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1.14: Separação das Fosfatidilcolinas Usando HPLC de Fase Reversa - Biologia

1.14: Separação das Fosfatidilcolinas Usando HPLC de Fase Reversa - Biologia


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14.1 Objetivo de Aprendizagem

Este laboratório tem 2 objetivos, (1) aprender mais sobre as estruturas lipídicas da membrana trabalhando com fosfatidilcolinas e (2) aprender os fundamentos de uma técnica especialmente importante de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), HPLC de fase reversa. Você deve usar seu conhecimento das estruturas da fosfatidilcolina para racionalizar o padrão de eluição do HPLC.

14.2 Fosfatidilcolinas

A fosfatidilcolina é uma classe importante de lipídios (bioquímicos hidrofóbicos). Esta classe é um dos principais constituintes da membrana biológica. As fosfatidilcolinas têm uma estrutura comum. Para construir uma fosfatidilcolina, comece com glicerol. Outros componentes são conectados ao glicerol por meio de ligações de éster. Dois ácidos graxos (ácidos carboxílicos de cadeia longa) são esterificados nas duas posições superiores do glicerol. A terceira posição contém um fosfato e uma colina. Cada fosfatidilcolina difere de outras de sua classe com base nas características moleculares das cadeias de ácidos graxos (Fig. 14.1).

14.3 Cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)

A separação de fosfatidilcolinas é difícil, mas pode ser feita usando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Essa técnica de separação depende da passagem de uma solução (a fase móvel) por uma coluna cheia de partículas muito pequenas (a fase estacionária). Alguns solutos são fortemente atraídos por essas partículas e viajam lentamente pela coluna. Esses solutos grudam em uma partícula por um certo período de tempo e então “pulam” para a próxima partícula. Em comparação com o movimento da fase móvel, esses solutos são retardados. Outros solutos são atraídos apenas pelas partículas fracamente e, portanto, podem viajar pela coluna rapidamente.

O movimento diferencial dos solutos leva à separação do soluto. Isso geralmente é mostrado como um cromatograma (Fig. 14.2).

Você estará usando HPLC de fase reversa. As partículas nesta técnica são feitas de sílica (areia) que foi revestida com cadeias de alcano. Os solutos que são mais hidrofóbicos são atraídos mais fortemente para a fase estacionária e se movem mais lentamente através da coluna. Você estará separando cinco compostos de fosfatidilcolina com estruturas muito semelhantes (Fig. 14.3).

As fosfatidilcolinas com as cadeias de ácidos graxos mais longas são mais fortemente atraídas para a fase estacionária. O comprimento das cadeias de ácidos graxos depende de:

- o número de carbonos,

- a presença de ligações duplas cis. Cada ligação dupla cis faz com que a cadeia aja como se fosse um a dois carbonos mais curta (menos hidrofóbica).

Qual das cinco fosfatidilcolinas você acha que será mais atraída pela fase estacionária? O que você acha que será menos atraído? Com base na estrutura do PC, preveja a ordem de eluição da coluna.

14,4 Quantificação de cromatografia

O sucesso de uma separação pode ser medido de várias maneiras diferentes. Em primeiro lugar, a separação mais rápida tende a ser melhor, porque o experimentador não precisa esperar muito tempo pelos resultados. Para cada soluto, um tempo de retenção é medido. Este é o tempo decorrido desde o início até quando o pico de soluto deixa a coluna. Normalmente, este tempo é relatado em relação ao tempo de eluição mais rápido (o tempo que o solvente leva para passar pela coluna, o tempo de vazio). Assim, a rapidez de separação é medida pela retenção relativa ou fator de capacidade (k´).

Usando o cromatograma da Fig. 14.2, o Pico A tem um tempo de retenção de 9,3 min. O tempo de vazio para este cromatograma é de 2,0 min.

O pico A é retido na coluna 3,6 vezes mais do que a fase móvel.

Outra medida de sucesso é monitorar a forma de cada pico. Picos agudos significam uma melhor separação. Isso é medido determinando a largura do pico em relação a quanto tempo o pico é retido na coluna.

O pico A da Fig. 14.2 tem um tempo de retenção de 9,3 min com uma largura de pico de 0,8 min.

[ mathrm {N} = 16 left ( frac {9.3 mathrm {~ min}} {0.8 mathrm {~ min}} right) ^ {2} = 2162 ]

Uma separação bem feita proporcionará eficiências na casa dos milhares.

Uma terceira medida de sucesso é quantificar quanta separação ocorre entre os picos vizinhos. Esta seletividade é calculada como a razão dos fatores de capacidade

O pico A tem k´ = 3,6, enquanto o pico B tem k´ = 4,3. Isso significa que esta separação entre o Pico A e o Pico B tem uma seletividade de 1,2. O pico B é retido 20% mais do que o pico A. Uma boa separação dará valores de seletividade maiores que 1,1.

PROCEDIMENTOS

As necessidades de reagentes e equipamentos são calculadas por seis equipes de alunos. Há uma franquia de ~ 20% incluída.

Equipamento / vidraria necessários:

  1. Sistema HPLC padrão 1 por 2 equipes de alunos
  2. Coluna de HPLC de fase reversa C-18

Reagentes necessários:

  1. 98% de metanol
  2. 100 μl de mistura de fosfatidilcolinas dissolvidas em metanol. As concentrações de estoque para cada fosfatidilcolina na mistura estão listadas abaixo
    1. DMPC 10 mg / ml
    2. DPoPC 5 mg / ml
    3. DLPC 1 mg / ml
    4. POPC 5 mg / ml
    5. DOPC 5 mg / ml

Procedimento experimental:

  1. Uma coluna padrão analítica de HPLC de fase reversa (C-18) é equilibrada com 98% de metanol - 2% de água. Uma taxa de fluxo de 1 ml / min é conveniente.
  2. Cada separação usa 10 μl de uma amostra mista de fosfatidilcolina.
  3. A amostra contém 10 mg / ml de DMPC, 5 mg / ml de DPoPC, 1 mg / ml de DLPC, 5 mg / ml de POPC, 5 mg / ml de DOPC em metanol.
  4. Cada separação requer cerca de quarenta minutos.
  5. Siga as instruções do seu instrutor com relação à operação do cromatógrafo de HPLC.

Análise de dados:

  1. Calcule o fator de capacidade (retenção relativa) para cada fosfatidilcolina.
  2. Determine a eficiência da coluna (N) calculada usando o pico DLPC.
  3. Calcule a seletividade (α) entre (a) DMPC vs. DPoPC, (b) DPoPC vs. DLPC, (c) DLPC vs. POPC e (d) POPC vs. DOPC.

Notas para o instrutor

Este laboratório está programado para maximizar o uso de um número limitado de cromatógrafos. Na instituição dos autores, usamos três máquinas HPLC simultaneamente. Duas equipes de alunos (cada equipe composta de um par de alunos) são atribuídas a cada cromatógrafo. Enquanto uma equipe executa a cromatografia, a outra equipe está concluindo um conjunto de problemas de HPLC em laboratório. Assim, ao final do período, todas as equipes concluíram um teste cromatográfico e praticaram os cálculos comuns necessários para analisar um cromatograma.

Pré-laboratório de HPLC de lipídios

1. Desenhe a estrutura de cada fosfatidil colina que você vai separar durante o laboratório (são cinco)!

2. Circule a parte hidrofóbica de cada molécula!

3. Classifique essas moléculas com base na hidrofobicidade de pelo menos (5) a mais hidrofóbico (1)!

4. Qual dos cinco PCs você acha que será mais atraído pela fase estacionária? O que você acha que será menos atraído?

5. Com base na estrutura do PC, preveja a ordem de eluição da coluna.

HPLC de FosfatidilcolinasEsboço do relatório de laboratório e distribuição de pontos

Introdução

1. Várias frases definindo o objetivo / propósito deste experimento. (3 pontos)

Dados

  1. Uma cópia do seu cromatograma com cada pico marcado com uma fosfatidilcolina específica. (10 pontos)

Resultados (mostre todos os cálculos)

  1. O fator de capacidade (retenção relativa) para cada fosfatidilcolina. (10 pontos)
  2. A eficiência da coluna (N) calculada usando o pico DLPC. (4 pontos)
  3. A seletividade (α) entre (a) DMPC vs. POPC, e (d) POPC vs. DOPC. (8 pontos)

Análise

  1. Quais fosfatidilcolinas são separáveis ​​de forma limpa nesta coluna. Explique brevemente. (5 pontos)
  2. Problemas (10 pontos)

Conjunto de problemas de HPLC

(Cortesia da Dikma Technologies. Chromatorex é uma marca registrada da Fuji Silysia Chemical Ltd. Dikma Technologies Inc. não é afiliada à empresa acima.

1. (5 pontos.) O cromatograma do Chromatorex-SMB não parece tão bom quanto o cromatograma do Inspire. Calcule as eficiências da coluna (N) com base no pico 3. (Use uma régua e a conversão, 1 minuto / 6 mm.) Isso concorda com a conclusão da primeira frase? Explique brevemente.

(Cortesia da SIELC Technologies)

2. (5 pontos.) Apenas olhando para os cromatogramas, classifique-os da melhor para a pior separação. Usando os dois cromatogramas mensuráveis, determine os tempos de retenção para cada pico. (Estime os tempos com aproximação de 0,1 minuto.) Calcule os fatores de capacidade para cada pico usando 1,1 min como o tempo vazio. Em seguida, calcule os fatores de seletividade (α) para Pico 1 vs. Pico 2 e para Pico 2 vs. Pico 3. Os fatores de seletividade concordam com sua classificação? Explique brevemente.


1.14: Separação das Fosfatidilcolinas Usando HPLC de Fase Reversa - Biologia

Métodos de cromatografia líquida de alto desempenho foram estabelecidos para separação de alquenilacil, alquilacil e diacilacetilgliceróis derivados de glicerofosfolipídios de etanolamina (EGP) e para separação das espécies moleculares individuais de cada uma das classes separadas. Os EGP foram isolados de cérebro bovino, hidrolisados ​​com fosfolipase C e acetilados com anidrido acético. As três classes de diradilacetilgliceróis foram separadas quantitativamente em uma coluna de sílica mu Porasil. As classes individuais foram ainda fracionadas em uma coluna de fase reversa Zorbax ODS. Por quantificação cromatográfica gás - líquido de cada pico, 29-33 espécies moleculares diferentes foram identificadas dentro de cada classe. Para alquenilacil-GPE, as espécies principais foram 18: 1-18: 1, 21,8% e 16: 0-18: 1, 14,8%. Os ácidos graxos polienóicos predominaram na posição 2 do diacil-GPE. As principais espécies foram 18: 0-22: 6 (n-3), 25,5% e 18: 0-20: 4 (n-6), 15,8%. Três espécies de alquilacil-GPE, 18: 0-20: 6 (n-3), 16: 0-22: 4 (n-6) e 18: 0-22: 4 (n-6), cada uma foi considerada 10%.


