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7.12: Ferramentas de Engenharia Genética - Biologia

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7.12: Ferramentas de Engenharia Genética

4 principais ferramentas de engenharia genética

A criação da biblioteca genômica envolve a clonagem de todo o DNA genômico. Portanto, uma biblioteca genômica é uma coleção de moléculas de DNA recombinante (plasmídeos, fagos) de forma que a soma total de inserções de DNA nesta coleção represente todo o genoma do organismo. Dependendo do tamanho do genoma, procariótico ou eucariótico, o vetor pode ser selecionado. Desta forma, todo o genoma pode ser cortado em pedaços e clonado em vetores ou pela técnica de PCR. Isso pode ser referido como clonagem genômica.

A criação da biblioteca genômica inclui as seguintes etapas:

1. Isolamento de DNA cromossômico

2. A fragmentação do DNA é realizada por cisalhamento mecânico ou sonicação ou pelo uso de uma endonuclease adequada para digestão parcial do DNA (Fig. 15.1). O cisalhamento mecânico gera extremidades cegas, enquanto a endonuclease produz extremidades coesivas. A digestão completa é evitada, pois gera fragmentos muito heterogêneos em tamanho para serem usados.

3. Ligadura de fragmentos de DNA - A digestão parcial do DNA genômico é submetida a eletroforese em gel de agarose para separação dos fragmentos de tamanho necessário. Os fragmentos de tamanho apropriado são eluídos do gel. Esses fragmentos são então inseridos em um vetor adequado. Esses vetores são cortados com as mesmas enzimas de restrição. Depois disso, os fragmentos de DNA são ligados ao vetor usando DNA ligase (Fig. 15.2). Por esta técnica, fragmentos de DNA de cerca de 25 kb podem ser inseridos em vetores.

4. Identificação do clone desejado - Identificação da colônia bacteriana contendo o fragmento de DNA desejado, empregando uma sonda de hibridização adequada na hibridização de colônia. A sonda pode ser mRNA do gene, cDNA do seu mRNA, gene homólogo de outro organismo ou um oligonucleotídeo sintético representando a sequência de uma parte do gene / fragmento de DNA desejado. A fim de detectar a hibridização, a sonda deve ser marcada geralmente com um isótopo radiomarcado.

Sistemas vetoriais alternativos para fazer uma biblioteca genômica:

Para procariotos (genomas menores) viável para fazer bibliotecas de genes em plasmídeos. O plasmídeo insere normalmente -5-10 kb, então só precisa de alguns milhares de recombinantes para uma biblioteca representativa. Os eucariotos (genomas maiores) realmente precisam de vetores que possam conter fragmentos de DNA inseridos muito maiores (Tabela 15.1).

O bacteriófago lambda mostra uma infecção muito mais eficiente de E. coli do que a que pode ser alcançada por transformação de plasmídeo. O fago lambda se liga a receptores na superfície de E. coli e injeta DNA. A infecção por lambda é muito mais eficiente do que a transformação de plasmídeo & # 8211 pode obter

10 9 placas por micrograma de DNA, vs

10 6 colônias por micrograma de DNA de plasmídeo.

À medida que as células bacterianas lisam, forma-se uma placa, que se espalha à medida que mais células são infectadas e lisadas. A placa contém as partículas virais infecciosas ou vírions e cada um representa um clone lambda individual (semelhante a uma colônia bacteriana que representa um clone de plasmídeo individual).

A aparência é de um círculo claro em uma & # 8216nuvem & # 8217 de células bacterianas (a bactéria & # 8216lawn & # 8217) (Fig. 15.3). Se incubados por longos períodos, esses círculos continuarão a crescer (contendo cada vez mais partículas virais) e a se espalhar até que todas as células bacterianas sejam eliminadas. Para escolher um único clone lambda, a placa é & # 8216 perfurada & # 8217 da placa de ágar e armazenada em uma solução de retenção. Isso pode então ser usado para infectar mais células bacterianas e replicar mais do DNA lambda recombinante.

Vetores para fazer bibliotecas com inserções maiores:

Bibliotecas de cosmídeos são usadas para clonar genes com grandes íntrons e para sequenciar pedaços maiores do genoma. Os vetores cosmídeos são híbridos de plasmídeo e bacteriófago lambda λ DNA (um pequeno

Plasmídeo de 5 kb contendo a origem de replicação do plasmídeo (ori), um gene de resistência a antibióticos como amp e um local de restrição adequado para clonagem juntamente com a sequência COS do DNA do fago λ). Por causa da sequência COS, os cosmídeos recombinantes podem ser empacotados em partículas virais (permitindo a transformação de alta eficiência).

Como a maioria das bibliotecas genômicas no vetor cosmídeo, o DNA λ foi descartado, ele pode ser substituído pelo DNA de interesse, desde que não exceda o limite de 50 kb para empacotamento na cabeça viral. Os tamanhos dos insertos são da ordem de 35-45 kb. Uma vez que o DNA recombinante não codifica nenhuma proteína lambda, os cosmídeos não formam partículas virais (ou placas), mas, em vez disso, formam grandes plasmídeos circulares e as colônias que surgem podem ser selecionadas em placas de antibióticos, como outros transformantes de DNA de plasmídeo.

Os clones de cosmídeo podem ser manipulados de forma semelhante, permitindo facilidade de isolamento de plasmídeo. Uma vez que muitos genes eucarióticos estão na ordem de 30 e # 8211 40 kb, a probabilidade de se obter um clone de DNA contendo a sequência do gene inteira aumenta significativamente quando se usa uma biblioteca de cosmídeos.

Bibliotecas YAC são usadas para clonar fragmentos de DNA muito grandes (de mais de 1 Mb) e são úteis para clonar genes grandes (como o gene de fibrose cística de 250 kb) e para criar bibliotecas de grandes clones sobrepostos, como para cromossomos individuais isolados de organismos (bibliotecas cromossômicas). Estes têm sido usados ​​extensivamente para mapear genomas de organismos complexos (por exemplo, Homo sapiens).

YACs são cromossomos artificiais de levedura e são híbridos de DNA de plasmídeo bacteriano e DNA de levedura. Os componentes necessários para a replicação / segregação de cromossomos de levedura naturais foram combinados com DNA de plasmídeo de E. coli. Os YACs são cultivados na levedura Saccharomomyces cerevesiae e, portanto, contêm marcadores selecionáveis ​​que são adequados para o sistema hospedeiro. Em vez da seleção de antibióticos, os marcadores selecionáveis ​​de levedura permitem o crescimento do transformante em meios seletivos sem nutrientes específicos. (Não transformantes são incapazes de crescer). As cepas de levedura usadas são auxotróficas & # 8211, ou seja, não conseguem produzir um composto específico.

Por exemplo, os mutantes Trpl não podem produzir triptofano, portanto, só podem crescer em meios suplementados com triptofano. Se a cepa mutante for transformada com um YAC contendo um gene Trpl intacto, isso irá compensar o gene inativo (complemento) e a célula transfectada será capaz de crescer em meio sem triptofano.

YACs não são mais usados ​​extensivamente devido a problemas inerentes. Por exemplo, os clones YAC podem conter segmentos não contíguos do genoma. Isso significa que 2 ou mais fragmentos de DNA de partes separadas do genoma podem ser integrados em um YAC individual (porque eles são capazes de suportar inserções bastante grandes). Um segundo problema é que os YACs são instáveis ​​e freqüentemente perdem partes do DNA durante a propagação.

Bibliotecas BAC também são usadas para clonar fragmentos de DNA muito grandes e têm sido particularmente úteis para o sequenciamento de genomas grandes. BACs são cromossomos bacterianos artificiais e são baseados em um grande plasmídeo bacteriano de ocorrência natural, o fator F. Os vetores BAC podem acomodar inserções de DNA de até 300 kb, ainda bastante respeitável quando precisa clonar grandes genes ou mapear e sequenciar genomas complexos. Os BACs têm várias vantagens sobre os YACs, o que significa que agora são usados ​​mais amplamente. A maior parte do genoma humano foi sequenciado usando clones BAC em vez de YAC.

Ferramenta # 2. cDNA e cDNA Lbiblioteca:

O DNA complementar (cDNA) é DNA sintético feito de mRNA com o uso de uma enzima especial chamada transcriptase reversa (DNA polimerase dependente de RNA descoberta por Temin e Baltimore em 1970). Originalmente, essa enzima foi isolada de reterovírus. Esta enzima realiza reações semelhantes às da DNA polimerase e requer um primer com um terminal 3 e # 8242 OH livre. Com o uso de um mRNA como molde, a transcriptase reversa sintetiza uma molécula de DNA de fita simples que pode então ser usada como molde para DNA de fita dupla (Fig. 15.4). Por ser feito de mRNA, o cDNA é desprovido de sequências regulatórias a montante e a jusante e de íntrons.

Isso significa que o cDNA de eucariotos pode ser traduzido em proteínas funcionais em bactérias, uma característica importante ao expressar genes eucariotos em hospedeiros bacterianos. Uma cadeia curta de oligo (dT) é hibridizada com a cauda poli (A) da fita de mRNA. O segmento oligo (dT) serve como iniciador para a ação da transcriptase reversa, que utiliza o mRNA como molde para a síntese da fita de cDNA. O cDNA resultante termina em uma alça em gancho. Quando o mRNA, do híbrido RNA-DNA, foi degradado por tratamento com NaOH ou RNase H, um pequeno pedaço de RNA é deixado para trás. Este laço de grampo de cabelo torna-se um primer para a DNA polimerase I, que completa a fita de DNA emparelhada.

A alça é então clivada pela nuclease SI (que atua apenas na alça de fita simples) para produzir uma molécula de cDNA de fita dupla. Este DNA de cadeia dupla pode ser inserido no plasmídeo, cosmídeo, fago lambda, vetores de clonagem por ligação de extremidades cegas.

