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Qual é o destino do DNA do micronúcleo?

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Micronúcleos são estruturas celulares formadas como um subproduto, geralmente, da mitose defeituosa. O pedaço de cromossomo em um micronúcleo pode ou não conter um centrômero e o DNA é envolvido por uma membrana lipídica dupla.

Tentei encontrar informações, mas não consegui descobrir qual é o destino dessas estruturas dentro da célula uma vez formada. E o DNA dentro dele é perdido para a célula?


Emergência de micronúcleos e seus efeitos sobre o destino de células sob estresse de replicação (2010) explora como os micronúcleos se comportam e determinam o destino celular. Ele descobriu que os micronúcleos estão intimamente relacionados à apoptose. Se as células com micronúcleos não passassem por apoptose, havia casos em que os micronúcleos literalmente simplesmente desapareciam. Eles não conseguiram determinar se ele foi expelido pela célula ou reabsorvido no núcleo principal. No entanto, também houve casos em que haveria um aumento no número de micronúcleos.

Eles concluíram que há várias maneiras de a célula se livrar dos micronúcleos e não conseguiram determinar qual é a mais provável.

Não consegui encontrar nenhum estudo aprofundado mais recente (que eu pudesse entender).


Portanto, de acordo com este artigo, existem várias respostas ...

  • Caso 1: é reabsorvido no núcleo e muito provavelmente as informações nele são salvas.
  • Caso 2: é expulso da célula e as informações dentro dele são perdidas.
  • Caso 3: A célula sofre apoptose e todas as informações são perdidas.

O destino das células micronucleadas após a irradiação X detectada por imagens de células vivas

Os micronúcleos estão intimamente relacionados ao dano ao DNA. A presença de micronúcleos em células de mamíferos é um fenômeno comum pós-radiação ionizante. O nível de micronucleação em células tumorais tem sido usado para prever o prognóstico após a radioterapia em muitos cânceres. A fim de compreender como os micronúcleos induzidos por irradiação afetam o destino das células, realizamos extensas imagens de células vivas de longo prazo em células de carcinoma nasofaríngeo irradiadas com radiação X (NPC). Para visualizar a dinâmica dos micronúcleos com mais clareza, os cromossomos foram marcados de forma estável com proteína fluorescente vermelha (RFP) por direcionamento para histona humana H2B. Inicialmente, significativamente mais micronúcleos foram observados em células radiossensíveis do que em células radiorresistentes após a irradiação. Além disso, descobriu-se que as células com micronúcleos tinham maior probabilidade de morrer ou sofrer parada do ciclo celular em comparação com células sem micronúcleos após a irradiação, e quanto mais micronúcleos as células contivessem, maior a probabilidade de morrerem ou sofrerem parada. Além disso, células micronucleadas mostraram predisposição para produzir células-filhas com micronúcleos por meio do atraso cromossômico. A hibridização in situ fluorescente usando sondas pan-centroméricas humanas revelou que cerca de 70% desses micronúcleos e cromossomos atrasados ​​não continham sinais centroméricos. Finalmente, o dano ao DNA foi mais severo e a atividade da quinase de estresse p38 foi maior em células micronucleadas do que em células livres de micronúcleo, como mostrado pela coloração de fosfo-H2AX e fosfo-p38 por imunofluorescência. Em conjunto, nossas observações indicaram que a presença de micronúcleos acoplados à resposta ao dano ao DNA ativado poderia comprometer a capacidade de proliferação das células irradiadas, fornecendo a evidência e a justificativa para o uso do índice micronúcleo como um biomarcador valioso de radiossensibilidade.