Resumo

A aplicação de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) usando um C30 a matriz estacionária de fase reversa permitiu a separação simultânea de carotenos, xantofilas, ubiquinonas, tocoferóis e plastoquinonas em um único cromatograma. A detecção de arranjo contínuo de fotodiodo (PDA) garantiu a identificação e quantificação dos compostos após a eluição. Aplicações do método à caracterização de variedades transgênicas e mutantes de tomate com teor alterado de isoprenóides, triagem bioquímica de Arabidopsis thaliana, e a elucidação dos modos de ação dos herbicidas branqueadores são descritos para ilustrar a versatilidade do procedimento.


Determinação de RP-hPLC / ESI MS das posições da cadeia de acil em fosfolipídios

Departamento de Espectrometria de Massa Biomolecular, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences (UIPS) e Bijvoet Center for Biomolecular Research, Utrecht University, PO Box 80 082, 3508 TB Utrecht, Holanda

OctoPlus B.V., Zernikedreef 12, 2333 CL Leiden, Holanda

Laboratório de Bioquímica Veterinária e Instituto de Biomembranas, Universidade de Utrecht, PO Box 80 176, 3508 TD Utrecht, Holanda

Departamento de Espectrometria de Massa Biomolecular, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences (UIPS) e Bijvoet Center for Biomolecular Research, Utrecht University, PO Box 80 082, 3508 TB Utrecht, Holanda

OctoPlus B.V., Zernikedreef 12, 2333 CL Leiden, Holanda

Resumo

Uma vez que os fosfolipídios são usados ​​como excipientes em muitos produtos farmacêuticos, há uma necessidade de estratégias validadas para caracterizar os constituintes dos fosfolipídios. Descrevemos um método de HPLC / espectrometria de massa com ionização por eletrospray de fase reversa que é uma alternativa ao laborioso tratamento com fosfolipase A2 comumente usado para determinar as posições da cadeia de acila em fosfolipídios. Este sistema de HPLC / espectrometria de massa por electrospray (a) mostra boa resolução cromatográfica para espécies moleculares de fosfatidilcolina, (b) permite a determinação da composição de misturas complexas de fosfatidilcolinas e, o mais importante, (c) permite atribuição inequívoca das posições de as cadeias de acila na estrutura do glicerol em misturas de POPC e OPPC e em misturas de POPE e OPPE.


HPLC de fase reversa combinada, espectrometria de massa e espectroscopia de NMR para uma separação rápida e identificação eficiente de fosfatidilcolinas

No que diz respeito ao envolvimento múltiplo de lipídios em processos bioquímicos, a análise de lipídios intactos e subivatizados de fluidos corporais, bem como de extratos de células e tecidos, ainda é uma tarefa desafiadora, se informações moleculares detalhadas forem necessárias. Portanto, a vantagem do uso combinado de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), espectrometria de massa (MS) e espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) será mostrada analisando três diferentes tipos de extratos do componente de membrana ubíqua fosfatidilcolina. No início, diferentes modificações de fase reversa foram testadas em fosfatidilcolinas (PC) com o mesmo número de carbono efetivo (ECN) para sua aplicabilidade na análise de lipídios. Os resultados foram obtidos para melhorar a separação de três tipos de extrato natural de PC e um novo método de fase reversa (RP) -HPLC foi desenvolvido. As espécies individuais foram caracterizadas por RMN uni e bidimensional e tempo de vôo quadrupolo do modo íon positivo ou negativo (q-TOF) -MS, bem como técnicas de MS / MS. Além disso, são abordados os efeitos de supressão de íons durante a ionização por eletrospray (ESI), dificuldades, limites e vantagens das técnicas analíticas individuais.

1. Introdução

A análise de lipídios nativos e não derivados em fluidos corporais, bem como em extratos de células e tecidos, ainda é uma tarefa desafiadora, em particular, se a estrutura molecular de componentes individuais precisa ser identificada em um tempo decentemente curto. A composição lipídica consiste em diferentes classes principais, como ácidos graxos, lipídios neutros e lipídios com grupos de cabeça carregados positiva ou negativamente com várias subclasses de diversidade estrutural. Variações na composição lipídica foram atribuídas a diferentes patologias, como doenças neoplásicas e neurodegenerativas, diabetes mellitus e muitas outras. Além disso, algumas classes de lipídios estão envolvidas na morte celular (apoptose, necrose), sinalização celular e são precursores de lisofosfolipídios (ou seja, lisofosfatidilcolina), diacilgliceróis e ácido fosfático e araquidônico [1-25].

1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (PC) representa um constituinte principal das membranas celulares. Consiste no grupo de cabeça polar fosforilcolina ligada à posição sn-3 do glicerol e diferentes ácidos graxos saturados e insaturados esterificados nas posições sn-1 e sn-2, em que os ácidos graxos na posição sn-1 são preferencialmente saturados como regra . Numerosos estudos lidaram com PCs no passado por causa de sua extrema importância bioquímica e clínica e muitas técnicas analíticas diferentes foram propostas para obter uma visão sobre a renovação metabólica ou para caracterizar desvios fisiopatológicos da composição lipídica nativa. A maioria dessas técnicas apresenta várias desvantagens, como demoradas, insensíveis, destrutivas ou não relacionadas a subestruturas individuais. Cromatografia gasosa (GC) [26-28], cromatografia de camada fina (TLC) [29-31] e cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) [32-37] são comumente usadas para análise de lipídios. As técnicas baseadas em GC são quantitativas, mas requerem técnicas demoradas de preparação de amostras. GC é frequentemente usado em combinação com TLC para a separação da classe de lipídios. Os pontos em uma placa de TLC são riscados e seus resíduos de ácidos graxos são analisados ​​após a derivatização em um substrato volátil e registrados por GC. No entanto, a estrutura molecular precisa de um lipídio individual é perdida por causa da hidrólise anterior dos lipídios. A clivagem enzimática da ligação éster usando fosfolipases permite uma hidrólise sucessiva dos ácidos graxos sn-2 e sn-1, mas é bastante demorada devido ao intenso trabalho de laboratório e já uma pequena contaminação da enzima leva a resultados falsos. HPLC oferece a separação de classes de lipídios usando o modo de fase normal (NP) e, adicionalmente, a separação de acordo com os diferentes resíduos de ácidos graxos de um lipídio individual no modo de fase reversa (RP). Nesse caso, uma separação bem-sucedida depende distintamente da seleção apropriada da fase estacionária. Alternativamente, as técnicas baseadas em MS são amplamente utilizadas, pois são rápidas, sensíveis e requerem apenas uma pequena preparação de amostra [38]. O uso de sistemas MS de alta resolução dá acesso à fórmula molecular. Além disso, as fragmentações características identificam a classe de lipídios e a estrutura molecular. Quando acoplado a um sistema HPLC, sua seletividade é muito maior e se beneficia de ambas as técnicas. A espectroscopia de NMR é capaz de medir biomateriais intactos de forma não destrutiva, sem qualquer derivatização anterior. Especialmente 31 P-NMR é bem adequado para quantificar a análise da classe de fosfolipídios e precisa apenas de menos preparação de amostra [39-44]. Novamente, apenas informações secundárias são obtidas com relação aos resíduos de ácidos graxos. As medições de 1 H-NMR também são amplamente utilizadas, pois contêm mais informações sobre os ácidos graxos em geral, mas a conexão com a estrutura do glicerol está ausente devido à sobreposição maciça do sinal. 2D-NMR envolvendo o núcleo 13 C fornece muito mais resolução e mais informações sobre espécies individuais, mas a baixa sensibilidade NMR do isótopo 13 C impede uma aplicação rápida e ampla desta técnica em uma análise de rotina [44-48].

Este artigo apresenta uma configuração de RP-HPLC eficiente para separar fosfatidilcolinas, que, em última análise, será extensível para separar outros fosfolipídios polares. Posteriormente, a ferramenta de HPLC é combinada com os potenciais de atribuição molecular altamente informativos de MS e NMR [49]. Cinco tipos diferentes de modificações de fase reversa à base de sílica foram testados com relação à sua capacidade de separar lipídios contendo ácidos graxos com um número de carbono equivalente (ECN), que é o número de átomos de carbono dentro de uma cadeia de ácido graxo menos o dobro do número de títulos. A extensão de um lipídio por uma ligação dupla C = C não mudará a hidrofobicidade. O desempenho de todas as colunas foi testado em uma mistura de cinco PCs com o mesmo ECN enquanto dois deles são até mesmo isômeros constitucionais em relação às posições 1,2 do glicerol, o que dificulta ainda mais a separação.

Em seguida, a coluna de HPLC com melhor desempenho foi usada para obter uma separação de linha de base eficiente de três extratos de PC nativos (soja, cérebro de bovino e gema de ovo). Além disso, o comportamento de fragmentação de MS no modo de íon positivo e negativo é investigado para PCs individuais para identificar padrões de fragmentação característicos para esta classe de lipídios e seus resíduos de ácidos graxos. Os espectros de RMN de alta resolução 1D e 2D também foram adquiridos para confirmar a estrutura molecular.

2. Material e métodos

2.1. Produtos químicos

Metanol-d4 e clorofórmio deuterado, metanol (grau LC-MS), todos os ácidos graxos, os compostos de mistura de teste dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC), palmitoil-oleoil-fosfatidilcolina (POPC), oleoil-palmitoil-fosfatidilcolina (OPPC), dioleoil- fosfatidilcolina (DOPC), estearoil-linoleoil-fosfatidilcolina (SLPC), e também a soja, cérebro de bovino e extratos de gema de ovo foram adquiridos de Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Alemanha). A água duplamente destilada foi retirada do sistema interno.

2.2. Cromatografia líquida de alta performance

Foi usado um sistema HPLC série HP 1100 (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemanha). O volume de injeção foi de 3

L do padrão preparado em metanol. Cinco colunas com diferentes fases estacionárias foram testadas em relação ao seu desempenho de separação para a análise de lipídios: (1) C endcapped à base de sílica tipo A18 (Nucleosil 100-5 C18, 250

3 mm), (2) fenil à base de sílica tipo A (Nucleosil 100-5 C6H5, 250 4 mm), (3) tipo B à base de sílica C de alta densidade18 (Nucleodur C18 Gravity, 5 m, 250 3 mm), (4) polímero à base de sílica tipo B / reticulado C18 (Nucleodur C18 Isis, 5 m, 250 3 mm), (5) fenil de modo misto à base de sílica tipo B / C18 (Nucleodur Sphinx RP, 5 m, 250 3 mm).

& # 13 Todas as colunas e materiais de HPLC foram um presente gentil da Macherey-Nagel (Düren, Alemanha).

As colunas de 3 mm foram operadas a uma taxa de fluxo de 0,6 mL / min e a coluna de 4 mm a 1 mL / min. A fase móvel foi otimizada pela adaptação do teor de metanol em diferentes corridas entre 90% e 100% para as fases alquílicas e entre 80% e 100% para a fase fenil no que diz respeito à interação hidrofóbica dos analitos com o empacotamento RP.