Uma biblioteca de cDNA é uma população de transforraants bacterianos ou lisados ​​de fago em que cada mRNA isolado de um organismo ou tecido é representado como sua inserção de cDNA em um plasmídeo ou vetor de fago. A frequência do cDNA específico em tal biblioteca dependeria da frequência do mRNA em questão nesse tecido.

Ferramenta # 3. Análise de genes e transcrições de genes:

A tecnologia do DNA recombinante envolve a localização do gene de interesse. Este gene pode ser isolado ou sintetizado antes de ser manipulado e usado para a transformação que leva à produção de plantas e animais transgênicos. Têm sido utilizadas diferentes técnicas para o isolamento de diferentes variedades de genes, como o gene do RNA ribossômico, o gene para características fenotípicas com produto gênico desconhecido, para produtos proteicos específicos e genes envolvidos em funções regulatórias, e. genes promotores etc.

Isolamento de genes de RNA ribossomal:

O RNA ribossômico compõe 80% do RNA total e é sintetizado no gene ribossomal que pode ser isolado. O isolamento desse gene foi fácil devido a algumas características do rRNA (a) os genes ribomsomais estão presentes em cópias múltiplas (b) diferença entre os genes ribossômicos e outros genes, devido ao seu conteúdo relativamente alto de G + C no rRNA. O gene ribossomal foi isolado pela primeira vez em 1965 por H. Wallace e M.L. Birnstiel em um anfíbio chamado Xenopus.

As diferentes etapas envolvidas no isolamento de genes de rRNA são as seguintes:

1. O rRNA é isolado dos ribossomos e são marcados radioactivamente permitindo que se replicem em meio contendo uridina tritiada.

2. O DNA ribossomal é isolado por centrifugação em gradiente de densidade (alto teor de G + C do rDNA torna mais fácil separá-lo por centrifugação do restante do DNA) seguido por sua desnaturação.

3. O DNA de fita simples é então fixado em papel de filtro e o RNA marcado é adicionado ao papel.

4. Agora ocorre a hibridização de DNA e RNA e o excesso de RNA marcado é lavado.

5. A radioatividade é medida e o híbrido duplex que na desnaturação dará DNA de fita simples que pode ser feita de fita dupla. É assim que o gene rRNA pode ser isolado.

Isolamento de Gene de Proteínas Específicas:

Isso é possível pelo uso da transcriptase reversa da enzima. Esta enzima pode fazer cópia / DNA complementar (cDNA) a partir do RNA. Portanto, é necessário que técnicas de isolamento de mRNA estejam disponíveis.

As diferentes etapas envolvidas são as seguintes:

1. O produto proteico do gene é purificado.

2. Os anticorpos são produzidos contra esses produtos proteicos por meio da imunização de animais como coelhos e camundongos.

3. É feita a precipitação de polissomos que estão envolvidos na síntese de proteínas específicas. Isso é feito com a ajuda de anticorpos produzidos.

4. O mRNA é isolado e purificado a partir das frações do polissoma. Este mRNA é usado para sintetizar cDNA.

5. Estes cDNA são então inseridos em vectores de clonagem para preparação da biblioteca de cDNA. Em seguida, é feita a análise imunológica e eletroforética dos produtos de tradução dos clones de cDNA, para identificar o clone de cDNA específico, possuindo gene para proteína específica de interesse.

6. Sondas de cDNA específicas são então selecionadas para identificação e isolamento do gene do DNA genômico por meio da triagem de uma biblioteca genômica completa ou parcial.

Isolamento de Gene de Produtos Desconhecidos (com Expressão Específica de Tecido):

É fácil isolar os produtos dos genes que são específicos do tecido. Por exemplo, os genes para proteínas de armazenamento são expressos apenas em sementes em desenvolvimento, o gene da globina é expresso em eritrócitos. Esses genes podem ser facilmente isolados porque o mRNA extraído de tal tecido será em grande parte do gene de interesse. Outro mRNA pode ser eliminado, o que pode ser identificado pelo isolamento e comparação do mRNA do tecido onde este gene não é expresso. Em seguida, este mRNA isolado é usado para a síntese de cDNA usando a transcriptase reversa da enzima. Em seguida, o processo é igual ao descrito no isolamento de genes que codificam para proteínas específicas conhecidas.

Isolamento de genes usando sondas de DNA e RNA:

Se as sondas moleculares específicas (sondas de DNA e RNA) estiverem disponíveis, elas podem ser usadas para o isolamento de genes específicos. Estas sondas podem ser obtidas a partir de outra espécie de planta ou podem ser sintetizadas artificialmente usando uma parte da sequência de aminoácidos do produto proteico do gene de interesse. As sondas obtidas de uma espécie de planta e usadas para outra espécie de planta são chamadas de sondas heterólogas.

Verificou-se que estas sondas heterólogas são eficazes na identificação de clones de genes durante a hibridização de colônias ou hibridização de placa ou em Southern blot. Por exemplo, o gene para a chalcona sintase foi isolado de Antirrhinum majus e Petunia hybrida usando uma sonda heteróloga de parsely. As sondas heterólogas são geralmente utilizadas com a biblioteca de cDNA.

Agora, com nosso conhecimento sobre a síntese de sondas de cDNA, essas sondas podem ser úteis na síntese de sondas sintéticas. Neste procedimento, a proteína purificada usando a eletroforese em gel bidimensional é usada para micro-sequenciação de 5-15 aminoácidos consecutivos, esta informação pode ser usada para a síntese de oligonucleotídeos correspondentes usando sintetizadores de DNA automatizados. Estes oligonucleótidos podem então ser utilizados directamente para rastreio de cDNA ou biblioteca genómica para isolamento do gene de interesse.

Ferramenta # 4. Hibridização de colônia:

A hibridização de colônia é a triagem de uma biblioteca com uma sonda marcada (radioativa, bioluminescente, etc.) para identificar uma sequência específica de DNA, RNA, enzima, proteína ou anticorpo (Fig. 15.5).

A hibridização tem duas características importantes:

1. As reações de hibridação são sondas específicas que se ligam apenas a locais que possuem sequências complementares.

2. As reações de hibridização ocorrem na presença de grandes quantidades de moléculas que são semelhantes, mas não idênticas ao local. Isso significa que uma sonda pode encontrar uma molécula de alvo em uma mistura de milhões de moléculas relacionadas, mas não complementares.

Essa especificidade permite encontrar uma sequência específica em uma mistura complexa cheia de sequências semelhantes. Uma técnica de hibridização também permite que os cientistas selecionem a molécula de interesse de misturas muito complexas e estudem a molécula por conta própria.

Método de hibridização de colônia:

As seguintes etapas são necessárias:

1. Isolar e cultivar as culturas em meio adequado (ágar).

2. Transfira uma amostra das colônias para uma matriz sólida, como nitrocelulose ou membrana de náilon.

3. As células da membrana são lisadas e o DNA é então desnaturado.

4. Uma sonda marcada é adicionada à matriz e ocorre a hibridização.

5. A matriz é enxaguada para remover as moléculas de sonda não hibridizadas.

6. Para sondas radioativas, usa-se a autorradiografia e a matriz é colocada no filme de raios-X.

7. O filme é observado quanto a manchas pretas que correspondem a colônias que hibridizaram com a sonda.

8. Compare o filme de raios-X com a placa mestre para ver quais colônias tiveram hibridização de sonda. Estas são as colônias que continham a sequência específica que realmente hibridizou com a sonda.

9. As colônias na placa mestre que possuem a sequência desejada podem ser subcultivadas, se desejado.

Vantagens:

1. Permite que você escolha uma molécula de interesse entre milhões.

2. Não requer o isolamento de ácidos nucléicos.

3. É possível cultivar e identificar microrganismos contendo a sequência hibridizada.

Desvantagens:

1. Demorado, leva tempo para as colônias incubarem e para a hibridização aparecer no filme de raios-X.

2. Ao identificar microorganismos, o procedimento só funcionará se os organismos crescerem e formarem uma colônia detectável.


Aqui está uma lista das ferramentas / enzimas moleculares de um engenheiro genético mais comumente usadas em experimentos de engenharia genética:

1. Reação em cadeia da polimerase (PCR)

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é o processo de replicação de várias cópias dos genes de interesse. A descoberta de DNA polimerases termoestáveis, como Taq A polimerase tornou possível manipular a replicação do DNA em laboratório. Ele amplifica as quantidades de segmentos de DNA. Os primers são usados ​​para identificar o gene de interesse e replicá-los. Essas cópias podem ser separadas e purificadas usando eletroforese em gel.

2. Enzimas de restrição (tesoura molecular)

A descoberta de enzimas conhecidas como endonucleases de restrição tem sido essencial para a engenharia de proteínas. Com base na sequência de nucleotídeos, essas enzimas cortam o DNA em locais específicos. O DNA cortado com uma enzima de restrição produz muitos fragmentos menores de tamanhos variados. Estes podem ser separados usando eletroforese em gel ou cromatografia.

3. Eletroforese em Gel

Purificar o DNA da cultura de células ou cortá-lo com enzimas de restrição não seria muito útil se não pudéssemos visualizar o DNA. A eletroforese em gel ajuda a visualizar o tamanho e o tipo de DNA extraído usando PCR e enzimas de restrição. Também é usado para detectar inserções e nocautes de DNA.

4. DNA ligase

A DNA ligase pode criar ligações covalentes entre as cadeias de nucleotídeos. Isso é feito para criar fitas recombinantes ou fechar uma fita circular que foi cortada por enzimas de restrição. As enzimas DNA polimerase I e polinucleotídeo quinase também são importantes para preencher lacunas ou fosforilar as extremidades 5 ', respectivamente.