O destino das células micronucleadas após a irradiação X detectada por imagens de células vivas

Os micronúcleos estão intimamente relacionados ao dano ao DNA. A presença de micronúcleos em células de mamíferos é um fenômeno comum pós-radiação ionizante. O nível de micronucleação nas células tumorais tem sido usado para prever o prognóstico após a radioterapia em muitos cânceres. A fim de compreender como os micronúcleos induzidos por irradiação afetam o destino das células, realizamos extensas imagens de células vivas de longo prazo em células de carcinoma nasofaríngeo irradiadas com radiação X (NPC). Para visualizar a dinâmica dos micronúcleos com mais clareza, os cromossomos foram marcados de forma estável com proteína fluorescente vermelha (RFP) por direcionamento para histona humana H2B. Inicialmente, significativamente mais micronúcleos foram observados em células radiossensíveis do que em células radiorresistentes após a irradiação. Além disso, descobriu-se que as células com micronúcleos tinham maior probabilidade de morrer ou sofrer parada do ciclo celular em comparação com células sem micronúcleos após a irradiação, e quanto mais micronúcleos as células contivessem, maior a probabilidade de morrerem ou sofrerem parada. Além disso, células micronucleadas mostraram predisposição para produzir células-filhas com micronúcleos por meio do atraso cromossômico. Fluorescência no local a hibridização usando sondas pan-centroméricas humanas revelou que cerca de 70% desses micronúcleos e cromossomos atrasados ​​não continham sinais centroméricos. Finalmente, o dano ao DNA foi mais severo e a atividade da quinase de estresse p38 foi maior em células micronucleadas do que em células livres de micronúcleo, como mostrado pela coloração de fosfo-H2AX e fosfo-p38 por imunofluorescência. Em conjunto, nossas observações indicaram que a presença de micronúcleos acoplados à resposta ao dano ao DNA ativado poderia comprometer a capacidade de proliferação das células irradiadas, fornecendo a evidência e a justificativa para o uso do índice micronúcleo como um biomarcador valioso de radiossensibilidade.


O destino das células micronucleadas após a irradiação X detectada por imagens de células vivas

Os micronúcleos estão intimamente relacionados ao dano ao DNA. A presença de micronúcleos em células de mamíferos é um fenômeno comum pós-radiação ionizante. O nível de micronucleação nas células tumorais tem sido usado para prever o prognóstico após a radioterapia em muitos cânceres. A fim de compreender como os micronúcleos induzidos por irradiação afetam o destino das células, realizamos extensas imagens de células vivas de longo prazo em células de carcinoma nasofaríngeo irradiadas com radiação X (NPC). Para visualizar a dinâmica dos micronúcleos com mais clareza, os cromossomos foram marcados de forma estável com proteína fluorescente vermelha (RFP) por direcionamento para histona humana H2B. Inicialmente, significativamente mais micronúcleos foram observados em células radiossensíveis do que em células radiorresistentes após a irradiação. Além disso, descobriu-se que as células com micronúcleos tinham maior probabilidade de morrer ou sofrer parada do ciclo celular em comparação com células sem micronúcleos após a irradiação, e quanto mais micronúcleos as células contivessem, maior a probabilidade de morrerem ou sofrerem parada. Além disso, células micronucleadas mostraram predisposição para produzir células-filhas com micronúcleos por meio do atraso cromossômico. A hibridização in situ fluorescente usando sondas pan-centroméricas humanas revelou que cerca de 70% desses micronúcleos e cromossomos atrasados ​​não continham sinais centroméricos. Finalmente, o dano ao DNA foi mais severo e a atividade da quinase de estresse p38 foi maior em células micronucleadas do que em células livres de micronúcleo, como mostrado pela coloração de fosfo-H2AX e fosfo-p38 por imunofluorescência. Em conjunto, nossas observações indicaram que a presença de micronúcleos acoplados à resposta ao dano ao DNA ativado poderia comprometer a capacidade de proliferação das células irradiadas, fornecendo a evidência e a justificativa para o uso do índice micronúcleo como um biomarcador valioso de radiossensibilidade.