Um Nucleodur Sphinx RP de 8 mm foi operado sob condições isocráticas a um fluxo de 4,1 mL / min com uma fase móvel consistindo de metanol e água (90: 10) para a abordagem semipreparativa. Para coletar as espécies individuais para medições de NMR, um manipulador de líquidos Gilson 215 (Gilson International B.V., Bad Camberg, Alemanha) foi usado. A temperatura da coluna foi mantida em 4

2.3. Espectrometria de massa

Um sistema esquire LC iontrap (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany) foi usado para detecção de espectrometria de massa para massa de modo de íon positivo e negativo e espectros de MS / MS de cada composto de PC foram registrados. A tensão capilar foi definida para

3800 V e o deslocamento da placa final para 500 V no modo de íons positivos. Para o HPLC, o gás do nebulizador foi ajustado para 40 psi, o gás seco e o calor seco foram ajustados para 10 L / min e 30 C, respectivamente. No caso de infusão direta via bomba de seringa, os gases secos e nebulizadores foram reduzidos para 5 L / min e 5 psi, respectivamente. A energia de colisão para experimentos de MS / MS foi otimizada em relação à estabilidade do íon precursor.

Um micrOTOF-Q equipado com a fonte de íons Apollo ESI (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemanha) foi usado para detecção de massa de precisão. A tensão capilar foi ajustada para 4500 V e o deslocamento da placa final para 500 V no modo de íon negativo. O gás do nebulizador foi ajustado para 0,4 bar, gás seco e calor seco foram ajustados para 4 L / min e 20 C, respectivamente. Para experimentos de MS / MS, a energia de colisão do quadrupolo foi de 42 eV / z. A fórmula molecular foi gerada combinando alta precisão de massa e padrão isotópico (SigmaFit, Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemanha).

2.4. Ressonância magnética nuclear

Todas as amostras foram armazenadas a 8 ° C antes das medições. No caso de amostras dissolvidas, os solventes foram evaporados por uma corrente suave de nitrogênio e redissolvidos em CDCl3/ CD3OD (2: 1). Espectros de RMN 1D (1 H, 13 C) e 2D de alta resolução (HSQC, HSQC-TOCSY, HMBC) com uma resolução digital de 1k pontos de dados em F1 e 4k pontos de dados na dimensão F2 de cada espécie de PC foram adquiridos em um Bruker Espectrômetro DRX 600 MHz NMR equipado com 5 mm de sonda TXI (Bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten / Karlsruhe, Alemanha).

3. Resultados

3.1. Cromatografia líquida de alta performance

Uma comparação de cinco colunas de fase reversa diferentes revelou o seguinte comportamento: A separação da mistura de teste em materiais à base de sílica do tipo A mostrou apenas resultados fracos para todos os compostos de PC. Embora, pareça que o material Nucleosil separe todos os picos muito bem (ver Tabela 1), o alargamento extremo do pico e uma cauda distinta estragam a separação pretendida do pico. Em contraste, os materiais à base de sílica do tipo B separaram muito bem DPPC, DOPC, SLPC e POPC ou OPPC. No entanto, os dois isômeros lipídicos POPC e OPPC estavam apenas bem separados (Tabela 1) no empacotamento RP de reticulação de polímero (ISIS). Com todos os materiais de RP, foi possível separar lipídios contendo dois ácidos graxos monoinsaturados de lipídios com um ou dois ácidos graxos saturados ou um poliinsaturado. Os menores tempos de separação com picos cromatográficos agudos foram alcançados pela fase estacionária de modo misto (Sphinx). Portanto, esta fase estacionária foi selecionada para separar os compostos individuais dentro dos extratos lipídicos de fontes naturais.


Resumo

As esfingomielinas foram caracterizadas usando uma combinação de um novo método de HPLC de fase reversa isocrática com detecção de espectrometria de massa de tempo de voo por eletropulverização e MS / MS online opcional. A constituição das esfingomielinas é determinada por experimentos MS / MS. A separação de linha de base de 17 compostos de um extrato de cérebro bovino (2 compostos principais e 15 compostos menores ou traços) foi alcançada com uma fase móvel consistindo de metanol, 2-propanol, THF e água em uma coluna RP-18-fenil. Em paralelo, a fração de HPLC foi amostrada em um espectrômetro de NMR de 600 MHz para adquirir espectros de NMR 1D e 2D e para elucidar a estrutura molecular de componentes individuais de esfingomielina.

Para quem a correspondência deve ser endereçada. Telefone: 0049-421-218-2818. Fax: 0049-421-218-4264. E-mail: [e-mail & # 160 protegido]


4 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE FLOROTANINAS E TÉCNICAS HIFENADAS PARA ANÁLISE QUANTITATIVA

O uso de cromatografia líquida (LC) para quantificar as composições de florotanino em extratos de macroalgas é limitado pela falta de padrões disponíveis comercialmente. O único padrão de calibração disponível comercialmente é o monômero floroglucinol.

Koivikko et al. mediu a concentração de florotaninos através da integração de picos em um extrato bruto de Fucus vesiculosus. 38 O ensaio F-C foi usado para calcular o TPC desses compostos e, em seguida, um coeficiente de correlação de Pearson foi calculado entre os traços individuais do cromatograma e os conteúdos de florotaninos totais. Uma análise estatística adicional foi realizada para avaliar o quão bem a variação no perfil de cromatografia de florotanino pode explicar a variação do conteúdo de florotaninos totais por meio da realização de uma análise de regressão múltipla. Esta tentativa de quantificação, no entanto, não está completa, pois a área do pico no perfil cromatográfico é afetada pela sensibilidade do composto à detecção e pela estabilidade dos compostos em condições analíticas. 38 Portanto, mais pesquisas precisam ser realizadas com padrões caracterizados, a fim de desenvolver métodos qualitativos de análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).


1.14: Separação das Fosfatidilcolinas Usando HPLC de Fase Reversa - Biologia

um Instituto de Química, Universidade de Graz, Universitaetsplatz 1, 8010 Graz, Áustria
O email: [email protected]
Tel: +43 316 380 5318

Resumo

Amanita muscaria, também conhecido como cogumelo agárico com mosca, pode acumular vanádio (V), com até várias centenas de mg V kg −1 massa seca. É sabido que V está presente em A. muscaria como um complexo chamado amavadin, mas faltam métodos para a investigação da distribuição e biossíntese de amavadin em cogumelos. Aqui, nós descrevemos o desenvolvimento do primeiro método sensível para a determinação de amavadin e outros compostos contendo V em amostras ambientais, empregando cromatografia líquida de alta performance (HPLC) e espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado (ICPMS). Uma coluna de troca aniônica forte serve como fase estacionária, e a fase móvel consiste em um tampão de citrato de amônio aquoso e etilenodiaminotetracetato (EDTA). A concentração e o pH da fase móvel, bem como a temperatura da coluna foram avaliados para otimizar a separação. Com o método final, amavadin é eluído em menos de 17 minutos, e seu limite de detecção é de 0,05 μg V L −1 . Além disso, os dois isômeros do composto são separados um do outro e podem ser quantificados de forma independente. O método foi aplicado a extratos de amostras de corpos de frutos de A. muscaria. A eficiência de extração foi de 74 ± 12%, e amavadin foi responsável por 75–96% do V. extraído. Além disso, concentrações significativas de outras espécies de V puderam ser detectadas, que nunca foram descritas antes. Nossos resultados demonstram que a especiação V em cogumelos é mais complexa do que o assumido até agora e que investigações mais aprofundadas sobre este assunto são necessárias. O método desenvolvido permite a investigação de espécies V orgânicas e inorgânicas no meio ambiente, mesmo em baixas concentrações.


Referências

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2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 Materiais

Os padrões de ácido 3-hidroxibutírico (3-OH-FA (4: 0)) sal de sódio, ácido (±) −3-hidroxihexanóico (3-OH-FA (6: 0)), ácido (±) −3-hidroxioctanóico (3-OH-FA (8: 0)), ácido (±) −3-hidroxidecanóico (3-OH-FA (10: 0)), ácido (±) −3-hidroxidodecanóico (3-OH-FA (12 : 0)), (±) −3-hidroxi-ácido mirístico (3-OH-FA (14: 0)) e ramnolipídeo (R-95), di-rhamnolipídeo dominante (Rha), foram obtidos de Sigma Aldrich (Steinheim , Alemanha). Os solventes e aditivos usados ​​para detecção de MS eram de grau LC-MS. Metanol (MeOH), acetonitrila (ACN) e ácido acético (AcOH) foram obtidos de Carl Roth (Karlsruhe, Alemanha).

2.2 Preparação de amostra de padrões

Devido à solubilidade diferente em água, como consequência do comprimento de cadeia variável, 3-OH-FA (4: 0), 3-OH-FA (6: 0) e 3-OH-FA (8: 0) foram dissolvidos em H2O, enquanto 3-OH-FA (10: 0), 3-OH-FA (12: 0) e 3-OH-FA (14: 0) foram dissolvidos em MeOH / H2O (6: 4, v / v), ambos a uma concentração de 2 μg / mL.

2.3 Hidrólise de ramnolipídeo

Para hidrólise ácida, 5 mg de ramnolipídeo (R-95) foi suspenso em 0,5 mL 2,7 M H2TÃO4 em um frasco de vidro com tampa de rosca. Um volume de 0,5 mL de CHCl3 foi adicionado e o sistema bifásico obtido foi aquecido a 110 ° C durante 140 min. A camada de clorofórmio contendo o ácido graxo foi coletada, evaporada até a secura e, subsequentemente, solubilizada em 1 mL de MeOH.

Para hidrólise alcalina, foi preparada uma solução estoque de 5 mg de ramnolipídeo (R-95) em 0,5 mL de MeOH (10 mg / mL). A solução estoque (50 μL) e uma solução metanólica de 2N NaOH (50 μL) foram adicionadas a 900 μL de uma solução de THF / MeOH (9: 1, v / v) e agitadas por 2 h em temperatura ambiente (≈25 ° C). Os solventes foram então removidos sob vácuo, o resíduo diluído com 200 μL de água e acidificado com 0,1 M HCl para pH 2-3. A solução foi então extraída três vezes com 200 μL de acetato de etila, as camadas orgânicas combinadas evaporadas até a secura e reconstituídas com 100 μL de MeOH / H2O (3: 7, v / v). A solução foi diluída dez vezes (H2O) para análise de LC-MS.

2.4 Hidrólise de lipopeptídeo

O lipopeptídeo foi primeiro dissolvido em MeOH para obter a solução estoque (10 mg / mL). Uma alíquota de 50 μL (correspondendo a 500 μg) foi adicionada a 1 mL com uma solução de ácido clorídrico deuterado 6 M (DCl / D2O, 1: 1, v / v) em um frasco de vidro com tampa de rosca e aquecido por 24 h a 110 ° C. O ácido clorídrico foi evaporado em um evaporador de alto desempenho EZ-2 da GeneVac (Ipswich, Reino Unido). O resíduo foi extraído com 200 μL de uma mistura de água e clorofórmio na proporção de 1: 1 (v / v). A camada de clorofórmio contendo o ácido 3-hidroxialcanóico foi evaporada à secura usando o Genevac, e o resíduo reconstituído com 100 μL de MeOH. A solução foi dissolvida dez vezes com H2O para RP e MeOH para medições HILIC. A camada aquosa foi igualmente evaporada à secura e usada para análise de aminoácidos (relatado em outro lugar).