5. Plasmídeos

Os plasmídeos são pequenos pedaços circulares de DNA que não fazem parte do genoma bacteriano, mas são capazes de auto-replicação. É usado como vetores para transportar genes entre microrganismos. Uma vez que o gene de interesse foi amplificado com PCR, o gene e o plasmídeo são cortados por enzimas de restrição e ligados entre si. A combinação resultante é conhecida como DNA recombinante. O DNA viral (bacteriófago) também pode ser usado como vetor, assim como os cosmídeos, que são plasmídeos recombinantes contendo genes de bacteriófagos.

6. Transformação / Transdução

Transformação é o processo de transferência de material genético em um vetor, como um plasmídeo, para as células hospedeiras. As células hospedeiras são expostas a uma mudança ambiental, como eletroporação, o que as torna “competentes” ou temporariamente permeáveis ​​ao vetor. Quanto maior o plasmídeo, menor a eficiência com que é absorvido pelas células.

Segmentos maiores de DNA são clonados mais facilmente usando bacteriófago, retrovírus ou outros vetores virais ou cosmídeos em um método chamado Transdução. Vetores fágicos ou virais são frequentemente usados ​​na medicina regenerativa, mas podem causar a inserção de DNA em partes de nossos cromossomos onde não queremos, causando complicações e até câncer.

7. Identificação de organismos transgênicos

Nem todas as células absorvem DNA durante a transformação. Portanto, é essencial identificar as células que passam por uma transformação e as que não. Geralmente, os plasmídeos carregam genes para resistência a antibióticos e as células transgênicas podem ser selecionadas com base na expressão desses genes e sua capacidade de crescer em meios contendo esse antibiótico. Métodos alternativos de seleção dependem da presença de outras proteínas repórter, como a x-gal /lacZ sistema, ou proteína fluorescente verde, que permite a seleção com base na cor e fluorescência, respectivamente.


Aplicações da Engenharia Genética [de volta ao topo]

Esta seção contém informações adicionais que não estão incluídas diretamente no AS Biology. No entanto, pode ser útil para ajudar a apoiar e consolidar as técnicas de GE.

Vimos agora algumas das muitas técnicas usadas pelos engenheiros genéticos. O que pode ser feito com essas técnicas? De longe, as aplicações mais numerosas ainda são ferramentas de pesquisa, e as técnicas acima estão ajudando os geneticistas a compreender sistemas genéticos complexos. Apesar de todo o exagero, a engenharia genética ainda tem muito poucas aplicações comerciais bem-sucedidas, embora aumentem a cada ano. As aplicações até agora podem ser consideradas em três grupos.

usando organismos geneticamente modificados (geralmente micróbios) para produzir produtos químicos, geralmente para aplicações médicas ou industriais.

usando tecnologia genética para alterar as características dos organismos (geralmente animais de fazenda ou plantações)

usando tecnologia genética em humanos para tratar uma doença

Produtos Genéticos [de volta ao topo]

O maior e mais bem-sucedido tipo de engenharia genética é a produção de produtos genéticos. Esses produtos são de valor médico, agrícola ou comercial. Esta tabela mostra alguns dos exemplos de produtos geneticamente modificados que já estão disponíveis.

hormônio humano usado para tratar diabetes

hormônio de crescimento humano, usado para tratar nanismo

hormônio de crescimento bovino, usado para aumentar a produção de leite de vacas

fator de coagulação do sangue humano, usado para tratar hemofílicos

agente anti-coagulação do sangue usado em cirurgia

antibiótico, usado para matar bactérias

antígeno da hepatite B, para vacinação

enzima usada para tratar fibrose cística e enfisema

enzima usada para tratar a doença de Pompe

enzima usada na fabricação de queijo

enzima usada na produção de papel

Os produtos são principalmente proteínas, que são produzidas diretamente quando um gene é expresso, mas também podem ser produtos não proteicos produzidos por enzimas geneticamente modificadas. A ideia básica é transferir um gene (geralmente humano) para outro organismo hospedeiro (geralmente um micróbio) para que ele faça o produto do gene de forma rápida, barata e ética. Também é possível fazer proteínas de design alterando as sequências de genes, mas embora seja uma ferramenta de pesquisa útil, ainda não há aplicações comerciais.

Uma vez que o produto final é apenas um produto químico, em princípio, qualquer tipo de organismo poderia ser usado para produzi-lo. De longe, o grupo mais comum de organismos hospedeiros usados ​​para fazer produtos gênicos são as bactérias, uma vez que podem crescer rapidamente e o produto pode ser purificado de suas células. Infelizmente, as bactérias nem sempre podem produzir proteínas humanas e, recentemente, animais e até plantas também foram usados ​​para fazer produtos genéticos. Em nenhum dos casos é apropriado extrair o produto de suas células, portanto, em animais, o produto deve ser secretado no leite ou na urina, enquanto nas plantas o produto deve ser secretado pela raiz. Esta tabela mostra algumas das vantagens e desvantagens do uso de diferentes organismos para a produção de produtos genéticos geneticamente modificados.

Nenhum núcleo tão fácil de modificar o DNA tem plasmídeos genéticos pequenos bem entendidos assexuados, portanto, podem ser clonados pequenos e de crescimento rápido, fáceis de crescer comercialmente em fermentadores, usarão carboidratos baratos e poucos problemas éticos.

Não é possível unir íntrons, sem modificação pós-tradução, tamanho pequeno do gene

Pode unir íntrons pode fazer modificações pós-tradução pode aceitar genes grandes

Não tem plasmídeos (exceto levedura) frequentemente diplóides, então duas cópias de genes podem precisar ser inseridas para controle de expressão não bem compreendido.

Assexuado, portanto, pode ser clonado haplóide, portanto, apenas uma cópia necessária pode ser cultivada em cubas

Nem sempre é possível fazer produtos genéticos de animais

Fotossintético, portanto, não precisa de muita alimentação, pode ser clonado a partir de uma única célula. Os produtos podem ser secretados pelas raízes ou na seiva.

As paredes celulares de difícil penetração pelo vetor de crescimento lento devem ser cultivadas em campos multicelulares

Os produtos com maior probabilidade de produzir proteínas humanas podem ser secretados no leite ou na urina

Crescimento lento multicelular

Veremos alguns exemplos em detalhes

Insulina Humana [de volta ao topo]

A insulina é um pequeno hormônio protéico produzido pelo pâncreas para regular a concentração de açúcar no sangue. Na doença diabetes insulino-dependente as células do pâncreas não produzem insulina suficiente, causando sintomas debilitantes e, eventualmente, morte. A doença pode ser tratada com sucesso pela injeção de insulina extraída do pâncreas de vacas e porcos abatidos. No entanto, a insulina dessas espécies tem uma sequência de aminoácidos ligeiramente diferente da insulina humana e isso pode levar à rejeição imunológica e efeitos colaterais.

O gene da insulina humana foi isolado, clonado e sequenciado na década de 1970, e com isso tornou-se possível inserir esse gene nas bactérias, que poderiam então produzir insulina humana em grandes quantidades. Infelizmente não era tão simples. Em humanos, as células pancreáticas primeiro produzem pró-insulina, que então sofre modificação pós-tradução para formar a insulina funcional final. As células bacterianas não podem fazer modificação pós-tradução. Eventualmente, um gene de cDNA sintético foi feito e inserido na bactéria E. coli, que produziu pró-insulina, e a conversão pós-tradução em insulina foi realizada quimicamente. Esta técnica foi desenvolvida pela Eli Lilly and Company em 1982 e o produto, humulin , tornou-se o primeiro produto geneticamente modificado aprovado para uso médico.

Na década de 1990, o procedimento foi aprimorado com o uso da levedura Saccharomyces cerevisiae ao invés de E. coli. A levedura, como um eucarioto, é capaz de modificação pós-tradução, o que simplifica a produção de insulina humana. No entanto, outra empresa desenvolveu um método de conversão de insulina de porco em insulina humana, alterando quimicamente alguns aminoácidos, e isso acaba sendo mais barato do que os métodos de engenharia genética. Tudo isso mostra que os engenheiros genéticos ainda precisam aprender muito.

Hormônio de crescimento humano (HGH) [de volta ao topo]

HGH é um hormônio protéico secretado pela glândula pituitária, que estimula o crescimento do tecido. Baixa produção de HGH na infância resulta em nanismo pituitário. Isso pode ser tratado com HGH extraído de humanos mortos, mas como o tratamento causou alguns efeitos colaterais, como a doença de Creutzfeldt-Jacod (CJD), o tratamento foi suspenso. O gene HGH foi clonado e um gene cDNA artificial foi inserido em E. coli. Foi adicionada uma sequência de sinal que não só faz com que o gene seja traduzido, mas também faz com que a proteína seja segregada pela célula, o que torna a purificação muito mais fácil. Este HGH geneticamente modificado é produzido pela Genentech e pode restaurar com sucesso a altura normal de crianças com deficiência de HGH.

Somatotrofina bovina (BST) [de volta ao topo]

Este é um hormônio de crescimento produzido pelo gado. O gene foi clonado em bactérias pela empresa Monsanto, que pode produzir grandes quantidades de BST. nos EUA, os bovinos são freqüentemente injetados com BST a cada 2 semanas, resultando em um aumento de 10% na massa em bovinos de corte e um aumento de 25% na produção de leite em vacas leiteiras. O BST foi testado no Reino Unido em 1985, mas não foi aprovado e seu uso está atualmente proibido na UE. Isso se deve em parte a preocupações públicas e em parte porque já existe uma superprodução de leite e carne bovina na UE, de modo que uma produção maior não é necessária.