Organização genômica e destino de desenvolvimento de sequências repetidas adjacentes em um clone de DNA dobrável de Tetrahymena thermophila

A eliminação e o rearranjo da sequência de DNA ocorrem durante o desenvolvimento de linhagens de células somáticas de eucariotos e foram descobertos pela primeira vez há mais de um século. No entanto, o significado e o mecanismo de eliminação da cromatina não são compreendidos. A eliminação do DNA também ocorre durante o desenvolvimento do macronúcleo somático do micronúcleo germinativo em protozoários ciliados unicelulares, como Tetrahymena thermophila. Neste estudo, o DNA dobrável do micronúcleo foi usado como uma sonda para isolar dez clones. Todos os testados (4/4) continham sequências repetitivas no micronúcleo e rearranjadas no macronúcleo. A presença de sequências repetidas invertidas foi claramente demonstrada em uma delas por microscopia eletrônica. A análise da sequência de DNA mostrou que a porção esquerda deste clone contém três cópias repetidas diretamente de uma sequência de 340 pb, uma porção de 120 pb que aparece na orientação invertida a uma distância de 1,6 kb. Este clone, pTtFB1, foi submetido a uma análise detalhada de seu destino de desenvolvimento. As sub-regiões foram subclonadas e usadas como sondas contra Southern blots de DNA micronuclear e macronuclear. Descobrimos que todas as sub-regiões definiram famílias de sequências repetidas no genoma micronuclear. Foi definido um mínimo de quatro famílias diferentes, duas delas retidas no macronúcleo e duas totalmente eliminadas. A família de repetição invertida é mantida com poucos rearranjos. Duas das famílias, definidas por sub-regiões que não contêm partes da repetição invertida, uma no "loop" e uma na "região do flanco direito", são totalmente eliminadas durante o desenvolvimento macronuclear & # x02014 e contêm quadros de leitura abertos. Uma quarta família ocorre na região do "laço" e é amplamente reorganizada durante o desenvolvimento. As duas famílias de genes que são eliminadas são estáveis ​​no genoma micronuclear, mas não são agrupadas como evidenciado por experimentos nos quais DNAs de cepas nulisômicas são usados ​​para mapear membros da família para cromossomos micronucleares específicos. A família de repetições invertidas também é estável no genoma micronuclear e está dispersa entre vários cromossomos. O significado das repetições invertidas retidas para o processo de eliminação é discutido.


Qual é a diferença entre micronúcleo e macronúcleo?

Os ciliados têm dois núcleos como micronúcleo e macronúcleo. Micronúcleo é o núcleo menor e o núcleo reprodutivo. Em contraste, o macronúcleo é o maior e o núcleo não reprodutivo. Portanto, esta é a principal diferença entre micronúcleo e macronúcleo. O genoma do micronúcleo é diplóide, enquanto o genoma do macronúcleo é poliploidia. Além disso, o micronúcleo contém uma pequena quantidade de DNA, enquanto o macronúcleo contém uma grande quantidade de DNA. Portanto, esta também é uma diferença entre micronúcleo e macronúcleo.

O infográfico a seguir resume a diferença entre micronúcleo e macronúcleo.


4. Diferentes tipos de ensaios de micronúcleo

Embora todos os tipos de MN sejam baseados na análise da frequência dos micronúcleos, eles variam em termos de células e protocolos usados. O resumo é apresentado na Tabela 3, seguido por uma descrição mais detalhada.

Tabela 3

Tipos de ensaios de micronúcleo.

genotoxicidade in vitro ou in vivo

experimentos biológicos em que o dano citogenético é avaliado.

genotoxicidade in vivo de produtos químicos, drogas ou condições prejudiciais

impacto dos hábitos de estilo de vida de nutrição, como fumar e beber álcool

risco de envelhecimento acelerado, certos tipos de câncer e doenças neurodegenerativas.

prognóstico de certos tipos de câncer.