2.5 Instrumentação

A separação cromatográfica quiral foi realizada em um sistema Agilent 1290 Infinity UHPLC (Waldbronn, Alemanha) equipado com uma bomba binária (G4220A), um termostato de coluna (G1316A) e um amostrador automático PAL (CTC Analytics AG, Suíça). As separações foram realizadas em uma coluna CHIRALPAK IA-U (100 × 3,0 mm, 1,6 μm). As fases móveis foram constituídas por água (MP-A) e acetonitrila (MP-B), ambas contendo 0,1% (v / v) de ácido acético. O seguinte gradiente foi aplicado, salvo indicação em contrário: 0–2 min 10% MP-B, 2–20 min 10–100% MP-B, 20–22 min 100% MP-B, 22-22,1 min 100–10% MP-B e 22,1-25 min 10% MP-B. A taxa de fluxo foi de 300 μL / min, a temperatura da coluna de 40 ° C e o volume de injeção de 10 μL.

A detecção de MS foi realizada em um espectrômetro de massa AB SCIEX API 4000 MS / MS equipado com um TurboIonSpray (SCIEX, Ontário, Canadá) no modo de monitoramento de reação selecionada (SRM).Os parâmetros das transições de monitoramento de reação selecionadas, incluindo tempo de permanência, energia de colisão e potencial de delustering (DP), foram otimizados para cada composto individualmente e são exibidos na Tabela 1. O tempo de ciclo total foi de 385 ms. Todas as medições foram executadas no modo de polaridade negativa. O potencial de saída da célula foi ajustado para −15 V, o potencial de entrada para −10 V, a tensão da fonte de íons para −4500 V, a temperatura para 400 ° C, as pressões do gás nebulizador e do aquecedor para 30 psi, o gás de cortina para 35 psi, e o gás de dissociação ativado por colisão a 6 psi. O software PeakView 2.2 foi usado para análise de dados.

Nome T1 3º T Tempo de permanência (ms) CE DP
3-OH-FA (4: 0) 103 59.1 50 −15 −80
3-OH-FA (6: 0) 131.1 59.1 50 −15 −80
3-OH-FA (8: 0) 159.1 59.1 50 −15 −80
3-OH-FA (10: 0) 187.1 59.1 50 −20 −80
3-OH-FA (12: 0) 215.2 59.1 50 −20 −80
3-OH-FA (14: 0) 243.2 59.1 50 −20 −80
3-OH-FA (12: 0) [M + 1-H] - 132.1 59.1 50 −15 −80
3-OH-FA (14: 0) [M + 1-H] - 160.1 59.1 50 −15 −80

Métodos cromatográficos na separação de ácidos graxos mono e poliinsaturados de cadeia longa

Esta revisão apresenta vários sistemas cromatográficos, TLC, HPLC, GC e também SFC, desenvolvidos para identificação e quantificação precisa de ácidos graxos mono e poliinsaturados de cadeia longa de diferentes amostras com ênfase na literatura selecionada publicada na última década. Quase todos os aspectos, como a etapa de pré-separação de ácidos graxos (cis e trans), fase estacionária, sistema de solvente e modo de detecção são discutidos.

1. Introdução

Os ácidos graxos de cadeia longa (LC-FA) são compostos orgânicos nos quais o comprimento da cadeia de hidrocarbonetos pode variar de 10 a 30 carbonos. A cadeia de hidrocarbonetos pode ser saturada ou insaturada (contém uma ou mais ligações duplas). Com base no número de ligações duplas, os ácidos graxos insaturados são classificados nos seguintes grupos [1, 2]: (i) ácidos graxos monoenóicos (ácidos monoenóicos, MUFA), contendo uma ligação dupla, por exemplo, ácido oleico, (ii) ácidos graxos poliinsaturados (ácidos polienoicos, PUFA), tendo duas ou mais ligações duplas, por exemplo, γ-ácido linolênico, (iii) eicosanóides, que são derivados de ácidos graxos polienóicos, por exemplo, prostaglandinas.

Dados recentes da literatura indicam que tanto os ácidos graxos monoinsaturados quanto os poliinsaturados são compostos biológicos importantes que desempenham um papel significativo para os organismos vivos [3-17]. Estudos de alimentação humana durante os últimos dez anos demonstram que os PUFA, bem como os MUFA, são os principais componentes da dieta para redução do colesterol [4, 7, 9]. Além disso, tem havido muito interesse no efeito de MUFA e PUFA no sistema imunológico e inflamatório [13]. Entre os vários ácidos graxos monoinsaturados, o mais popular é o ácido oleico (C18: 1n-9). É encontrado em plantas (por exemplo, azeite), animais e microorganismos. O consumo de azeite de oliva traz benefícios para a prevenção do câncer de cólon e mama [8]. Os estudos atuais mostram que o ácido oleico desempenha um papel importante na prevenção da doença coronariana (capacidade de reduzir o colesterol LDL) [7, 9]. Os ácidos graxos poliinsaturados semelhantes aos ácidos graxos monoinsaturados são amplamente distribuídos na natureza [18]. Existem três classes de ácidos graxos insaturados comuns em tecidos humanos [5]: o ω-3 (n-3 PUFA), ω-6 (n-6 PUFA), e ω-9 (n-9 PUFA) ácidos graxos. Ao grupo de ácidos graxos insaturados discutidos pertence também o ácido demospongic, uma mistura de ácidos graxos de cadeia muito longa, principalmente C24–C30 com o sistema atípico de 5,9-diinsaturação. Ele existe em microrganismos, invertebrados marinhos e plantas terrestres [19]. As principais fontes de ômega-3 são peixes, algumas plantas e algas verdes [20]. Algas oleaginosas verdes são a fonte potencial do seguinte ω-3 ácidos: eicosapentaenóico (EPA), docosahexaenóico (DHA) e também ácido araquidônico (AA) de ω-6 grupo [21–23]. Os PUFA ômega-6 estão presentes em alta concentração em grãos, bem como em muitas sementes e carnes. Por esta razão podemos notar um aumento no consumo humano de frutos do mar nos últimos anos. Microrganismos oleaginosos, como fontes alternativas de PUFA a outros, como produtos de óleo animal, têm sido amplamente estudados. Protistas fungóides marinhos (Thraustochytrids) gostar Esquizochytrium foram considerados novos e excelentes DHA e EPA ω-3 produtores de ácidos graxos [24, 25]. Um excelente artigo de revisão realizado por Nichols demonstra que muitos microrganismos, incluindo bactérias marinhas, foram considerados os principais produtores de novo de PUFA n-3 [26]. Os dados da literatura disponíveis sugerem que nos últimos anos uma extensa pesquisa foi feita para a produção de PUFA por fungos [27, 28]. Como foi relatado por Arjuna entre vários microrganismos, uma fonte ideal de ácidos graxos poliinsaturados ômega-6 especificamente γ-ácido linolênico (GLA) pode ser certos fungos [27].

É bem conhecido que os PUFA podem afetar muitos processos fisiológicos, incluindo as funções cardiovasculares, neurológicas e imunológicas, bem como o câncer. O consumo de óleos ricos em n-3 LC-PUFA durante a gravidez reduz o risco de parto prematuro precoce [12]. Estudos com primatas não humanos e recém-nascidos humanos indicam que o DHA é essencial para o desenvolvimento funcional normal da retina e do cérebro, particularmente em bebês prematuros [13, 29]. Um novo artigo preparado por Kaczmarski et al. demonstrou o papel significativo do ácido linoléico e também α-ácido linolênico em alguns sintomas de dermatite atópica [17]. Portanto, pode-se notar que os PUFA são alvos nutracêuticos e farmacêuticos importantes [22].

Até hoje existe um desconhecimento sobre a função do LC-PUFA nos tecidos e células de mamíferos em que se encontram. No entanto, foi afirmado que os ácidos graxos poliinsaturados de cadeia muito longa são conhecidos por se acumularem em dois tipos de doenças peroxissomais genéticas principais, a síndrome de Zellweger e a adrenoleucodistrofia ligada ao X (X-ALD), caracterizada por fenótipos neurodegenerativos [30, 31]. O estudo de Hama e colaboradores mostrou a existência de muitos tipos de LC-PUFA em espécimes de pacientes Zellweger, sugerindo a possibilidade de um novo biomarcador para doenças peroxissomais [31]. Artigo de revisão realizado por Agbaga e colaboradores [32] resumiu o conhecimento atual de VLC-PUFA ao seu papel funcional na retina, que é altamente enriquecido em PUFA, com ênfase especial nas elongases responsáveis ​​por sua síntese pela proteína ELOVL4. O interesse em LC-PUFA foi reacendido em 1987 após LC-PUFA ter sido detectado inicialmente em retinas bovinas por Aveldano [33]. O efeito do LC-PUFA retinal em fotorreceptores de cones e bastonetes também foi descrito por Bennett et al. [34]. Outro artigo preparado por Butovich confirmou que, entre diferentes tecidos de mamíferos, o meibum é uma mistura excepcionalmente complexa de vários ácidos graxos [35].

Como a maioria dos LC-PUFAs, incluindo os ácidos graxos ômega-3 e ômega-6, não podem ser sintetizados em quantidade suficiente pelo organismo humano, eles devem ser fornecidos na dieta. O problema da suplementação de LC-PUFA e a exploração de uma nova fonte (alternativa ao óleo de peixe) de LC-PUFA (por exemplo, microalgas marinhas) é amplamente descrito por alguns anos em muitos artigos. Por esta razão, é necessário encontrar um método eficaz e rápido para a identificação e quantificação de ácidos graxos mono e poliinsaturados de cadeia longa recentemente desenvolvidos em plantas e frutos do mar. Um conjunto de várias ferramentas, como métodos cromatográficos, também é necessário para completar as características estruturais completas de PUFA em amostras de mamíferos, por exemplo, em plasma humano, cérebro, retina ou meibum. Isso é importante para fins de diagnóstico clínico.

Assim, esta revisão apresenta vários sistemas cromatográficos, TLC, HPLC, GC e também SFC, adequados para pré-separação e quantificação precisa de ácidos graxos mono e poliinsaturados de cadeia longa de diferentes amostras com ênfase na literatura selecionada publicada na última década.

2. Cromatografia de camada fina (TLC) de ácidos graxos mono e poliinsaturados de cadeia longa

Ácidos graxos de cadeia longa saturados e insaturados (MUFA e PUFA) são elementos estruturais básicos de lipídios. Portanto, a determinação cromatográfica da composição de ácidos graxos por TLC incluindo LC-MUFA e conteúdo de LC-PUFA é obrigatória para análise de lipídios em alimentos, agricultura e também em amostras biológicas [36-39]. Além disso, os ácidos graxos mono e poliinsaturados podem ser determinados cromatograficamente por TLC em lipídios de organismos aquáticos (por exemplo, peixes marinhos e de água doce, moluscos e algas marinhas) [40].