Rennin [de volta ao topo]

Rennin é uma enzima usada na produção de queijo. É produzida no estômago de mamíferos juvenis (incluindo humanos) e auxilia na digestão da proteína cesina do leite, solidificando-a para que permaneça mais tempo no estômago. Tradicionalmente, a indústria do queijo usa renina obtida do estômago de bezerros jovens quando são abatidos para vitela, mas há objeções morais e práticas a essa fonte. Agora, um gene de cDNA artificial para renina foi feito a partir de mRNA extraído de células do estômago de bezerros, e esse gene foi inserido em uma variedade de micróbios, como a bactéria E. coli e o fungo Aspergillus niger. O renina extraído desses micróbios tem tido muito sucesso e 90% de todos os queijos duros no Reino Unido são feitos com renina microbiana. Às vezes (embora nem sempre) esses produtos são rotulados como queijos vegetarianos .

AAT (a -1-antitripsina) [de volta ao topo]

AAT é uma proteína humana produzida no fígado e encontrada no sangue. Como o nome sugere, é um inibidor de enzimas proteases como tripsina e elastase. Há uma mutação rara do gene AAT (uma substituição de base única) que faz com que AAT seja inativa e, portanto, as enzimas proteases sejam desinibidas. O efeito mais notável disso nos pulmões, onde elastase digere o tecido elástico dos alvéolos, levando à doença pulmonar enfisema. Essa condição pode ser tratada pela inalação de um spray aerossol contendo AAT para que atinja os alvéolos e iniba a elastase lá.

O AAT para este tratamento pode ser extraído de doações de sangue, mas apenas em quantidades muito pequenas. O gene para AAT foi encontrado e clonado, mas AAT não pode ser produzido em bactérias porque AAT é glicoproteína, o que significa que ele precisa ter açúcares adicionados por modificação pós-tradução. Esse tipo de modificação só pode ser realizado por animais, e o AAT agora é produzido por ovelhas geneticamente modificadas. Para facilitar a extração do AAT, o gene foi acoplado a um promotor da proteína b-lactoglubulina do leite. Como esse promotor só é ativado nas células da glândula mamária, o gene AAT só será expresso nas células da glândula mamária e, portanto, será secretado no leite de ovelha. Isso torna muito fácil colher e purificar sem prejudicar as ovelhas. A primeira ovelha transgênica a produzir AAT foi chamada de Tracy, e ela foi produzida pela PPL Pharmaceuticals em Edimburgo em 1993. Foi assim que Tracy s feito:

Uma ovelha fêmea recebe um medicamento de fertilidade para estimular a produção de óvulos, e vários óvulos maduros são coletados de seus ovários.

Os ovos são fertilizados em vitro.

Um plasmídeo é preparado ed contendo o gene para AAT humana e a sequência promotora para b-lactoglobulina. Centenas de cópias desse plasmídeo são microinjetadas no núcleo dos zigotos fertilizados. Apenas alguns dos zigotos serão transformados, mas neste estágio você não pode dizer quais.

Os zigotos dividem em vitro até que os embriões estejam no estágio de 16 células.

Os embriões de 16 células são implantados no útero de ovelhas mães de aluguel. Apenas algumas implantações resultam em uma gravidez bem-sucedida.

Teste todos os descendentes das mães de aluguel quanto à produção de AAT em seu leite. Essa é a única maneira de descobrir se o zigoto pegou o gene AAT para que ele possa ser expresso. Cerca de 1 em 20 ovos são bem-sucedidos.

Colete leite das ovelhas transgênicas para o resto de suas vidas. Seu leite contém cerca de 35 g de AAT por litro de leite. Também procrie com eles para formar um rebanho de ovelhas transgênicas.

Purifique o AAT, que vale cerca de 50.000 por mg.

Novos Fenótipos [de volta ao topo]

Isso significa alterar as características dos organismos por meio da engenharia genética. Os organismos são geralmente culturas ou animais de fazenda comercialmente importantes, e o objetivo é melhorar sua qualidade de alguma forma. Isso pode ser visto como uma versão de alta tecnologia do reprodução selecionada, que tem sido usado por humanos para alterar e melhorar suas colheitas e animais por pelo menos 10.000 anos. No entanto, os OGMs acabaram sendo um desenvolvimento altamente controverso. Não precisamos estudar nada disso em detalhes, mas esta tabela dá uma ideia do que está sendo feito.

O gene da proteína do revestimento do vírus foi clonado e inserido em plantas de tabaco, batata e tomate. A proteína capsidial parece “imunizar” as plantas, que são muito mais resistentes ao ataque viral.

Culturas resistentes a herbicidas

Micróbios de limpeza de ambiente

Terapia de genes [de volta ao topo]

Este é talvez o tipo mais significativo e controverso de engenharia genética. É também o menos desenvolvido. A ideia da terapia gênica é alterar geneticamente os humanos para tratar uma doença. Isso pode representar a primeira oportunidade de cura de doenças incuráveis. Observe que isso é muito diferente de usar micróbios geneticamente modificados para produzir um medicamento, vacina ou hormônio para tratar uma doença por meios convencionais. Terapia gênica significa alterar o genótipo de um tecido ou mesmo de um ser humano inteiro.

Fibrose cística [de volta ao topo]

A fibrose cística (FC) é a doença genética mais comum no Reino Unido, afetando cerca de 1 em 2500. É causada por uma mutação no gene da proteína chamada CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator). O gene está localizado no cromossomo 7 e, na verdade, existem mais de 300 mutações diferentes conhecidas, embora a mutação mais comum seja a deleção de três bases, removendo um aminoácido dos 1480 aminoácidos da proteína. CFTR é uma proteína do canal de íons cloreto encontrada na membrana celular das células do tecido epitelial (revestimento), e a mutação impede o funcionamento da proteína, de modo que os íons cloreto não podem atravessar a membrana celular.

Os íons cloreto se acumulam dentro dessas células, o que faz com que os íons sódio entrem para equilibrar a carga, e o aumento da concentração de ambos os íons dentro das células epiteliais diminui o potencial osmótico. Portanto, a água é retida dentro das células, o que significa que o muco secretado por essas células é mais seco e pegajoso do que o normal. Esse muco pegajoso bloqueia os tubos nos quais é secretado, como o intestino delgado, o ducto pancreático, o ducto biliar, o ducto espermático, os bronquíolos e os alvéolos.

Esses bloqueios levam aos sintomas de FC: falta de ar, infecções pulmonares como bronquite e pneumonia, má digestão e absorção e infertilidade. Destes sintomas, os efeitos pulmonares são os mais graves, causando 95% das mortes. A FC é sempre fatal, embora a expectativa de vida tenha aumentado de 1 ano para cerca de 20 anos devido aos tratamentos modernos. Esses tratamentos incluem fisioterapia muitas vezes ao dia para desalojar o muco dos pulmões, antibióticos para combater infecções, drogas DNAse para soltar o muco, enzimas para ajudar na digestão dos alimentos e até mesmo um transplante de coração-pulmão.

Dados esses tratamentos complicados (e, em última análise, malsucedidos), a FC é uma boa candidata à terapia genética e foi uma das primeiras doenças a ser combatida dessa forma. O gene para CFTR foi identificado em 1989 e um clone de cDNA foi feito logo depois. A ideia é entregar cópias desse bom gene às células epiteliais do pulmão, onde podem ser incorporadas ao DNA nuclear e formar canais de cloreto CFTR funcionais. Se cerca de 10% das células pudessem ser corrigidas, isso curaria a doença.

Dois métodos de administração estão sendo testados: lipossomas e adenovírus, ambos fornecidos com um inalador de aerossol, como os usados ​​por asmáticos. Os ensaios clínicos estão em andamento, mas até o momento nenhuma terapia demonstrou ser bem-sucedida.

SCID [de volta ao topo]

A Doença de Imunodeficiência Combinada Grave (SCID) é uma doença genética rara que afeta o sistema imunológico. É causada por uma mutação no gene da enzima adenosina desaminase (ADA). Sem essa enzima, os glóbulos brancos não podem ser produzidos, portanto, os pacientes quase não têm um sistema imunológico eficaz e contraem rapidamente uma infecção fatal, a menos que passem a vida em isolamento estéril (SCID também é conhecido como "síndrome do bebê em uma bolha"). A terapia genética foi tentada com algumas crianças nos EUA e no Reino Unido, removendo cirurgicamente as células da medula óssea (que fabricam células brancas do sangue no corpo) do paciente, transfectando-as com um vírus geneticamente modificado contendo o gene ADA e, em seguida, retornando as células transformadas para o paciente. A esperança é que essas células transformadas se multipliquem na medula óssea e produzam glóbulos brancos. Os testes ainda estão em andamento, então o sucesso é desconhecido.

O futuro da terapia genética [de volta ao topo]

A terapia gênica está em sua infância e ainda é uma área de pesquisa, e não de aplicação. Ninguém ainda foi curado pela terapia genética, mas o potencial continua atraente. A terapia genética não precisa nem mesmo ser limitada ao tratamento de doenças genéticas, mas também pode ajudar no tratamento de infecções e doenças ambientais:

A terapia de linha germinativa seria altamente eficaz, mas também é potencialmente perigosa (uma vez que os efeitos de longo prazo das alterações genéticas não são conhecidos), antiética (uma vez que poderia facilmente levar à eugenia) e imoral (uma vez que poderia envolver a alteração e destruição de humanos embriões). Atualmente, é ilegal no Reino Unido e na maioria dos outros países, e a pesquisa atual está se concentrando apenas na terapia com células somáticas. Todos os ensaios de terapia gênica no Reino Unido devem ser aprovados pelo Comitê Consultivo de Terapia Genética (GTAC), um órgão governamental que analisa os fundamentos médicos e éticos de um ensaio. A modificação da linha germinativa é permitida com animais e, de fato, é a base para a produção de OGM.