4.1. Ensaio de micronúcleo de bloco de citocinese (CBMN)

A versão mais popular do MN é o ensaio de micronúcleo de bloqueio de citocinese (CBMN) [6,30] (Figura 1). Como o Mn é visível apenas após a divisão celular, a citocalasina B que inibe a polimerização dos filamentos de actina e a formação de microfilamentos contráteis é usada para interromper a citocinese [42,43]. No entanto, a citocalasina B não interrompe a cariocinese, portanto, células binucleadas são formadas com Mn presente em seu citoplasma. A influência da citocalasina B na proliferação celular e na indução de Mn foi discutida no passado [6,44]. A conclusão obtida indica que, na maioria dos casos, o uso da citocalasina B não induz Mn adicional, portanto, o uso da citocalasina B é recomendado [5,6,30,45,46,47,48]. Isso é de especial importância quando são usados ​​linfócitos humanos, pois seu ciclo celular pode variar entre os indivíduos [4]. De acordo com o modelo matemático descrito por Fenech, o MN com citocalasina B aplicado para bloquear a citocinese é superior ao MN sem citocalasina B porque há menos resultados falso-negativos quando o MN usando o bloqueio da citocinese é usado [49].

Um princípio de ensaio de micronúcleo de bloqueio de citocinese. 1. Núcleo com DNA danificado. 2. Inibição de citocinese pela adição de citocalasina B. 3. A frequência de Mn é pontuada apenas em células binucleadas. A parte superior & # x02014 controla as células binucleadas sem Mn, a parte inferior & # x02014 duas células binucleadas com 1 ou 6 Mn visíveis no citoplasma.

O CBMN é predominantemente realizado em linfócitos de sangue periférico humano para estudar a formação in vivo de Mn para biomonitoramento ou dosimetria biológica, no entanto, pode ser realizado em diferentes linfócitos de outras espécies, por exemplo, roedores, peixes, cães, coelhos, macacos e macacos ou outros células de origem diferente [50,51,52]. O CBMN também é frequentemente usado em amostras de sangue in vitro para estudar os efeitos genotóxicos de produtos químicos. [6,53,54,55,56,57]. As informações sobre os testes de genotoxicidade in vitro por MN são coletadas, revisadas e sistematizadas na Diretriz 487 da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE) [4].

O CBMN fornece uma base abrangente para a investigação in vitro do potencial de danos cromossômicos de produtos químicos, dignos de nota, tanto aneugênicos (mudanças no número de cromossomos na célula causadas por, por exemplo, tabagismo, pesticidas) e mudanças clastogênicas (aberração estrutural causada por exemplo, por radiação ionizante amarelo de acridina, benzeno, óxido de etileno, arsene, fosfina) podem ser detectados. De acordo com a diretriz da OCDE, as células devem ser tratadas com compostos químicos de três maneiras diferentes: cultivadas com citocalasina B, cultivadas sem citocalasina B e cultivadas na presença de sistema de ativação metabólica exógena, geralmente preparado a partir de fígado de roedores (fração S9) . É impossível enumerar todas as aplicações do CBMN. As aplicações mais importantes do CBMN já foram descritas, mas várias outras são mencionadas na Tabela 4.

Tabela 4

pesquisa básica sobre dano e reparo de DNA [58,59]
estudos de radiossensibilidade de vários grupos, sejam eles saudáveis ​​ou com doenças genéticas [24,60,61,62]
tenta ligar a radiossensibilidade à reação à radiação de tecidos normais em pessoas submetidas à radioterapia [63,64]
testes preditivos de doença neoplásica [60,65,66]
caracterizações de dano citogenético durante quimioterapia e radioterapia [67,68]
biomonitoramento do meio ambiente ou exposição ocupacional [32,69,70,71].

CBMN desordens caracterização-exposição ocupacional, embora na versão básica do ensaio apenas Mn sejam pontuados, o ensaio pode ser estendido marcando outros biomarcadores, como pontes nucleoplasmáticas, botões nucleares, bolhas nucleares, células necróticas e / ou apoptóticas [32]. Este tipo de ensaio, denominado CBMN cytome assay, fornece informações adicionais sobre o dano ao DNA e seu reparo, citostase e citotoxicidade [72].

4.2. Ensaio de micronúcleo de eritrócitos & # x02013 o mais popular MN in vivo

O ensaio do micronúcleo eritrocitário (EMn) foi inicialmente realizado em eritrócitos imaturos da medula óssea de camundongos e ratos jovens [73]. A desvantagem do ensaio é que o exame da medula óssea acarreta o sacrifício da vida do roedor. Além disso, fatores de confusão potencialmente, como outras células nucleadas (células must, granulócitos ou diferentes tipos de linfócitos), estão presentes na medula óssea [74]. EMn também foi realizado em material celular retirado da medula óssea humana para determinar dano citogenético após rádio e quimioterapia [75,76,77,78].

