round nucleus after closed mitosis. This hypothesis is based on the following suppositions: first, that there is a constant ratio between nuclear size and cell size second, that the membrane used for NE formation originates in the ER and third, that only a fraction of the ER membrane – that which is not captured in specialized structures such as tubules – is available for NE formation. There is good evidence in support of the first two suppositions, whereas the third is more speculative and is based on the observed effects of altered reticulon levels and altered lipid synthesis on NE formation (described above).

In the case of closed mitosis, altered lipid synthesis due to the inactivation of the lipin pathway results in extensive ER membrane sheets and the inability to form a spherical nucleus after nuclear division (Campbell et al., 2006 Siniossoglou et al., 1998 Tange et al., 2002). Because lipid synthesis is decreased as cells exit mitosis (Santos-Rosa et al., 2005), we propose that, in closed mitosis, limited lipid synthesis, and specifically limiting amounts of membrane in the form of sheets (i.e. `flat' membrane), drives the nuclear shape change from elongated to round. When the amount of flat membrane is not limiting, such as when lipin is inactive, this transition does not occur (Fig. 6). To see how this hypothesis applies to open mitosis, let us assume that, at the time of NE reassembly, a membrane can form around all of the chromosomes, leading to the formation of a single nucleus, or it can form around a subset of chromosomes, leading to the generation of multiple nuclei that together can expand to the same volume as a single nucleus. Importantly, in the latter case, the combined surface area of the multiple nuclei would be greater than the surface area of a single nucleus with the same volume. If the amount of flat membrane is limited and much of the ER is captured in the form of tubules, the NE assembly reaction will be pushed towards the formation of a single nucleus. If this were the case, it would explain the observation that multiple nuclei are formed under a variety of conditions in which more flat membrane is available. Additionally, it is tempting to speculate that in cancer cells the ratio of ER sheets to tubules is altered, or that the rules that link nuclear volume to cell size are relaxed, thereby facilitating the formation of multiple nuclei. Further research into the relationship between ER structure, lipid synthesis and NE dynamics will be useful for testing the validity of this hypothesis.

The limited flat membrane hypothesis. During closed mitosis (A), excess membrane in the form of sheets results in a failure to reform a spherical nucleus, suggesting that limited membrane availability drives nuclear shape change at the end of mitosis. During open mitosis (B), excess flat membrane might facilitate the formation of multiple nuclei that collectively have the same volume as a single nucleus that would form under conditions of limited flat membrane availability. The NE is shown in green and the DNA in red. See text for more details.

The limited flat membrane hypothesis. During closed mitosis (A), excess membrane in the form of sheets results in a failure to reform a spherical nucleus, suggesting that limited membrane availability drives nuclear shape change at the end of mitosis. During open mitosis (B), excess flat membrane might facilitate the formation of multiple nuclei that collectively have the same volume as a single nucleus that would form under conditions of limited flat membrane availability. The NE is shown in green and the DNA in red. See text for more details.


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