TECNOLOGIAS DE ENGENHARIA GENÉTICA EMERGENTES

Além das tecnologias discutidas acima, novas abordagens de engenharia genética foram desenvolvidas e estão sendo refinadas e aprimoradas. Embora ainda não tenham sido aplicados a produtos comerciais, eles têm valor prático para futuras safras GM. As tecnologias incluem edição de genoma, componentes de DNA sintético e cromossomos artificiais e modificações epigenéticas direcionadas.

Edição de Genoma

A edição do genoma usa nucleases direcionadas ao local (SSNs de nucleases específicas de sequência) para transformar sequências de DNA direcionadas em um organismo. Usando sistemas SSN, os cientistas podem excluir, adicionar ou alterar bases específicas em um local designado. Os SSNs clivam o DNA em locais específicos e deixam uma única quebra (conhecida como entalhe) ou uma quebra de fita dupla. A quebra de DNA pode ser reparada de duas maneiras (Figura 7-1):

  • Por meio do processo de junção de extremidade não homóloga nativa (NHEJ) de cell & rsquos, que leva a uma mutação no local.
  • Se uma molécula de DNA doador é fornecida ao mesmo tempo que o DNA está sendo editado pelas nucleases, através da própria célula de reparo de DNA nativo, conhecido como reparo dirigido por homologia (HDR), que incorpora a molécula doadora no local de clivagem.

Quatro classes principais de SSNs são usadas na edição do genoma da planta (revisado em Voytas e Gao, 2014): meganucleases, nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases efetoras semelhantes a ativadores de transcrição (TALENs) e as repetições palindrômicas regularmente interespaçadas agrupadas (CRISPR) / Sistema de nuclease Cas9 (Figura 7-2).O campo das tecnologias e aplicações de edição de genoma floresceu, especialmente desde o advento do sistema CRISPR / Cas9, e o comitê espera descobertas adicionais para facilitar a edição do genoma na próxima década.

As meganucleases ocorrem naturalmente em bactérias, arquéias e eucariotos e foram os primeiros SSNs examinados para edição do genoma. Meganucleases são proteínas únicas que reconhecem uma sequência no DNA de pelo menos 12 nucleotídeos de comprimento e clivam o DNA alvo, deixando uma quebra de fita dupla que pode ser reparada através de NHEJ ou HDR usando uma molécula doadora (revisado em Silva et al. , 2011). A edição do genoma mediada por meganuclease foi demonstrada em milho (Zea mays) e tabaco (Nicotiana spp.) (revisado em Baltes e Voytas, 2014). É difícil alterar a especificidade da sequência alvo das meganucleases, portanto, elas não são amplamente utilizadas para a edição do genoma.

As proteínas contendo dedo de zinco e ndashdomain ligam-se ao DNA e são amplamente difundidas na natureza, muitas vezes funcionando como fatores de transcrição (proteínas que regulam a expressão gênica ligando-se direta ou indiretamente a sequências regulatórias de DNA geralmente encontradas nas regiões promotoras dos genes 3). Os domínios de dedo de zinco podem ser manipulados para ligar sequências específicas de DNA quando fundidos ao domínio de nuclease de corte de DNA da proteína FokI, uma ZFN é a molécula híbrida resultante. Um par de funções ZFNs em conjunto

3 Exemplos de engenharia genética usando fatores de transcrição são fornecidos no Capítulo 8.

FIGURA 7-1 Consequências da clivagem de DNA por tecnologias de edição de genoma na célula.
FONTE: Sander e Joung (2014).
NOTA: Após a clivagem do DNA de fita dupla por nucleases específicas de sequência, como meganucleases, dedos de zinco, efetores semelhantes a ativadores de transcrição e repetições palindrômicas regularmente interespaçadas / Cas9 (representadas pelo raio), a quebra de fita dupla no A molécula de DNA pode ser reparada por meio de mecanismos de união de extremidade não homóloga nativa (NHEJ) da célula, o que leva a uma sequência de DNA alterada com uma deleção (linha vermelha pontilhada) ou uma inserção (linha verde sólida). Se um modelo de DNA doador for fornecido (ver fragmento de DNA azul), os mecanismos de reparo dirigido por homologia (HDR) dentro da célula irão inserir a molécula doadora no locus, e isso leva a um gene editado ou região alvo (região azul com um inserção ou modificação precisa).

para cortar o DNA no local alvo desejado (revisado em Urnov et al., 2010). Tal como acontece com as meganucleases, as ZFNs são usadas para introduzir mutações por meio de NHEJ e HDR. ZFNs têm sido usados ​​na engenharia de inúmeras espécies de plantas (revisado em Baltes e Voytas, 2014). ZFNs foram a primeira ferramenta de edição de genoma projetada amplamente usada na biologia.

Efetores semelhantes a ativadores de transcrição (TALEs) foram descobertos no patógeno de planta bacteriana Xanthomonas e pode ser projetado para se ligar a virtualmente qualquer sequência de DNA. Sua facilidade de design para sequências de DNA alvo específicas revolucionou a edição do genoma. Na natureza, Xanthomonas espécies secretam TALEs em células vegetais para permitir a patogenicidade. TALEs se ligam a promotores em genes de plantas para suprimir a resistência de plantas ao patógeno. A bactéria codifica TALEs por meio de um código ou cifra simples que foi

FIGURA 7-2 Tecnologias de edição de genoma: Meganucleases, nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases efetoras semelhantes a ativadores de transcrição (TALENs) e repetições palindrômicas regularmente interespaçadas agrupadas (CRISPR) / Cas.
FONTE: Baltes e Voytas (2014).

explorado para projetar proteínas com especificidade de site personalizado em qualquer genoma alvo (Boch et al., Moscou, 2009 e Bogdanove, 2009). Como ZFNs, TALEs podem ser fundidos com o domínio de nuclease de FokI e são então referidos como TALENs. TALENs são usados ​​em pares como ZFNs para afetar mutações direcionadas. TALENs têm sido usados ​​para editar genomas em várias plantas, incluindo arroz (Oryza spp.), milho, trigo (Triticum spp.) e soja (Glycine max) (revisado em Baltes e Voytas, 2014).

O CRISPR foi a ferramenta de edição de genoma desenvolvida mais recentemente quando o relatório do Committee & rsquos estava sendo escrito. As bactérias abrigam CRISPR como um mecanismo de defesa inato contra vírus e plasmídeos que usa nucleases guiadas por RNA para direcionar a clivagem de sequências de DNA estranhas. No momento em que o relatório do comitê & rsquos estava sendo escrito, o sistema CRISPR / Cas usado na edição do genoma era principalmente o tipo II CRISPR / Cas9, de Streptococcus pyogenes, em que sequências de DNA estranhas são incorporadas entre sequências repetidas no locus CRISPR e, em seguida, transcritas em uma molécula de RNA conhecida como crRNA (revisado por Sander e Joung, 2014). O crRNA então hibridiza com um segundo RNA, o tracrRNA, e o complexo se liga à nuclease Cas9. O crRNA guia o complexo para o DNA alvo e, no caso de imunidade inata em bactérias, liga-se à sequência complementar no DNA alvo que é então clivado pela nuclease Cas9. Os cientistas dissecaram o sistema CRISPR / Cas9 inato e o reprojetaram de tal forma que um único RNA, o RNA guia, é necessário para a clivagem mediada por Cas9 de uma sequência alvo em um genoma. Os requisitos de design do RNA guia são limitados a uma sequência única de cerca de 20 nucleotídeos no genoma (para evitar efeitos fora do alvo) e são restritos perto da sequência do motivo adjacente do protoespaçador, que é específico para o sistema CRISPR / Cas. As aplicações mais recentes do CRISPR incluem o uso de dois RNAs guia exclusivos com uma nuclease modificada que & ldquonica & rdquo uma fita do DNA, proporcionando maior especificidade para deleções direcionadas. A facilidade de design, a especificidade do RNA guia e a simplicidade do sistema CRISPR / Cas9 resultaram na rápida demonstração da utilidade deste método de edição de genomas em plantas e outros organismos (revisado em Baltes e Voytas, 2014). A edição do genoma, especialmente CRISPR, está mudando rapidamente. No momento em que o relatório do comitê & rsquos estava sendo escrito, endonucleases não Cas9 (por exemplo, Cpf1) foram recentemente descritas para edição do genoma CRISPR (Zetsche et al., 2015).

Quando o comitê estava escrevendo seu relatório, as aplicações de SSNs na edição do genoma tinham sido usadas principalmente para introduzir mutações no locus alvo através do NHEJ para produzir nocautes de genes. Conforme mostrado na Figura 7-1, nucleases também podem ser usadas para substituição de sequência via HDR (ou potencialmente NHEJ) se um DNA doador for co-introduzido na célula. Vários tipos de moléculas doadoras podem ser usados. Em primeiro lugar, um alelo alternativo do locus alvo pode ser introduzido de modo que o gene modificado codifique uma proteína que confere uma característica nova ou aprimorada. Por exemplo, a modificação de um único nucleotídeo específico no gene da acetolactato sintase (ALS) pode conferir resistência a herbicidas que usam a inibição de ALS como seu modo de ação (Jander et al., 2003). Em segundo lugar, a recombinação homóloga pode ser usada para introduzir uma nova sequência nesse locus. Esta & ldquoprecisão de inserção do genoma & rdquo pela engenharia de um local de aterrissagem eliminaria a inserção semi-aleatória de transgenes em Agrobacterium-mediado e métodos de transformação mediados por arma de gene. Também permitiria a combinação de modificados ou

genes editados em um único locus, denominado & ldquotrait landing pads & rdquo no genoma, em vez de aleatoriamente no genoma, portanto, seria mais fácil adicionar novas características a uma cultura transgênica que estão fisicamente ligadas ao genoma (Ainley et al., 2013 ) Essa estratégia também permitiria a remoção dos genes inseridos quando desejado.