Devido à alta invasividade do método, uma abordagem alternativa foi desenvolvida, baseada na avaliação da frequência de Mn em eritrócitos imaturos no sangue periférico [1,79]. Durante a maturação, as células precursoras dos eritrócitos perdem seus núcleos, porém, retêm o Mn formado durante a fase nucleada [2]. Os eritrócitos imaturos (também chamados de reticulócitos ou eritrócitos policromáticos) podem ser facilmente reconhecidos a partir dos eritrócitos maduros porque eles ainda contêm RNA em seu citoplasma [1]. Na medula óssea, os eritrócitos imaturos constituem cerca de 50% de todos os eritrócitos [80,81].

Células precursoras de eritrócitos humanos presentes na medula óssea longa de espécimes de controle contêm núcleos, provavelmente como resultado de exposição ambiental ou ocupacional ou fatores genéticos (Figura 2). Os eritrócitos imaturos originados das células precursoras também contêm Mn, no entanto, eles representam apenas uma pequena porcentagem de todos os eritrócitos no sangue periférico [81]. Embora a frequência de Mn em eritrócitos imaturos seja significativamente maior do que em eritrócitos maduros [1], a seleção esplênica, um processo que remove efetivamente eritrócitos micronucleados do sangue periférico, reduz significativamente a frequência de Mn. A seleção esplênica ocorre em ratos e humanos, também em camundongos, mas em menor grau [74,82]. Portanto, em humanos, o MN em eritrócitos imaturos é realizado apenas em indivíduos com o baço removido [13,83]. Para aumentar a confiabilidade do ensaio, o MN em eritrócitos imaturos no sangue periférico foi automatizado e realizado por citometria de fluxo. Com essa técnica, centenas de milhares de células podem ser analisadas em um tempo confiável, o que permitiu superar problemas com o baixo número de células disponíveis para análise e seleção esplênica Mn. A citometria de fluxo auxiliou na pontuação de Mn em eritrócitos foi validada em roedores e humanos [82,84,85].

Ensaio de micronúcleo de eritrócitos de mamíferos. (1). O eritrócito imaturo na medula óssea contém núcleo e RNA em seu citoplasma. Quando o dano ao DNA é induzido in vivo, o micronúcleo pode surgir no eritrócito nucleado. Quando o núcleo é excluído durante a maturação dos eritrócitos, o micronúcleo permanece no citoplasma. (2) Na medula óssea, os eritrócitos imaturos consistem em cerca de 50% de todos os eritrócitos. Ocasionalmente, esses eritrócitos imaturos podem conter Mn. (3). Às vezes, os eritrócitos imaturos são liberados para o sangue periférico, onde constituem menos de 5% de todos os eritrócitos. Os eritrócitos imaturos no sangue podem ser reconhecidos devido aos seus receptores de superfície específicos ou conteúdo de RNA. A técnica de citometria de fluxo torna o EMn viável em sangue periférico de roedores e humanos.

4.3. Buccal MN (BMm) & # x02013 Ensaio de textura, mas subutilizado

Embora o BMm seja usado há cerca de 40 anos, parece que só nos últimos anos ele ganhou mais interesse. As primeiras publicações descrevendo este teste apareceram na década de 1980 [86,87]. No entanto, a primeira publicação do protocolo operacional na Nature Protocols cai nos últimos 10 anos, após a harmonização do ensaio pelo grupo internacional HUMNxl [88,89]. Mn surgem nas células basais em divisão do epitélio oral, mas são observados em células diferenciadas na camada queratinizada na superfície bucal [90,91]. Além do Mn, vários outros biomarcadores citogenéticos, incluindo aqueles relacionados à morte celular, podem ser analisados, o que dá mais informações sobre a origem do dano ao DNA, citostase e citotoxicidade, de alguma forma análogo ao ensaio do citoma CBMN mencionado anteriormente [88,91] . Esta abordagem também foi chamada de ensaio do citoma do micronúcleo bucal (BMCyt) [88,91,92].