É bem conhecido que a cromatografia em camada delgada é um método clássico de separação, identificação e quantificação de ácidos graxos [41]. O levantamento bibliográfico da última década dedicado à análise de lipídios indica que, entre diferentes métodos analíticos, a cromatografia em camada delgada (TLC) e sua versão moderna a cromatografia em camada delgada de alto desempenho (HPTLC) ainda são ferramentas muito importantes em lipídios e também em gorduras. análise de ácidos. Conforme relatado por Fuchs et al. [41], existem muitas vantagens que tornam a TLC muito competitiva com a HPLC (cromatografia líquida de alta performance) na área de ácidos graxos, tais como simplicidade de uso, custo menos caro, pequeno consumo de solventes em comparação com HPLC, disponibilidade de análise de diversos amostras em paralelo, e possibilidade de fácil visualização de ácidos graxos insaturados após fracionamento por TLC por uso de corantes adequados [41]. O relatório de Sherma sobre a análise de TLC em amostras de alimentos e agricultura confirmou que o HPTLC quantitativo equipado com densitômetro pode produzir resultados comparáveis ​​aos obtidos pelo uso de cromatografia gasosa (GC) ou cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) [42].

O tópico moderno na análise de TLC de ácidos graxos mono e poliinsaturados é o uso de cromatografia em camada fina de alto desempenho em combinação com detecção por espectrometria de massa, por exemplo, HPTLC-MALDI-TOF / MS [43-48]. Estudos de pesquisa indicam que a detecção de MS é uma ferramenta poderosa para a identificação de manchas de TLC com mais detalhes em comparação com os métodos de coloração tradicionais [41].

Muitos tipos de fases estacionárias classificadas como normais (NP) e reversas (RP) são usadas para análise de ácidos graxos (MUFA e PUFA) por TLC. As camadas NP mais populares são sílica gel, alumina, celulose, amido, poliamidas e diatomito [42]. De todas as fases estacionárias acima mencionadas, a melhor é a sílica gel, que pode ser modificada adicionalmente por impregnação com diferentes agentes. A TLC de fase reversa é geralmente realizada em camadas RP-18, RP-2 ou RP-8 ligadas quimicamente [42].

Numerosos artigos de pesquisa de Nikolova-Damyanova e outros autores mostraram que a principal razão que explica porque a TLC desempenha um papel significativo na análise de ácidos graxos é a disponibilidade de vários adsorventes comerciais e caseiros, incluindo placas de TLC impregnadas [36, 41, 49-51] . A impregnação de placas de TLC com um reagente adequado pode melhorar a resolução de diferentes classes de compostos orgânicos, incluindo ácidos graxos. Dentre as diferentes modificações de fases estacionárias usadas em TLC, a sílica gel impregnada é um adsorvente muito adequado para análises de MUFA e PUFA [41].

2.1. Separação de MUFA e PUFA com o uso de placas de TLC impregnadas

Um dos procedimentos de impregnação de TLC usados ​​principalmente para separar ácidos graxos em amostras de lipídios complexos foi TLC de íon de prata (Ag-TLC). Informações detalhadas sobre Ag-TLC de ácidos graxos saturados e insaturados foram realizadas em vários artigos e livros [36, 49-51]. A cromatografia de íons de prata é baseada na capacidade do Ag + de formar complexos fracos de transferência de carga reversível com

elétrons das ligações duplas de ácidos graxos insaturados [36, 52]. A retenção de ácidos graxos insaturados de cadeia longa depende da força de complexação com Ag (I), do número de ligações duplas e sua configuração, e também da distância entre as ligações duplas. Os dados da literatura indicam que tanto as placas de vidro caseiras quanto as pré-revestidas são usadas no Ag-TLC [51]. Os procedimentos gerais de preparação das fases estacionárias para técnicas cromatográficas de íons de prata foram pesquisados ​​por Momchilova e Nikolova-Damyanova, em 2003 [53]. Entre os vários adsorventes de TLC disponíveis, a sílica gel é o principal material de apoio [53]. A impregnação da camada fina é realizada por pulverização ou imersão da placa em solução de nitrato de prata na concentração de 0,5–20% (no caso de imersão), enquanto para o procedimento de pulverização é recomendada solução de nitrato de prata de 10–40% [51, 53]. A fase móvel usada na argentação TLC geralmente consiste em dois ou três componentes, por exemplo, hexano, éter de petróleo, benzeno e tolueno. Além disso, pequenas quantidades de acetona, éter dietílico, etanol, metanol ou ácido acético podem ser adicionadas a essas fases móveis [40]. De vários agentes de visualização de manchas, aqueles que são mais populares para Ag-TLC de ácidos graxos são solução de etanol a 50% de ácido sulfúrico, ácido fosfomolíbdico e uma mistura de acetato de cobre-ácido fosfórico. Outro método de visualização é pulverizar as placas com indicador fluorescente por 2 ′, 7′-diclorofluoresceína em etanol e, em seguida, visualizar os pontos sob luz ultravioleta [36]. As regras gerais de migração na análise Ag-TLC de ácidos graxos foram descritas por Nikolova-Damyanova e colaboradores [53, 54]. De acordo com as sugestões de Nikolova-Damyanova, a retenção de ácidos graxos com mais de uma ligação dupla depende da distância entre as ligações e a ordem de eluição é a seguinte: ácidos graxos de ligações duplas separadas & gt ligações duplas interrompidas & gt ligações duplas conjugadas ácidos graxos insaturados de cadeia mais longa (LC-PUFA) são mantidos com menos força do que os ácidos graxos de cadeia mais curta e ácidos graxos com trans as ligações duplas são mantidas com menos força do que os ácidos graxos com cis ligações duplas [53, 54].

Uma das primeiras análises Ag-TLC de ácidos graxos foi realizada por Wilson e Sargent em 1992 para separar PUFA com interesse fisiológico. Os ésteres metílicos de PUFA foram separados em placas de gel de sílica 60 TLC impregnadas com AgNO3. As placas foram reveladas com tolueno-acetonitrila (97: 3, v / v). A visualização das manchas foi feita com o uso de acetato de cobre a 3% e ácido ortofosfórico a 8%. Foi afirmado que esta técnica é particularmente útil para estudos metabólicos dos PUFAs de cadeia alongada [55]. Em outro trabalho, Wilson e Sargent mostraram que placas de TLC impregnadas com nitrato de prata foram úteis na separação de ácidos graxos monoinsaturados (como ésteres metílicos) de ácidos graxos poliinsaturados e também de ácidos graxos saturados, respectivamente, em estudos metabólicos de ácidos graxos por fibroblastos de pele humana [56 ] Próximo trabalho de Lin et al. indicou que sílica gel e hexano-clorofórmio-éter dietílico-ácido acético (80: 10: 10: 1, v / v / v / v) foram bons na análise de ácido docosahexaenóico (22: 6 DHA) nos espermatozóides de macacos [ 57]. Fosfolipídios individuais desta amostra foram separados por outro sistema, como clorofórmio-metanol-éter de petróleo-ácido acético-ácido bórico (40: 20: 30: 10: 1,8, v / v / v / v / v). Outros dados da literatura confirmaram que a cromatografia em gel de sílica argentato possibilitou a obtenção do ácido eicosapentaenóico de alta pureza extraído de microalgas e óleos de peixe [58]. As revisões recentes da literatura que se concentraram na cromatografia de TLC mostram que, entre diferentes materiais cromatográficos, Ag-TCM-TLC (prata-tiolato de sílica gel) é muito estável (em comparação com placas Ag-TLC altamente sensíveis à luz) para análise de TLC de insaturados compostos orgânicos, incluindo MUFA e PUFA. Dillon et al. [59] confirmaram que o sistema Ag-TCM-TLC opera de forma semelhante ao Ag-TLC, separando os ácidos graxos no grau de insaturação (número de ligações duplas). Os resultados desta análise são comparáveis ​​aos obtidos por Ag-TLC. O método Ag-TCM-TLC foi utilizado para analisar alguns polihidrocarbonetos e também ésteres metílicos de ácidos graxos insaturados contendo de 0 a 6 ligações duplas na forma de ésteres metílicos. Uma mistura consistindo de hexano-acetato de etilo (9: 1, v / v) foi usada como fase móvel. Nessas condições, foi observada a separação completa dos ácidos graxos com 0–5 ligações duplas. A resolução de ácidos graxos consistindo em 6 ligações duplas de outros não foi alcançada neste caso [59].

Os resultados apresentados nesta seção mostram que várias placas comerciais de sílica gel foram utilizadas na separação de ácidos graxos insaturados, mas algumas delas não são adequadas para o processo de derivatização por metilação de ácidos graxos em placas de TLC e a seguir sua quantificação por cromatografia gasosa, pois causa a perda de ácidos graxos separados [60]. O procedimento de metilação dos ácidos graxos após seu prévio fracionamento em sílica gel argentato foi utilizado nas análises de ácidos graxos insaturados de sementes ricas em lipídios. Neste caso, uma mistura de hexano-éter dietílico-ácido acético e 70: 30: 1 (v / v / v) foi usada como fase móvel. As placas foram pulverizadas com solução etanólica de 2 ′, 7′-diclorofluoresceína e a seguir identificadas sob lâmpada UV (a 365 nm) [60]. O impacto de Ag-sílica gel na análise de TLC de ácidos graxos metilados, por exemplo, c9, t11-CLA (isômero de ácido linoléico) em plasma humano como uma etapa anterior antes da quantificação de GC foi mostrado por Shahin et al. [61]. Outro artigo preparado por Kramer et al. demonstrou que a melhor técnica para analisar o CLA e trans Isômeros 18: 1 em produtos sintéticos e animais é a combinação de cromatografia gasosa com Ag-TLC ou com Ag-HPLC [62]. Além disso, o uso de Ag-TLC na separação de formas isoméricas de EPA e DHA obtidas após sua isomerização química (durante a desodorização de óleo de peixe) pode ser encontrado em um artigo de Fournier et al. [63].

Uma nova aplicação do Ag-TLC é a bioanálise. Um método simples e rápido de TLC para análise dos níveis de PUFA no sangue humano foi desenvolvido por Bailey-Hall et al. [64].

Deve-se ressaltar que, além da modificação do gel de sílica com íons Ag +, os seguintes sais metálicos, Cu (I), Cu (II), Co (III) e Zn (II), podem ser utilizados para impregnação de Placas de TLC [41, 65]. Outro tipo de agente de impregnação para análise por TLC de ácidos graxos (MUFA e PUFA) é o ácido bórico. Afirmou-se que os metabólitos do ácido araquidônico foram satisfatoriamente separados em sílica gel impregnada com ácido bórico como agente complexante e por fase móvel: hexano-éter dietílico (60: 40, v / v) [41, 65]. A próxima modificação da fase estacionária que tem impacto no efeito de resolução de ácidos graxos e seus derivados, como metabólitos (por exemplo, fosfolipídios) é EDTA e fase móvel contendo clorofórmio-metanol-ácido acético água em composição de volume de 75: 45: 3: 1 [ 41, 66]. Outro trabalho mostrou que a separação eficiente de cinco fosfolipídios diferentes pode ser alcançada pela impregnação de placas de TLC com 0,4% de sulfato de amônio. Uma mistura de clorofórmio-metanol-ácido acético-acetona-água em composição de volume de 40: 25: 7: 4: 2 foi adequada para este procedimento [67].