A edição do genoma via CRISPR e outras técnicas pode ser realizada em plantas por meio da expressão transitória de transgenes (Clasen et al., 2016) ou sem DNA exógeno (Woo et al., 2015), resultando em plantas GM sem o transgene. Clasen et al. (2016) usaram um par TALEN geneticamente codificado para produzir mutações específicas em protoplastos de batata. As plantas de batata recuperadas dos protoplastos com alelos direcionados mutados continham uma nova característica de qualidade e sete das 18 linhagens GE não continham nenhuma construção de transgene TALEN no genoma da batata. Woo et al. (2015) usaram a proteína Cas9 in vitro & ndashtranslated acoplada para guiar o RNA para mutação de genes em Arabidopsis, tabaco, alface e protoplastos de arroz, dos quais as plantas mutantes foram recuperadas. Assim, parece que a edição do genoma pode ser realizada em plantações sem deixar qualquer pegada de DNA transgênico no genoma. Na ausência de quaisquer mutações fora do alvo, o que é evidente a partir do sequenciamento direcionado profundo no experimento da batata (Woo et al., 2015), os reagentes de edição do genoma 4 que não deixam um transgene no genoma parecem ser valiosos abordagem de melhoramento de safras.

Os exemplos acima centram-se no uso de SSNs para clivar DNA e introduzir mudanças permanentes na sequência do DNA de fita dupla por meio de NHEJ ou HDR. No entanto, existem outras aplicações pelas quais as proteínas que se ligam ao DNA de uma maneira específica de sequência podem ser exploradas para modificar genes e a atividade gênica. Eles incluem a fusão das características de ligação ao DNA de proteínas de dedo de zinco (ZFPs) ou TALEs para ativar domínios para produzir ativadores transcricionais sintéticos. Sem fusões de ativador, os ZFPs ou TALEs podem ser usados ​​como repressores transcricionais. As características de design de ZFPs e TALEs permitem a produção de fatores de transcrição sintéticos (TFs) para regular a expressão de praticamente qualquer gene alvo (Figura 7-3). Na verdade, TALE-TFs têm sido usados ​​em conjunto para produzir ativação de genes aditivos em plantas transgênicas (Liu et al., 2014). Para o sistema CRISPR / Cas9, um conjunto de moléculas pode ser fundido com uma nuclease Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) para permitir uma ampla gama de modificações de regulação gênica, conhecidas coletivamente como interferência CRISPR (revisado em Doudna e Charpentier, 2014 Figura 7- 3). Talvez a aplicação mais simples seja a fusão do dCas9 com um ativador transcricional ou um repressor transcricional, quando introduzido em uma célula com um RNA guia, o ativador transcricional ou repressor pode modificar o número de transcritos

4 Nucleases que foram personalizadas para atingir uma sequência específica são chamadas de reagentes.

do gene alvo de uma forma semelhante a ZFPs e TALEs. Os genes dCas9 poderiam ser potencialmente fundidos com genes de modificação da cromatina e guiados para uma região alvo pelo RNA guia para modificar o estado epigenético de um locus e, assim, afetar a transcrição (Doudna e Charpentier, 2014).

ACHADO: A exploração de processos biológicos inerentes e proteínas de dedo de zinco de ligação de mdashDNA (ZFNs), transcrição dirigida por patógenos de genes hospedeiros (TALEs) e degradação direcionada de sequências de DNA (CRISPR / Cas) e mdashnow permitem a manipulação precisa e versátil de DNA em plantas.

Cromossomos artificiais e sintéticos

O aumento do conhecimento dos processos biológicos e das ferramentas avançadas de biologia molecular não só facilitará a engenharia de vários genes nas plantas, mas também tornará possível a inserção de vias ou processos bioquímicos novos e completos. As construções de DNA usadas em engenharia genética de plantas são pequenas (menos de 20 & ndash40 kilobases) e usam técnicas tradicionais de clonagem molecular que são lentas e trabalhosas. No entanto, foram desenvolvidos métodos novos e baratos de sintetizar moléculas de DNA e montá-las em moléculas de DNA maiores. Os métodos permitem a construção rápida e fácil de vias multigênicas em uma única molécula de DNA (para revisão, ver Ellis et al., 2011). A viabilidade das técnicas foi demonstrada pela síntese de todo um genoma bacteriano (Gibson et al., 2010) e a criação de um cromossomo de levedura sintético (Annaluru et al., 2014). Os pesquisadores gostariam de ser capazes de introduzir dezenas a centenas de genes nas plantas. Um método previsto para realizar tais avanços seria o uso de minicromossomos artificiais ou cromossomos sintéticos. Um minicromossomo artificial é um cromossomo adicionado ao composto natural vegetal de cromossomos no núcleo. Um cromossomo sintético (Annaluru et al., 2014) é uma síntese total de DNA para substituir um cromossomo natural ou mesmo um genoma de organela inteiro, como o genoma do plastomo.

Cromossomos e genomas artificiais ou sintéticos permitiriam a montagem de um grande número de genes em uma molécula auto-replicante. Nos eucariotos, os cromossomos são moléculas lineares de DNA com as sequências adequadas para replicação (origens de replicação), integridade (telômeros) e segregação em células em divisão (centrômeros). O uso de cromossomos artificiais ou sintéticos permitiria a introdução de genes em plantas de uma maneira que não tivesse o potencial de interromper genes em cromossomos de plantas nativas nos locais de inserção.

Nenhum cromossomo ou genoma sintético foi criado nas plantas, mas os métodos usados ​​para fazer um cromossomo sintético de levedura (Annaluru et

FIGURA 7-3 Usos alternativos de tecnologias de edição de genoma.
FONTE: Ilustração fornecida por C. R. Buell.
NOTA: A, um dedo de zinco ou efetor semelhante a um ativador de transcrição (TALE) (azul) pode ser fundido a um ativador transcricional (verde) para aumentar a transcrição de um gene de interesse. B, um dedo de zinco ou TALE (azul) pode ser fundido a um repressor transcricional (vermelho) para suprimir a transcrição de um gene de interesse. C, A nuclease Cas9 cataliticamente inativa (roxo) pode ser fundida a um ativador transcricional (verde) e, na presença de um RNA guia (laranja e amarelo), guiar o complexo para o promotor de um gene de interesse e aumentar a transcrição de o gene alvo. D, A cataliticamente

FIGURA 7-3 Contínuo

nuclease Cas9 inativa (roxo) pode ser fundida a um repressor transcricional (vermelho) e, na presença de um RNA guia (laranja e amarelo), guiar o complexo para o promotor de um gene de interesse e diminuir a transcrição do gene alvo. E, A nuclease Cas9 cataliticamente inativa (roxa) pode ser fundida a uma enzima de metilação do DNA e, na presença de um RNA guia (laranja e amarelo), guiar o complexo para o promotor de um gene de interesse, direcionando esse gene para metilação e, como consequência, suprimindo a transcrição.

al., 2014) deve ser transferível para as plantas. O cromossomo III da levedura, que tem 316.617 bases, foi substituído por um cromossomo sintetizado em laboratório de 272.871 bases. O genoma do cloroplasto, que tem metade a um terço do tamanho do cromossomo III da levedura, previsivelmente poderia ser sintetizado e inserido em uma planta, como o tabaco, que já é passível de transformação do plastomo. O custo da síntese de DNA continua diminuindo, então o desenvolvimento experimental neste campo seria economicamente viável.

A pesquisa sobre minicromossomos artificiais para plantas geralmente tem duas abordagens (revisado em Gaeta et al., 2012 Birchler, 2015). Na abordagem & ldquobottom-up & rdquo, as partes principais de um cromossomo & mdashs como o centrômero, telômero, origem de replicação e genes de interesse & mdashare reunidos, e isso resulta em um minicromossomo de novo. Embora tenha havido progresso com esta abordagem, características adicionais, como modificação epigenética de nucleotídeos de DNA, podem afetar a expressão gênica (ver abaixo) e a capacidade do minicromossomo de ser replicado em uma célula e impediram que a abordagem fosse usada rotineiramente. A abordagem & ldquotop-down & rdquo essencialmente usa cromossomos existentes & mdashapproximando a abordagem do cromossomo de levedura sintética & mdash para construir um cromossomo artificial com um modelo existente. Esta abordagem resultou na transmissão do minicromossomo através da meiose, mas não tão eficientemente quanto a dos cromossomos nativos. Nenhuma das abordagens resultou em minicromossomos implantáveis ​​de forma prática. Assim, o uso de uma abordagem sintética para substituir sistematicamente o DNA, análoga à abordagem no projeto de levedura, pode ser possível no futuro (Birchler, 2015). Também pode ser possível que as abordagens atuais de baixo para cima ou de cima para baixo funcionem em culturas propagadas por clonagem, como a batata, uma vez que a meiose não é necessária (Birchler, 2015).

Com uma base de conhecimento robusta de genes subjacentes à bioquímica vegetal, construções precisas podem ser sintetizadas in vitro e introduzidas em uma espécie heteróloga por meio Agrobacterium- transformação mediada ou mediada por arma de gene ou inserção direcionada por nuclease em um único local selecionado. Por exemplo, absinto doce (Artemisia annua) produz artemisinina, um composto antimalárico. Com cinco genes de levedura e de A. annua, o tabaco foi projetado para sintetizar artemisinina (Farhi et al., 2011). Embora o rendimento de artemisinina no tabaco fosse menor do que em A. annua, este estudo de prova de conceito demonstrou a viabilidade da engenharia de vias biossintéticas heterólogas em plantas. Com maior refinamento dos promotores, melhor compreensão da compartimentação e transporte e fluxo de metabólitos em células e tecidos, e desenvolvimento de vetores como cromossomos artificiais capazes de transferir grandes segmentos de DNA para células vegetais, engenharia genética de plantas para características complexas, como heterólogos ou novas vias bioquímicas, e para fisiologia especializada

e processos de desenvolvimento, como fotossíntese C4, podem ser possíveis (ver Capítulo 8 para detalhes).