O Mn nas células bucais é formado no organismo, em rápida divisão do tecido epitelial bucal (Figura 3). Embora as células da cavidade oral sejam expostas a fatores genotóxicos ou citotóxicos por inalação e ingestão de alimentos em maior extensão do que os linfócitos do sangue periférico, a frequência de fundo de Mn nas células bucais é muito baixa [93,94]. Por outro lado, pacientes submetidos à radioterapia de cabeça e pescoço podem servir de controle positivo, embora algumas questões éticas devam ser consideradas, pois no caso deles a coleta do material é mais problemática devido às lesões e inflamação da mucosa oral [88,95 ] O BMm foi usado para investigar o impacto da nutrição, fatores de estilo de vida (como fumar, beber álcool ou mascar betel), exposição à genotoxina e citotoxina. Curiosamente, foi encontrada correlação entre a frequência de Mn nas células bucais e o risco aumentado de envelhecimento acelerado, certos tipos de câncer e doenças neurodegenerativas [92,96].

Ensaio de micronúcleo bucal. (1) Mn são induzidos in vivo por agentes genotóxicos em rápida divisão do tecido epitelial bucal. As células epiteliais se diferenciam e se movem em direção à camada externa da mucosa oral. (2) A frequência de Mn pode ser estimada em esfregaços de células bucais esfoliadas.

O BMn parece ser vantajoso sobre outros tipos de MN para estudar como os fatores genotóxicos afetam os organismos por inalação. É o único método capaz de mostrar efeitos genotóxicos de concentrações moderadas de radônio, como aqueles que são encontrados em salas não ventiladas, porões ou cavernas [14,97]. Além disso, a sensibilidade do BMn permitiu também mostrar os efeitos genotóxicos do trabalho na área da saúde, onde o pessoal foi exposto a doses muito baixas de radiação [98]. BMn está ganhando popularidade e provavelmente se tornará um teste citogenético padrão, especialmente por ser minimamente invasivo, fácil de realizar e as amostras de células são retiradas da cavidade oral.

4,4. Outros tipos de MN

Ocasionalmente, o MN também é realizado em células diferentes de linfócitos, fibroblastos e células bucais, como células da mucosa nasal ou células derivadas da urina [99,100,101]. Ambos os objetivos do teste e o método de desempenho permanecem semelhantes ao CBMN ou BMn, mas esses testes não ganharam muita popularidade, até agora.


Formação de micronúcleos, status proliferativo, morte celular e danos ao DNA em linfócitos humanos tratados com etossuximida

A etossuximida é um bloqueador dos canais de Ca 2+ do tipo T que tem sido usado como anticonvulsivante para tratar crises de ausência. Como ainda não foram relatados dados sobre os efeitos de citotoxicidade, genotoxicidade e morte celular dessa droga, investigamos linfócitos humanos tratados com etossuximida com CBMN de Fenech (citocalasina bloqueada por citocalasina citoma) ensaio e eletroforese em gel de célula única (ensaio cometa). Os testes nos permitiram examinar a formação do micronúcleo, o estado proliferativo das células viáveis, bolha nuclear, formação de ponte nucleoplasmática, morte celular (ensaio CBMN) e danos ao DNA (ensaio do cometa). Os linfócitos foram tratados por 24 horas com etossuximida 25, 50 ou 100 μg / ml. As células utilizadas para o ensaio CBMN foram examinadas imediatamente ou 24 horas após o bloqueio da citocalasina. Para o ensaio do cometa, as células foram examinadas imediatamente ou 22 h após 2 h de tratamento com etossuximida. Os resultados indicam que 25 e 50 μg / ml de etossuximida não induziu a formação de micronúcleos, anormalidades nucleares, morte celular ou dano ao DNA, nem afetou a proliferação celular, sugerindo nenhum efeito citotóxico ou genotóxico sob tais condições experimentais. No entanto, sob tratamento com 100 μg / ml de etossuximida, foi detectado um aumento na formação de micronúcleos e anormalidades nucleares, mas uma diminuição na proliferação celular e no dano ao DNA, e nenhuma alteração na taxa de morte celular. Embora aparentemente contraditórios, os dados obtidos com a concentração de 100 μg / ml podem indicar que a indução de citotoxicidade e genotoxicidade não deve ser desconsiderada ao se considerar esta concentração do fármaco. Os mecanismos subjacentes à resposta celular à etossuximida ainda precisam ser explorados.