Além do sistema de TLC apresentado acima em fase normal (NP-TLC), ácidos graxos insaturados e seus metabólitos podem ser separados em placas de RP-TLC. Um dos primeiros relatórios que estão focados na análise RP-TLC de PUFA foi feito por Beneytout e colegas de trabalho em 1992 [68]. Beneytout et al. separou o ácido araquidônico e seus metabólitos na camada de fase reversa. As placas eram de sílica gel revestidas com fenilmetilvinilclorossilano.Uma mistura de heptano-formato de metila-éter dietílico-ácido acético (65: 25: 10: 2, v / v / v / v) foi aplicada como fase móvel [68].

2.2. 2D-TLC de MUFA e PUFA

A TLC bidimensional (2D-TLC) é uma das ferramentas poderosas recentemente desenvolvidas para separar várias misturas de lipídios e ácidos graxos provenientes de lipídios. Sabe-se que o 2D-TLC melhorou a qualidade da separação, mas é muito mais demorado em comparação com o muito popular 1D-TLC [41]. A revisão da literatura mostrou que o 2D-TLC é antes um método de escolha para a separação de lipídios de polifosfoinositídeos da membrana celular e também de produtos de oxidação de lipídios em mistura. Esta análise é geralmente realizada em sílica gel impregnada com acetato de magnésio (7,5%) e pelo sistema solvente clorofórmio-metanol-amônia (5: 25: 5, v / v / v) na primeira direção e clorofórmio-acetona-metanol-acético água ácida (6: 8: 2: 2,1, v / v / v / v) na segunda dimensão [69].

2.3. Detecção de manchas e métodos de quantificação de MUFA e PUFA

A detecção de ácidos graxos pelo método de TLC é baseada na sua visualização por ligação a um corante. Como foi relatado em excelente revisão por Fuchs et al. [41] muitos reagentes de visualização adequados para a detecção de ácidos graxos são descritos na literatura. Entre eles, os reagentes mais populares são os vapores de iodo, 2 ′, 7′-diclorofluoresceína, rodamina 6G, que produzem manchas coloridas, e também primulina, que dá sensibilidades na faixa dos nanomoles [41]. No caso de PUFA, o escurecimento intenso é obtido após sua separação em AgNO3 placas de TLC impregnadas (como um efeito de redução de Ag + para prata coloidal), mas este método de detecção exigia a presença de hidrocarboneto aromático como componente da fase móvel [70]. Outros reagentes de visualização são os seguintes: ácido sulfúrico, dicromato de potássio em ácido sulfúrico a 40% ou solução de acetato cúprico a 3–6% em ácido fosfórico. Além disso, a detecção de diferentes ácidos graxos é possível por PMA (ácido fosfomolíbdico) e por vapores de cloreto de sulfurila [41]. A visualização de manchas de ácido graxo é realizada pulverizando ou mergulhando as placas em solução dos respectivos agentes de visualização. Em seguida, as manchas são observadas sob luz ultravioleta ou identificadas por densitometria. Para uma caracterização mais detalhada dos ácidos graxos que foram separados por cromatografia em camada fina, pode ser usado TLC combinado com espectrômetro de massa (TLC-MS). Neste método as manchas são eluídas das placas cromatográficas com os respectivos solventes e os ácidos graxos obtidos a seguir são analisados ​​por MS. A aplicação de TLC juntamente com MS permite alta resolução de picos identificados. Além disso, não há necessidade de extrair amostra das placas antes desta análise [41]. Uma novidade na instrumentação cromatográfica de camada fina é um TLC em combinação com o espectrômetro MALDI MS (TLC MALDI) [44, 71, 72]. Esta técnica é bastante rápida e fornece espectros que podem ser analisados ​​de forma relativamente simples e tolera alta contaminação da amostra [41]. O limite de detecção de ácidos graxos determinado por TLC MALDI pode ser inferior a 1 nanograma [41]. Foi afirmado que o TLC MALDI poderia ser aplicado de forma satisfatória a uma mistura de lipídios muito complexa (por exemplo, extratos de células-tronco) [47]. Por exemplo, por meio de cromatografia de camada fina combinada e análises MALDI-TOF / MS do extrato lipídico total do archaeon hipertermofílico Pyrococcus furiosus foram realizados [45]. A próxima tendência moderna na análise do perfil lipídico é o uso do método TLC acoplado ao FID (detector de ionização de chama) [73]. Chromarod / Iatroscan TLC-FID foi usado com sucesso na análise de classes de lipídios e seus constituintes de ácidos graxos extraídos de frutos do mar. Conforme descrito no artigo de Sinanoglou et al. [73], o Iatroscan é um instrumento que combina resolução de TLC com capacidade de quantificação por FID. A separação TLC-FID eficiente pode ser alcançada pela adição do sistema de solvente polar sem alterar a fase estacionária. No entanto, este aparelho permite analisar em um curto espaço de tempo (2-3 horas) em comparação com GC ou HPLC cerca de 30 amostras [73].

2.4. Separação TLC de cis e trans Isômeros de MUFA e PUFA

Como foi relatado que os ácidos graxos saturados indicam correlação com doenças cardiovasculares, os ácidos graxos insaturados têm sido recomendados para substituição dos ácidos graxos saturados na dieta. Por esse motivo, observa-se um aumento do interesse por ácidos graxos insaturados, como os ácidos graxos n-6 e n-3. É conhecido que os ácidos graxos insaturados discutidos formam isômeros geométricos específicos. Eles podem ser trans ou cis dependendo da orientação da ligação dupla. De todos os ácidos graxos poliinsaturados, o trans PUFA consistindo de comprimentos de cadeia C18, C20 e C22 geralmente fazem parte da dieta humana. Assim, é muito importante detectá-los e quantificá-los em produtos alimentícios. Um dos métodos mais populares de obtenção de ácidos graxos mono-, di- e tri-insaturados na forma de isômeros geométricos (cis e trans), respectivamente, é processo térmico ou químico [63]. Síntese de trans isômeros geralmente é feito pela fabricação de alimentos (refino, hidrogenação). Por exemplo, trans isômeros são formados durante a desodorização (etapa crucial do refino) de óleos vegetais ou de peixe. Conforme relatado por Fournier et al. [63], as metodologias relativas à separação e quantificação precisa de trans isômeros de ácidos graxos mono, di e triinsaturados por métodos cromatográficos foram desenvolvidos na última década. Ag-TLC é uma das técnicas cromatográficas mais poderosas amplamente aplicadas para separar cis e trans isômeros de LC-PUFA porque é caracterizado pela simplicidade, baixo custo e eficiência. Os isômeros geométricos são separados de acordo com seu número de ligações duplas. A eficácia do Ag-TLC para a separação dos isômeros EPA e DHA foi confirmada por Fournier et al., Em 2006 [63]. Para este efeito, placas de TLC pré-revestidas com sílica gel e impregnadas com AgNO3 foram usados. Uma mistura de tolueno-metanol na composição de volume 85: 15 foi aplicada como um móvel para resolução de mono-, di-, tri-, tetra-, penta-trans e DHA hexa-trans isômeros [63]. Em outro trabalho, a fim de determinar o perfil de cis e trans isômeros de CLA no fígado pelo método de TLC, uma mistura de triclorometano-n-hexano-ácido etanóico glacial 65: 35: 1 (v / v / v) e também placas de sílica gel foram aplicadas. Solução de rodamina foi usada como agente de visualização. Em etapas posteriores, após a metilação dos ácidos graxos separados, eles foram quantificados pelo método GC [74].

O próximo artigo indicou que a cromatografia em camada fina de nitrato de prata preparativa foi aplicada com sucesso para analisar o cis, cis-ácido octadecadienóico (18: 2) em amostras comerciais de gordura de manteiga bovina. O detectado por Ag-TLC cis, cisO isômero -5,9-18: 2 foi encontrado pela primeira vez na gordura da manteiga [54]. Em outro estudo alimentar, noventa e três amostras comerciais de gorduras da manteiga búlgara fabricadas uniformemente ao longo do ano foram submetidas a nitrato de prata quantitativo-TLC de componentes de ácidos graxos (como ésteres de isopropila), com atenção especial para trans conteúdo de ácidos graxos monoenóicos [75]. Todos os resultados realizados indicam que a argentação TLC deve ser uma técnica analítica eficaz no fracionamento e identificação de isômeros geométricos de ácidos graxos insaturados, como os PUFA.

A Tabela 1 mostra os sistemas de TLC mais eficientes usados ​​para separação e fracionamento de ácidos graxos de várias matrizes.

3. Cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)

Existem poucos artigos originais e análises excelentes até hoje que se concentram no uso de cromatografia em coluna líquida para a análise de ácidos graxos (saturados e insaturados) e também suas substâncias relacionadas em amostras biológicas, alimentares e de drogas [18, 93-96] . Nestes artigos, os princípios de HPLC, incluindo a preparação da amostra, fases móveis, fases estacionárias e métodos de detecção foram amplamente executados. Entre os artigos de revisão anteriores, apenas três deles levantam conhecimentos sobre ácidos graxos de cadeia longa. Um deles elaborado por Rao et al. [94] mostrou a análise LC-PUFA com uso de HPLC, mas desde 1974 até 1995. Artigo seguinte apoiado por Rezanka e Votruba [96] demonstrou o uso de cromatografia incluindo HPLC para análise de ácidos graxos de cadeia muito longa de 1982 a 2001. A terceira revisão preparada por Kolanowski e colaboradores [97] descreveu os métodos instrumentais importantes, como HPLC e também GC para análise de ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa ômega-3, mas apenas em alimentos. A falta de uma visão geral sobre as novas conquistas na análise de HPLC de ácidos graxos mono e poliinsaturados com ênfase na análise de ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa, como ômega-3 e ômega-6, faz com que haja uma necessidade de realizar uma análise completa levantamento da literatura de 2002 a 2013 (última década) com ênfase na aplicação de HPLC para a análise de todos os LC-MUFA e LC-PUFA biológicos importantes ao nível analítico em várias matrizes. Este artigo destaca as conquistas modernas do HPLC, incluindo os princípios de análise de MUFA e PUFA em diferentes matrizes: modos de separação e os novos sistemas de detecção que permitem a quantificação de LC-PUFA em nível de nanograma. O conhecimento atual da análise de HPLC de ácidos graxos mono e poliinsaturados foi descrito com base nos trabalhos publicados durante a última década (2002-2013).

O uso de HPLC para a separação e quantificação de ácidos graxos aumentou desde 1950, quando foi aplicado pela primeira vez por Haward e Martin para análise de alguns ácidos graxos [98]. Deste momento até hoje, um progresso muito rápido na análise de HPLC de todos os ácidos graxos, incluindo LC-MUFA e LC-PUFA, é observado. Sabe-se que, com base na natureza da fase estacionária (sólida ou líquida), a cromatografia líquida de alta eficiência é dividida em [18] cromatografia líquido-líquido (LLC), cromatografia de adsorção (LSC) e cromatografia de fase reversa (RP) , que é uma combinação de LSC e LLC.