Modificações epigenéticas direcionadas

Conforme descrito anteriormente neste capítulo, mudanças relativamente estáveis ​​e hereditárias na expressão de genes específicos podem resultar de mudanças no epigenoma. Mudanças na metilação do DNA em particular têm maior probabilidade de resultar em mudanças hereditárias na expressão gênica em plantas. À medida que aumenta a compreensão da bioquímica dos sistemas que alteram os padrões de metilação do DNA, a capacidade de direcionar genes específicos para modificações epigenéticas também aumenta. Tal direcionamento envolveria a expressão de proteínas e talvez também de ácidos nucleicos específicos (por exemplo, um RNA guia) que direcionaria a metilação do DNA para um locus específico. O sistema de direcionamento pode ser removido após a modificação epigenética ser realizada - por exemplo, usando o melhoramento convencional de plantas para segregar o sistema de direcionamento.

Na questão chave da segurança, mudar as modificações epigenéticas de genes de plantas particulares não apresenta problemas fundamentais - os genomas das plantas estão repletos de modificações epigenéticas, e o DNA modificado epigeneticamente está no meio ambiente e é consumido por humanos há milhares de anos. Assim, a questão da segurança é a mesma que envolve qualquer técnica, seja a engenharia genética ou não genética, que resulte no aumento ou diminuição da expressão de genes específicos em uma planta e em alterações de características específicas.

Deve-se notar que, além de abordagens direcionadas, existem várias maneiras de alterar ampla e aleatoriamente o epigenoma de uma planta, como a superexpressão de uma enzima que altera a metilação do DNA. Claro, abordagens amplas e aleatórias para alterar o genoma de uma planta não são novas: a mutagênese é uma abordagem ampla e aleatória para a modificação do genoma. A utilidade de abordagens amplas e aleatórias para a modificação do genoma ou epigenoma é que se a bioquímica ou genética de um processo não for suficientemente compreendida para permitir uma abordagem direcionada & mdash se uma abordagem de engenharia genética ou não & ndashgenética (como criação assistida por marcador) & mdasha abordagem aleatória pode produzir um resultado desejável.Conforme discutido acima, as abordagens amplas e aleatórias resultarão em mais mudanças desconhecidas do que as abordagens direcionadas.

A consistência é normalmente uma característica desejável de novas variedades de plantas. Dado que as mudanças epigenéticas podem reverter ao estado inicial em frequências variadas, a modificação epigenética pode não ser uma abordagem ideal para produzir novas variedades de plantas. No entanto, se uma nova variedade de planta derivada de uma mudança epigenética for superior às alternativas estáveis, o potencial para algum grau de reversão pode não ser um obstáculo para a comercialização.


A senescência foliar desencadeada pela idade e induzida pelo escuro requer os fatores de transcrição bHLH PIF3, 4 e 5

A senescência foliar pode ser desencadeada e promovida por um grande número de fatores de desenvolvimento e ambientais. Numerosas linhas de evidência sugeriram um envolvimento de fitocromos na regulação da senescência foliar, mas as vias de sinalização e mecanismos fisiológicos relacionados são mal compreendidos. Neste estudo, identificamos inicialmente os fatores de interação com o fitocromo (PIFs) 3, 4 e 5 como mediadores putativos da senescência foliar. As mutações dos genes PIF resultaram em uma longevidade foliar significativamente aumentada na senescência desencadeada pela idade e induzida pelo escuro, enquanto a superexpressão desses genes acelerou a senescência desencadeada pela idade e induzida pelo escuro em Arabidopsis. De forma consistente, a perda de função de PIF4 atenuou as alterações transcricionais induzidas pelo escuro associadas à deterioração do cloroplasto e geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). Os ensaios ChIP-PCR e Dual-Luciferase demonstraram que o PIF4 pode ativar o gene regulador da degradação da clorofila NYE1 e reprimir o gene mantenedor da atividade do cloroplasto, GLK2, ligando-se às suas regiões promotoras. Finalmente, a biossíntese de etileno induzida pelo escuro e a senescência induzida por etileno foram ambas amortecidas em pif4, sugerindo o envolvimento de PIF4 na biossíntese de etileno e na via de sinalização. Nosso estudo fornece evidências de que PIF3, 4 e 5 são novos mediadores de senescência positiva e ganha uma visão sobre o mecanismo de sinalização de luz envolvido na regulação da senescência foliar.

Palavras-chave: GLK2 NYE1 / SGR1 etileno de deterioração do cloroplasto. fator de interação do fitocromo (PIF) da senescência foliar.

© The Author 2014. Publicado por Oxford University Press em nome de CSPB e IPPE, SIBS, CAS.

Bonecos

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PIF4 regula a biossíntese e a sinalização de etileno. (UMA) Expressões relativas de ACS2 ,…


4 principais aplicações da engenharia genética

Os pontos a seguir destacam as quatro principais aplicações da engenharia genética. As aplicações são: 1. Aplicação na agricultura 2. Aplicação na medicina 3. Produção de energia 4. Aplicação na indústria.

Engenharia Genética: Aplicação # 1. Aplicação na Agricultura:

Uma aplicação importante da tecnologia de DNA recombinante é alterar o genótipo das plantas cultivadas para torná-las mais produtivas, nutritivas, ricas em proteínas, resistentes a doenças e menos consumidoras de fertilizantes. A tecnologia de DNA recombinante e as técnicas de cultura de tecidos podem produzir cereais, leguminosas e vegetais de alto rendimento.

Algumas plantas foram geneticamente programadas para produzir grãos com alto teor de proteína que poderiam apresentar resistência ao calor, umidade e doenças.

Algumas plantas podem até desenvolver seus próprios fertilizantes, algumas foram geneticamente transformadas para fazer seus próprios inseticidas. Por meio da engenharia genética, foram produzidas algumas variedades que podem fixar diretamente o nitrogênio atmosférico e, portanto, não há dependência de fertilizantes.

Os cientistas desenvolveram sementes transgênicas de batata, tabaco, algodão, milho, morango, colza que são resistentes a pragas de insetos e certos herbicidas.

Bacterium, Bacillus thurenginesis produz uma proteína que é tóxica para os insetos. Usando as técnicas de engenharia genética, o gene que codifica essa proteína tóxica chamada gene Bt foi isolado da bactéria e transformado em plantas de tomate e tabaco. Essas plantas transgênicas não mostraram a necessidade de vermes do chifre do tabaco e vermes do fruto do tomate. Esses genótipos estão aguardando liberação nos EUA.

Existem certos herbicidas geneticamente evoluídos que não são específicos apenas para ervas daninhas, mas também matam colheitas úteis. O glifosato é um herbicida comumente usado que simplesmente inibe uma enzima essencial específica em ervas daninhas e outras plantas de cultivo. Um gene alvo do glifosato está presente na bactéria Salmonella typhimurium. Um mutante de S. typhimurium é resistente ao glifosato.

O gene mutante foi clonado em E. coli e então reclonado em Agrobacterium tumifaciens por meio de seu plasmídeo Ti. A infecção de plantas com plasmídeo Ti contendo o gene resistente ao glifosato deu origem a safras como algodão, milho tabaque, todas resistentes ao glifosato.

Isso possibilita pulverizar os campos de cultivo com glifosato, que mata apenas as ervas daninhas, e as safras geneticamente modificadas com genes resistentes permanecem inalteradas.

Recentemente, a Calogene, uma empresa de biotecnologia, isolou um gene bacteriano que desintoxica os efeitos colaterais dos herbicidas. Plantas transgênicas de tabaco resistentes ao vírus do mosaico T MV e tomate i resistente ao vírus do mosaico dourado foram desenvolvidas pela transferência de genes de proteínas de revestimento de vírus »plantas suscetíveis. Estes ainda não foram lançados.

A tecnologia de transferência de genes também pode desempenhar um papel significativo na produção de uma variedade nova e melhorada de árvores madeireiras.

Foram produzidas várias espécies de microorganismos que podem degradar produtos químicos tóxicos e podem ser usados ​​para matar patógenos nocivos e pragas de insetos.

Para o uso de técnicas de engenharia genética para a transferência de genes estranhos para as células da planta hospedeira, vários genes já foram clonados e bibliotecas completas de DNA e mt DNA de ervilha são agora conhecidas.

Alguns dos genes clonados incluem:

(i) Genes para faseolina de feijão francês,

(ii) Pouca hemoglobina de perna de faseolina para soja,

(iii) Genes para pequenas subunidades RUBP carboxilase de ervilha e genes i para proteínas de armazenamento em alguns cereais.

Esforços estão sendo feitos para melhorar várias safras agrícolas usando várias técnicas de engenharia genética, que incluem:

(i) Transferência de genes fixadores de nitrogênio (genes nif) de plantas leguminosas para cereais.

(ii) Transferência de resistência contra patógenos e pragas de plantas selvagens para plantas de cultivo.

(iii) Melhoria na qualidade e quantidade das proteínas das sementes.

(iv) Transferência de genes de proteínas animais para plantas de cultivo.

(v) Eliminação de genes indesejados para suscetibilidade a diferentes doenças de linhagens estéreis masculinas citoplasmáticas em safras como milho, onde a esterilidade masculina citoplasmática e a suscetibilidade estão localizadas no plasmídeo mitocondrial.