MATERIAIS E MÉTODOS

Cultura de células, linhas celulares e reagentes

Para construir linhas celulares que expressam estavelmente H2B-Dendra2, células HEK293T foram transfectadas com a construção LV.CNV.puro.H2B-Dendra2 (um presente de Jacco van Rheenen, Molecular Pathology, The Netherlands Cancer Institute, The Netherlands) usando X-tremeGENE (Roche ) de acordo com o protocolo do fabricante. Após 2 dias, o meio contendo vírus foi adicionado às células RPE-1 p53kd (um presente de Johan Kuiken e Roderick Beijersbergen, Departamento de Medicina Celular e Molecular, The Netherlands Cancer Institute), e as células Dendra2-positivas foram classificadas em fluorescência verde em 2 semanas após a infecção. Células RPE-1 que expressam PCNA-mCherry e H2B-eGFP foram gentilmente cedidas por Arshad Desai (Ludwig Institute for Cancer Research, EUA). Para fazer células RPE-1 JNK-KTR, células HEK293T foram transfectadas com pLenti PGK Puro DEST JNKKTRClover (plasmídeo Addgene # 59151, depositado por Markus Covert Regot et al., 2014) usando X-tremeGENE (Roche) de acordo com o protocolo do fabricante. O vírus obtido foi adicionado ao RPE-1 e a seleção da droga foi realizada (puromicina 1 μg / μl) 24 horas após a infecção. Todas as células descritas acima foram cultivadas a 37 ° C a 5% de CO2 em meio avançado de Eagle modificado por Dulbecco com mistura de nutrientes F-12 (DMEM-F12) com Glutamax (GIBCO), suplementado com 10% de soro fetal de bezerro (Clontech), 100 U / ml de penicilina (Invitrogen), 100 μg / ml de estreptomicina (Invitrogen ) e UltraGlutamina 2 mM (Lonza). Para a sincronização do ciclo celular, as células foram tratadas com timidina 2,5 mM (Sigma) por 22 horas e liberadas por lavagem duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Os inibidores foram todos dissolvidos em DMSO e foram usados ​​nas seguintes concentrações: proTAME, 20 μM GSK923295, 50 nM NMS-P715, 480 nM de Anisomicina, 50 μM (1 h) e inibidor JNK VIII, 10 μM. Todas as linhas celulares descritas acima mostraram estar livres de contaminação por micoplasma.

Imagem de lapso de tempo

Para a imagem de células vivas, as células foram cultivadas em lamínula com câmara Lab-Tek II (Thermo Science). As imagens foram adquiridas a cada 5, 10 ou 15 minutos usando um microscópio DeltaVision Elite (Applied Precision) mantido a 37 ° C, 5% CO2 usando uma lente 20 × 0,75 NA (Olympus) e uma câmera Coolsnap HQ2 (Fotometria) com binning 2 vezes. A análise das imagens foi realizada com o software ImageJ. Para experimentos de rastreamento de micronúcleos, micronúcleos pré-convertidos foram identificados por fluorescência verde e fotoconvertidos usando um pulso breve (0,05 s) de um laser de 405 nm em um microscópio Deltavision Elite equipado com um módulo de laser X4 (Precisão Aplicada). A imagem subsequente de células vivas foi realizada conforme indicado acima. Um microscópio automatizado Lionheart FX foi usado para ensaios de importação nuclear (microscópio mantido a 37 ° C, 5% CO2 usando uma lente 20 × NA e um CCD Sony, câmera de 1,25 megapixels com binning 2 vezes BioTek).