Entre as técnicas de cromatografia líquida de alto desempenho mencionadas acima, a RP-HPLC desempenha um papel fundamental na análise de LC-PUFA [94]. Esta técnica permite separar aqueles ácidos graxos que não podem ser separados por HPLC de fase normal. Como foi relatado anteriormente por Rao et al. [94] a retenção de ácidos graxos em RP-HPLC depende da polaridade da fase estacionária, fase móvel e estrutura química dos ácidos graxos examinados. Em geral, o tempo de retenção é proporcional ao comprimento da cadeia e ao número de ligações duplas presentes nos ácidos graxos examinados. Além disso, a influência da isomerização geométrica de ácidos graxos desempenha um papel muito importante na análise de HPLC de fase reversa. Foi relatado que o cis isômeros dos ácidos graxos são geralmente eluídos antes trans isômeros. Efeito semelhante é observado no caso das diferenças no número de carbonos nos ácidos graxos estudados. Aqueles com pequena quantidade de carbonos (cadeia curta) são eluídos primeiro em comparação com os ácidos graxos de cadeia longa [94]. A literatura atual indica que a HPLC de fase reversa é um dos métodos populares usados ​​no campo da análise de ácidos graxos de MUFA e PUFA devido à sua simplicidade, reprodutibilidade e credibilidade. Os resultados obtidos por HPLC são geralmente comparáveis ​​aos determinados usando o método GC. Além disso, o tempo de análise é comparável à técnica de GC [94]. No entanto, o desenvolvimento de um novo modo de detector, como detector de ionização de chama (FID) ou detector eletroquímico (ED), aumenta a aplicabilidade do HPLC para análise de MUFA e PUFA [93].

3.1. Métodos de derivatização de ácidos graxos para análise de HPLC

O problema mais importante no estudo de HPLC de LC-MUFA e também LC-PUFA é a necessidade de detectá-los em níveis de concentração mais baixos, como nanogramas ou picogramas. A derivatização de ácidos graxos pode melhorar a importância dos parâmetros de análise de HPLC, como sensibilidade, precisão, seletividade e também um limite de detecção e quantificação [18, 95]. Diferentes métodos de derivatização usados ​​para determinação quantitativa e qualitativa de ácidos graxos foram amplamente descritos no artigo de revisão de Rosenfeld em 2002 [99]. Geralmente, o tipo de agente de derivatização depende do tipo de detector aplicado na análise de PUFA, incluindo absorção de UV, fluorescência, dispersão de luz e detectores de índice de refração [94].

O detector UV-VIS é o sistema de detecção mais popular aplicado em cromatografia líquida porque é sensível e específico. Em 1983, Aveldano e colaboradores [100] aplicaram cromatografia líquida de alta pressão de fase reversa com detecção de UV em coluna de octadecilsilila para separar uma mistura de ácidos graxos saturados e insaturados não derivatizados e seus ésteres metílicos provenientes de tecidos de mamíferos.

Geralmente, a fim de facilitar a detecção por absorção de UV-VIS, os seguintes reagentes de derivatização para ácidos graxos são usados ​​[93]: brometo de fenacil (PB), brometo de p-bromofenacil (BPB), brometo de p-clorofenacil (CPB), p-nitrofenacil brometo que é usado na análise de ácidos graxos em óleos, padrões e sangue na faixa de ng a pmol [97]. Os ésteres de naftil (obtidos por brometo de 2-naftil, p-nitrofenacil e p-diclorofenacil permitem a detecção de picogramas de ácidos graxos na mistura padrão. 2-Nitrofenilhidrazina (NPH) e 2-bromoacetofenona (ou α, p-dibromoacetofenona, BAP) convertem os ácidos graxos em derivados específicos que podem ser detectados em amostras biológicas (soro) com limites de detecção em fmoles. PNB (p-nitrobenzil) e derivados de cloreto de p-metiltiobenzil (MTBC) de ácidos graxos com limites de detecção em pmoles são importantes na análise de óleo de coco. O reagente de derivatização ideal para a separação quiral de ácidos graxos é o 3,5-dinitrofenil isocianato (DNPI) [96].

O próximo sistema de detecção muito popular aplicado em HPLC é o detector de fluorescência, que tem maior sensibilidade em comparação com o detector UV-VIS. Por esta razão, ele pode quantificar a composição de ácidos graxos em nível de picomole e femtomole. Vários reagentes fluorescentes são usados ​​para a derivatização de ácidos graxos, como 9-diazometilantraceno (9-DMA) e 9-antrildiazometano (ADAM). Os ésteres de metila de anitrila de ácidos graxos podem ser facilmente detectados no plasma humano e no soro em picomoles. Outros derivados mais sensíveis do que ADAM são os ésteres de pirenildiazometano (PDAM). As cumarinas e o 9-aminofenantreno (9-AP) são importantes na detecção de ácidos graxos em amostras ambientais e biológicas na faixa de pmoles a fmoles. Outros derivados como dansil piperazinas e acetamidas de ácidos graxos podem ser detectados no soro abaixo da faixa de 100 fmol [93, 94, 97]. Estudo recente realizado por Wang e colegas de trabalho em 2013 indica que o uso de um novo reagente de marcação fluorescente denominado 1,3,5,7-tetrametil-8-butiretilendiamina-difluoroboradiaza-s-indaceno (TMBB-EDAN) uma técnica de HPLC rápida e sensível para o a determinação de ácidos graxos em amostras biológicas (por exemplo, soro humano) foi desenvolvida. Com o procedimento proposto, o limite de detecção de derivados de ácidos graxos estava na faixa de 0,2–0,4 nM [101].

Outro tipo de detecção de ácidos graxos é a quimioluminescência. Este método é baseado na pré-etiquetagem dos grupos –COOH com um reagente quimioluminogênico adequado. Na prática, o luminal e seu composto isoluminal relacionado têm sido amplamente utilizados como reagentes de derivatização por quimioluminescência para ácidos graxos devido às suas propriedades quimioluminescentes. O sistema de detecção descrito é eficiente para a detecção sensível de ácidos graxos no soro e plasma humanos em picomoles [93].

Para detectar as substâncias com propriedades oxidantes ou redutoras, incluindo ácidos graxos, um detector eletroquímico (ED) pode ser usado. Este modo de detecção permite a medição de ácidos graxos em amostras biológicas complexas contendo diferentes componentes em níveis de nanograma. Para obter a maior sensibilidade, os seguintes reagentes de derivatização para ED podem ser aplicados: p-aminofenol 2,4-dimetoxianilina 2-bromo-2′-nitroacetofenona derivados de ferroceno 2,4-dinitrofenilhidrazina e cloreto de 3,5-dinitrobenzoílo. A aplicação clínica de HPLC-ED é mostrada no artigo de Kotani et al. [80]. Neste trabalho foi realizada a determinação de ácidos graxos plasmáticos incluindo PUFA como o ácido araquidônico e também linoléico por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector eletroquímico (HPLC-ED) [80]. Este procedimento pode ser considerado adequado para monitorar ácidos graxos plasmáticos em pacientes diabéticos.

Entre os diferentes tipos de detectores usados ​​na análise de ácidos graxos por HPLC, muito útil é aquele detector que não requer nenhum dos procedimentos preliminares de derivatização dos compostos estudados como, por exemplo, detector evaporativo de dispersão de luz (ELSD) ou espectrômetro de massa (MS) [93 ] Como foi descrito no artigo de Lima e Abdalla [93], o detector evaporativo de espalhamento de luz é sensível à massa do analito vaporizado e seu sistema de operação não é limitado pelas características de absorção dos componentes individuais e pela natureza do eluente. Assim, ELSD pode ser usado para resolver o problema de separação de ácidos graxos que possuem grupos de absorvância fraca [93].