Transfecção de siRNA

ON-TARGETplus SMARTpool siRNA direcionado a p53 (Thermo Scientific) foi transfectado usando RNAiMAX (Life Technologies) de acordo com o protocolo do fabricante a uma concentração final de 20 nM, 24 h antes do início do experimento.

Imunofluorescência

As células foram cultivadas em lamínulas de vidro de 10 mm e fixadas em formaldeído 3,7% com Triton X-100 0,5% em PBS por 15 min em temperatura ambiente. Os anticorpos primários foram incubados a 4 ° C durante a noite e os anticorpos secundários foram incubados por 2 h à temperatura ambiente, ambos dissolvidos em PBS 0,1% Tween. Os seguintes anticorpos foram usados: Mad1 (1: 500, sc-65494, Santa Cruz Biotechnology), Crest (1: 5000, CS1058, Cortex Biochem), CENP-A (1: 300, ab13939, Abcam), CENP-C ( 1: 600, PD030, MBL), CENP-T (1: 1000, D286-3, MBL), H4K20me1 (1: 2000, Hori et al., 2014). Os anticorpos secundários conjugados com Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 e Alexa Fluor 647 (Molecular Probes) foram usados ​​para imunofluorescência. O DAPI foi adicionado a todas as amostras antes da montagem usando fluido de montagem Vectashield (Vector Laboratories). Os níveis de replicação foram determinados para células cultivadas em meio contendo EdU para o tempo indicado. Após a fixação, a incorporação de EdU foi visualizada por coloração com tampão (Tris-HCl 100 mM pH 8,5, com CuSO 1 mM4) e Alexa Fluor 488 – azida (Life Technologies) de acordo com o protocolo do fabricante. As imagens foram adquiridas em um microscópio DeltaVision Elite (Applied Precision), tomando 200 nm z-pilhas com uma objetiva PlanApo N 60 × NA 1.42 (Olympus) e uma câmera Coolsnap HQ2 (Fotometria). As imagens foram analisadas após a deconvolução usando SoftWoRx (Applied Precision). Os números são projeções de intensidade máxima de células inteiras. O brilho e o contraste foram ajustados com Photoshop 6.0 (Adobe). Para colorações de cinetocoro, uma vez que todas as proteínas testadas pareciam ter níveis mais baixos em micronúcleos, incluindo proteínas centroméricas, todas as medições foram normalizadas para a média de 10 centromeros (CREST) ​​no núcleo primário (Fig. 4A, C).


Cromossomos presos em micronúcleos estão sujeitos a erros de segregação

É provável que o DNA nos micronúcleos seja danificado. Quando o DNA fragmentado dos micronúcleos é reincorporado ao núcleo primário, podem ocorrer rearranjos aberrantes, um fenômeno conhecido como cromotripsia. Aqui, investigamos como as cromátides de micronúcleos agem em divisões subsequentes e como isso afeta seu destino. Observamos que a maioria das cromátides derivadas de micronúcleos falham em estabelecer um cinetocoro adequado na mitose, o que está associado a problemas no alinhamento cromossômico, segregação e ativação do ponto de verificação da montagem do fuso. Notavelmente, descobrimos que, após sua formação, os micronúcleos já exibem níveis diminuídos de fatores de montagem de cinetocore importantes. É importante ressaltar que esses defeitos favorecem a exclusão do micronúcleo em vez da reintegração no núcleo primário em várias divisões. Curiosamente, os defeitos observados nos micronúcleos são provavelmente superados uma vez que os micronúcleos são reincorporados aos núcleos primários, à medida que se propagam normalmente. Concluímos que a formação de uma pequena entidade nuclear separada representa um mecanismo para a célula atrasar a propagação estável do excesso de cromossomo (s) e / ou DNA danificado, induzindo defeitos no cinetocoro.

Palavras-chave: Micronúcleo de segregação de cromossomos aneuploidia.

© 2018. Publicado por The Company of Biologists Ltd.

Declaração de conflito de interesse

Concorrência de interesses Os autores declaram não haver concorrência ou interesses financeiros.


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