3.2. Detecção de espectrometria de massa de ácidos graxos

A aplicação de HPLC-MS na análise de ácidos graxos é conhecida apenas na última década. O espectrômetro de massa é amplamente utilizado na análise de ácidos graxos, especialmente no caso de amostras biológicas. Uma das principais vantagens do método HPLC-MS é a possibilidade de analisar compostos não voláteis, incluindo ácidos graxos [93]. Vários modos de ionização e detecção podem ser aplicados para análise de ácidos graxos, como ionização por eletrospray (ESI), ionização química de pressão atmosférica (APCI) e também tempo de vôo (TOF). Uma nova possibilidade em HPLC-espectrometria de massa é tandem MS (HPLC-MS-MS) ou combinação de ionização por electrospray com espectrômetro de massa em tandem, como a técnica HPLC-ESI-MS-MS. A principal vantagem do LC-ESI é a grande separação de ácidos graxos em matrizes complexas como o plasma sanguíneo. HPLC-MS-MS é uma ferramenta poderosa na determinação da posição da ligação dupla ou pontos ramificados na cadeia de ácidos graxos insaturados [93]. O próximo método de HPLC desenvolvido para detecção de ácidos graxos de cadeia longa é o método HPLC-MS combinado com APCI, que foi aplicado na detecção de ácidos graxos de cadeia muito longa na forma de ésteres de picolinila provenientes da cera de cana-de-açúcar [102]. HPLC-MS acoplado a três sistemas de ionização, impacto de elétrons (EI), ionização química de pressão atmosférica e ionização por eletrospray, foi adequado para a determinação precisa de PUFA e também de seus metabólitos oxidativos, como eicosanóides em amostras biológicas na faixa de pg [103 ] De acordo com artigos preparados por Řezanka et al., Que se concentraram na análise de ácidos graxos em organismos inferiores, a espectrometria de massa por cromatografia líquida acoplada ao modo de ionização APCI foi o método mais eficiente aplicado para identificação e quantificação de ácidos graxos poliinsaturados de cadeia muito longa de origem marinha organismos (que têm capacidade de produzir VLC-PUFA), como dinoflagelados marinhos Amphidinium carterae e algas verdes Chlorella kessleri [81, 104-106] e também em óleo obtido a partir de Ximenia frutas (matéria-prima para a indústria cosmética) [107]. Como foi realizado nestes papéis, o sistema HPLCMS-APCI consistia em coluna Hichrom (HIRPB-250AM) e programa de solvente gradiente com acetonitrila (MeCN), diclorometano (DCM) e propionitrila (EtCN) que eram adequados para a separação 13 de ésteres de picolinila de VLCPUFA de organismos inferiores. Excelente separação de ésteres metílicos de ácidos graxos insaturados provenientes de crustáceos de água doce foi alcançada pela mesma fase móvel e a coluna cromatográfica embalada com fase octadecilsilila (Supelcosil LC-18) [108]. Uma extensa revisão de um muito longo poliinsaturado publicado por Řezanka e Sigler indica que os métodos analíticos modernos como HPLC-MS tornam possível a detecção e identificação de VLC-PUFA em diferentes classes de lipídios, incluindo reinos microbianos e fungos [109]. HPLC de fase reversa com eluição gradiente do sistema solvente contendo acetonitrila e clorofórmio e equipado com detector de dispersão de luz (ELSD) foi usado para purificar e identificar os ésteres metílicos de PUFA C16-C28 incluindo ácido octacosaoctaenóico em miligramas de microalgas marinhas [82] . Um método simples baseado em cromatografia líquida de alta eficiência de par iônico de fase reversa (RP-HPLC) foi usado com sucesso para separar os vários monoepóxidos dos ácidos eicosatrienóico, araquidônico, eicosapentaenóico e docosahexaenóico [110]. Esses compostos foram facilmente identificados por espectrometria de massa por cromatografia líquida (HPLC-MS) com ionização química à pressão atmosférica (APCI) na faixa de nanogramas [110]. Este trabalho demonstrou que o método baseado em APCI-MS acoplado a HPLC é altamente confiável para a análise de vários monoepóxidos de PUFA em seu estudo de metabolismo. Outro sistema de HPLC, como cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa não aquosa (NARP-HPLC) com ionização química de pressão atmosférica (APCI-MS) foi adequado para a detecção de 5 ácidos graxos interrompidos com polimetileno insaturado, como cis-5,9-octadecadienóico (taxoléico), cis-5,9,12-octadecatrienoico (pinolênico), cis-5,11-eicosadienóico (ceteleerônico), e cisÁcidos -5,11,14-eicosatrienóicos (sciadônicos) isolados de óleos de sementes de coníferas (obtidos de European Larch, Norway Spruce e European Silver Fir) [111]. A combinação de dois métodos cromatográficos, como TLC e HPLC, foi usada para analisar os ácidos graxos n-3 em suplementos dietéticos de óleo de peixe. As frações EPA e DHA obtidas por meio do método Ag-TLC foram posteriormente analisadas por HPLC. A coluna cromatográfica ODS (3,9 mm × 30 cm, 10 µm), fase móvel contendo tetra-hidrofurano-acetonitrila-água-ácido acético 25: 35: 75: 0,4 (v / v / v / v) e detector de matriz de fotodiodo na faixa de 190-240 nm foram usados ​​nesta análise [112 ] Sistema HPLC equipado com coluna analítica Supelcosil C18 (4,6 mm × 25 cm) e detector de fotodiodo (DAD) foi utilizado para a análise de hidroperoxi PUFA como produtos de peroxidação provenientes do plasma humano. Foi usada uma mistura de ácido acético-acetonitrila-tetra-hidrofurano 52: 30: 18 (v / v / v) como fase móvel. A análise foi monitorada em 200-300 nm. O controle de quantidade por procedimento aplicado de derivados obtidos de PUFA pode ser útil como marcadores clínicos de estresse oxidativo em sistemas biológicos [113]. Em outra cromatografia líquida de fase reversa de gradiente de papel (C18 ODS 25 cm × 0,46 cm, 5 µm) pelo uso de metanol água e detector ELSD universal permitiu a separação e fracionamento de ácidos graxos livres saturados, insaturados e oxigenados como ésteres metílicos extraídos de sementes de Crepis alpina e Vernonia anthelmintica, respectivamente [114]. Este trabalho mostrou que a fase reversa C18 foi adequada para purificação e fracionamento de PUFA antes de sua quantificação por GC-MS. Além do sistema HPLC equipado com os tipos de modos de detector mencionados acima, como ECD, MS, ELSD, DAD e UV, um detector de fluorescência também é muito útil [115, 116], o que permitiu a determinação precisa de ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa, incluindo linolênico , ácidos araquidônico, eicosapentaenóico e docosahexaenóico no soro humano em baixas concentrações como fmoles. Por exemplo, o método descrito em 1986 por Yamaguchi et al. realizaram a conversão de LC-PUFA em derivados fluorescentes por reação com 3-bromometil-6,7-dimetoxi-1-metil-2 (1H) -quinoxalinona. O processo de separação foi realizado em uma coluna de fase reversa (YMC Pack C8) com uma eluição isocrática usando acetonitrila aquosa 72% (v / v) [115]. A literatura atual mostra que HPLC com diferentes sistemas de solventes é adequado na análise de novos ésteres de ácidos graxos e fosfóricos de hidroxila de ácido 10-hidroxi-2-decenóico (9-HAD) provenientes da geléia real de abelhas (Apis mellifera) A análise de HPLC foi realizada em sistemas de coluna Diaion HP-20, Sephadex LH-20 e Cosmosil 75C18-OP. Diferentes fases móveis contendo acetonitrila foram aplicadas. Um detector de índice de refração foi aplicado para monitorar o perfil de eluição dos ácidos graxos examinados [117].

3.3. HPLC de íons de prata na quantificação e identificação de isômeros geométricos de ácidos graxos

Como foi relatado por Nikolova-Damyanova e Momchilova [118], HPLC de íons de prata (Ag-HPLC) é amplamente aplicado por muitos cientistas como uma etapa preliminar para o fracionamento de uma mistura complexa de ácidos graxos em seus grupos antes da análise quantitativa por GC método. A resolução de ácidos graxos por meio de Ag-HPLC é obtida de acordo com o número e a geometria das ligações duplas [118]. A separação é baseada na formação reversível de um complexo de transferência de carga fraco entre um íon de prata e uma ligação dupla. O principal problema do Ag-HPLC é a introdução de Ag + neste sistema. Assim, semelhante ao caso de Ag-TLC, a primeira tentativa foi realizada na coluna que foi embalada em laboratório com pasta da fase estacionária (por exemplo, sílica gel) impregnada com AgNO3. O segundo método é adicionar solução de íon de prata (AgNO3) na fase móvel. O terceiro método é usar coluna de troca catiônica à base de sílica disponível comercialmente (Nucleosil 5 SA), ou a coluna que é produzida por Chrompack (ChromSpher 5 lipídios). Esses sistemas de coluna comerciais fornecem resultados muito melhores (melhor reprodutibilidade) de análises de ácidos graxos do que aqueles preparados em laboratório [118]. Outra excelente revisão dos métodos cromatográficos usados ​​para analisar isômeros geométricos e posicionais de ácidos graxos por Aini et al. [119] mostraram que os seguintes fatores afetam a resolução de ácidos graxos em HPLC de íons de prata, como o método de impregnação da coluna, a composição da fase móvel e também a temperatura da coluna [119]. A escolha da composição da fase móvel usada em Ag-HPLC é geralmente à base de tolueno, à base de acetonitrila, à base de hexano ou à base de diclorometano [118, 120]. Bons resultados foram alcançados com o uso de isopropanol e tetra-hidrofurano como modificador. A temperatura mais baixa da coluna geralmente resulta em menor tempo de eluição em Ag-HPLC. Além disso, a melhoria na resolução de ácidos graxos monoenóico e polienóico foi obtida convertendo-os em ésteres fenacil, benzil, n-propil, n-butil e etil isopropil [52]. Separação por Ag-HPLC acoplado com detector de UV de cis- e transácidos octadecanóicos descritos por Momchilova e Nikolova-Damyanova [83] indicaram que a eficiência da separação aumenta na seguinte ordem: ésteres fenetil & lt fenacil & lt p-metoxifenacil. Ainda assim, a retenção e resolução desses ácidos graxos por Ag-HPLC podem ser afetadas por pequenas mudanças de diclorometano na fase móvel. Entre vários sistemas cromatográficos, a melhor resolução de cis- e trans-isômeros posicionais de ácido octadecenóico após convertê-los em ésteres de p-metoxifenacila foi obtida em uma coluna de íons de prata por eluição isocrática com uma fase móvel contendo hexano-diclorometano-acetonitrila em composição de volume de 60: 40: 0,2 (v / v / v) [120]. Fase móvel semelhante foi usada por Momchilova e Nikolova-Damyanova em 2000 para estimar as propriedades cromatográficas de isômeros posicionais de ácidos graxos octadecenóicos após convertê-los em derivados 2-naftil, 2-naftilmetil e 9-antrilmetil [83]. De acordo com os resultados obtidos neste trabalho, diclorometano-acetonitrila 100: 0,025 (v / v) como fase móvel proporcionou melhor resolução de derivados 9-antrilmetil de 6-, 9- e 11-18: 1. Alta resolução por Ag- HPLC foi obtido para os isômeros posicionais de PUFA, como ácido eicosapentaenóico, ácido docosahexaenóico e também ácido docosapentaenóico proveniente de triacilgliceróis contendo PUFA. O sistema de solvente hexano-isopropanol-acetonitrila foi adequado para a separação desses compostos [84]. O isolamento de alguns PUFA de óleos comestíveis por cromatografia em gel de sílica argentato (Ag-TLC e Ag-HPLC) foi realizado por Guil-Guerrero et al. [121]. Usando este método, os isômeros dos seguintes ácidos graxos, ácido linoléico, α-linolênico, γOs ácidos linolênico e estearidônico e os ácidos eicosapentaenóico e docosahexaenóico foram isolados na forma de ésteres metílicos de óleos de semente de linhaça, girassol e borragem e de óleo de fígado de shortfin mako. Da mesma forma, como foi descrito na parte anterior, Ag-HPLC foi útil para a análise de isômeros geométricos de ácido eicosapentaenóico e docosahexaenóico formados durante a desodorização de óleo de peixe [63]. Os resultados obtidos mostraram que esta técnica não pode ser usada para determinar os isômeros em óleo de peixe que se formaram em temperaturas superiores a 180 ° C (por exemplo, a 220 ° C), porque a interferência entre os isômeros obtidos, especialmente di-trans DHA e todos-cis EPA, foi observado. Análise eficiente de trans isômeros de ácido linoléico conjugado em produtos sintéticos e de origem animal (de porcos, carne de frango) foi obtido também por técnicas cromatográficas, incluindo Ag-HPLC [62]. A literatura recente indica que a quantificação dos isômeros geométricos de ácidos graxos separados por Ag-HPLC é realizada principalmente por GC-MS ou por GC acoplado a FID (detector de ionização de chama). FID, UV e detector refrativo são geralmente usados ​​para quantificação direta de isômeros de ácidos graxos como ésteres metílicos. Como foi relatado por Nikolova-Damyanova e Momchilova [118], ésteres aromáticos de ácidos graxos podem ser detectados por Ag-HPLC combinado com detector UV-VIS na faixa de 0–200 µg. O artigo preparado em 2013 pela Sun e colaboradores demonstra que uma cromatografia líquida / ozonólise em linha / espectrometria de massa (LC / O3-MS) é uma nova abordagem prática e fácil de usar para a determinação direta da posição da ligação dupla em lipídios apresentados em misturas complexas. Para testar este método em extratos lipídicos complexos, uma amostra de gordura bovina com quantidade conhecida de isômeros posicionais e cis/trans isômeros de ácidos graxos insaturados foram analisados. A principal vantagem da ozonólise em linha é a sua aplicabilidade em combinação com vários espectrômetros de massa sem modificação instrumental [122].

O levantamento de algumas condições de HPLC selecionadas úteis para a separação e identificação de MUFA e PUFA de várias amostras está listado na Tabela 2.


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