(vi) Melhoria da eficiência fotossintética pela remontagem de genes nucleares e de cloroplasto e pela possível conversão de C3 planta em C4 plantas.

(vii) Desenvolvimento de linhagens celulares que podem produzir alimentos nutritivos em biorreatores.

Engenharia Genética: Aplicativo # 2. Aplicação à Medicina:

A engenharia genética vem ganhando importância nos últimos anos e se tornará mais importante no século atual à medida que as doenças genéticas se tornem mais prevalentes e a área agrícola seja reduzida. A engenharia genética desempenha papel significativo na produção de medicamentos.

Microorganismos e substâncias vegetais estão sendo manipulados para produzir grande quantidade de drogas úteis, vacinas, enzimas e hormônios a baixo custo. A engenharia genética está preocupada com o estudo (padrão de herança de doenças no homem e coleção de genes humanos que poderiam fornecer um mapa completo para a herança de indivíduos saudáveis.

A terapia genética, pela qual genes saudáveis ​​podem ser inseridos diretamente em uma pessoa com genes defeituosos, é talvez o aspecto mais revolucionário e mais promissor da engenharia genética. O uso de terapia gênica foi aprovado em mais de 400 ensaios clínicos para doenças como enfisema de fibras císticas, distrofia muscular, deficiência de adenosina desaminase.

A terapia gênica pode algum dia ser explorada para curar doenças humanas hereditárias, como hemofilia e fibrose cística, que são causadas por genes ausentes ou defeituosos. Em um tipo de terapia genética, novos genes funcionais são inseridos por vírus geneticamente modificados nas células de pessoas que são incapazes de produzir certos hormônios ou proteínas para as funções normais do corpo.

A introdução de novos genes em um organismo por meio da tecnologia do DNA recombinante altera essencialmente a composição da proteína e, por fim, as características do corpo.

A Tecnologia de DNA recombinante também é usada na produção de vacinas contra doenças. Uma vacina contém uma forma de um organismo infeccioso que não causa doenças graves, mas faz com que o sistema imunológico do corpo forme anticorpos protetores contra o organismo infeccioso. As vacinas são preparadas isolando o antígeno ou proteína presente na superfície das partículas virais.

Quando uma pessoa é vacinada contra uma doença viral, os antígenos produzem anticorpos que atuam contra as proteínas virais e as inativam. Com a tecnologia do DNA recombinante, os cientistas foram capazes de transferir os genes de algumas proteínas da bainha viral para o vírus vaccinia, que foi usado contra a varíola.

As vacinas produzidas por clonagem de genes são livres de contaminação e seguras porque contêm apenas proteínas de revestimento contra as quais os anticorpos são feitos. Algumas vacinas estão sendo produzidas por clonagem de genes, por exemplo, vacinas contra hepatite viral influenza, vírus herpes simplex, febre aftosa induzida por vírus em animais.

Até recentemente, o hormônio insulina era extraído apenas em quantidades limitadas do pâncreas de vacas e porcos. O processo não era apenas caro, mas o hormônio às vezes causava reações alérgicas em alguns pacientes com diabetes.

A produção comercial de insulina foi iniciada em 1982 por meio de tecnologia biogenética ou de DNA recombinante e o uso médico do hormônio insulina foi aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA em 1982.

O gene da insulina humana foi clonado em grandes quantidades na bactéria E. coli, que poderia ser usado para a síntese de insulina. A insulina geneticamente modificada está disponível comercialmente como humilina.

Linfocinas são proteínas que regulam o sistema imunológico no corpo humano, α-Interferon é um dos exemplos. O interferon é usado para combater doenças virais como hepatite, herpes, resfriados comuns e também câncer. Essas drogas podem ser fabricadas em células bacterianas em grandes quantidades.

As linfocinas também podem ser úteis para pacientes com AIDS. A interleucina-II geneticamente modificada, uma substância que estimula a multiplicação de linfócitos, também está disponível e está sendo testada atualmente em pacientes com AIDS.

Um hormônio polipeptídico de quatorze aminoácidos sintetizado pelo hipotálamo foi obtido apenas em uma pequena quantidade de cadáveres humanos. A somatostatina usada como droga para certas anormalidades relacionadas ao crescimento parece ser espécie específica e o polipeptídeo obtido de outros mamíferos não tem efeito em humanos, daí sua extração do hipotálamo de cadáveres.

A técnica de engenharia genética tem ajudado na síntese química do gene que é unido ao DNA do plasmídeo pBR 322 e clonado em uma bactéria. A bactéria transformada é convertida na fábrica de síntese de somatostatina. A deficiência de ADA (adenosina desaminase) é uma doença como a imunodeficiência combinada que matou o menino bolha David em 1984.

As crianças com deficiência de ADA morrem antes dos dois anos de idade. As células da medula óssea da criança após a remoção do corpo foram invadidas por um vírus inofensivo no qual o ADA foi inserido.

A eritropoetina, um hormônio geneticamente modificado, é usado para estimular a produção de glóbulos vermelhos em pessoas que sofrem de anemia grave.

Produção de fatores de coagulação do sangue:

Normalmente, o ataque cardíaco é causado quando as artérias coronárias são bloqueadas por colesterol ou coágulo sanguíneo. O plasminogênio é uma substância encontrada nos coágulos sanguíneos. A enzima ativadora do plasminogênio tecidual (tPA) geneticamente modificada dissolve coágulos sanguíneos em pessoas que sofreram ataques cardíacos. A proteína ativadora do plasminogênio é produzida pela empresa Genetech, que é tão potente e específica que pode até interromper um ataque cardíaco em andamento.

O câncer é uma doença temida. Anticorpos clonados de uma única fonte e direcionados para um antígeno específico (anticorpos monoclonais) têm se mostrado muito úteis no tratamento do câncer. Anticorpos monoclonais têm sido alvos de elementos radioativos ou citotoxinas como a ricina da semente de mamona para torná-los mais mortais. Esses anticorpos procuram células cancerosas e as matam especificamente com sua radioatividade ou toxina.

Engenharia Genética: Aplicativo # 3. Produção de energia:

A tecnologia do DNA recombinante tem um alcance enorme na produção de energia. Por meio dessa tecnologia, agora é possível fazer a bioengenharia de safras de energia ou biocombustíveis que crescem rapidamente para produzir biomassa enorme que pode ser usada como combustível ou pode ser processada em óleos, álcoois, diesel ou outros produtos energéticos.

Os resíduos destes podem ser convertidos em metano. Os engenheiros genéticos estão tentando transferir o gene da celulase para organismos adequados, que podem ser usados ​​para converter resíduos como serragem e talos de milho, primeiro em açúcar e depois em álcool.

Engenharia Genética: Aplicação # 4. Aplicação para Indústrias:

Bactérias geneticamente projetadas são utilizadas para gerar produtos químicos industriais. Uma variedade de produtos químicos orgânicos podem ser sintetizados em grande escala com a ajuda de microorganismos geneticamente modificados. A glicose pode ser sintetizada a partir da sacarose com a ajuda de enzimas obtidas de organismos geneticamente modificados.

Hoje em dia, com a ajuda de cepas de engenharia genética de bactérias e cianobactérias, foram desenvolvidas que podem sintetizar amônia em grande escala que pode ser usada na fabricação de fertilizantes a custos muito mais baratos. Estão sendo desenvolvidos micróbios que ajudarão na conversão de celulose em açúcar e de açúcar em etanol.

A tecnologia de DNA recombinante também pode ser usada para monitorar a degradação de lixo, produtos de petróleo, naftaleno e outros resíduos industriais.

Por exemplo, a bactéria pseudomonas fluorescens geneticamente alterada pela transferência de uma enzima produtora de luz chamada luciferase encontrada na bactéria vibrio fischeri, produz luz proporcional à quantidade de sua atividade de degradação do naftaleno que fornece um meio de monitorar a eficiência do processo.

O milho e a soja são amplamente danificados pela lagarta negra. Pseudomonas fluorescens é encontrada em associação com milho e soja. Bacillus thuringiensis contém um gene patogênico para a praga. Com o passar dos anos, a praga não apenas se tornou perigosa para as lavouras, mas também desenvolveu resistência a uma série de pesticidas.

Quando o gene de B. thuringiensis (Bt) foi clonado em pseudomonas fluorescentes e inoculado no solo, descobriu-se que pseudomonas fluorescens geneticamente modificadas poderiam causar a morte de cutworms.


Uma caixa de ferramentas CRISPR-dCas para Engenharia Genética e Biologia Sintética

O controle programável da expressão gênica é essencial para a compreensão da função do gene, engenharia de comportamentos celulares e desenvolvimento de terapias. Além das aplicações de edição de genes habilitadas pela nuclease CRISPR-Cas9 e CRISPR-Cas12a, a invenção das moléculas Cas mortas com nuclease (dCas9 e dCas12a) oferece uma plataforma para o controle preciso da função do genoma sem edição de gene. Diversas ferramentas dCas foram desenvolvidas, as quais constituem uma caixa de ferramentas abrangente que permite interrogar a função do gene e a modulação dos comportamentos celulares. Esta revisão resume as aplicações atuais das ferramentas dCas para regulação da transcrição, engenharia epigenética, imagem do genoma, telas genéticas e imunoprecipitação da cromatina. Também destacamos as vantagens e os desafios existentes das ferramentas dCas atuais em engenharia genética e biologia sintética, e fornecemos perspectivas sobre direções e aplicações futuras.

Palavras-chave: Triagem genética de regulação de gene de engenharia de epigenoma CRISPRi / a dCas9.


Novas aplicações de ferramentas de biologia sintética para engenharia metabólica cianobacteriana

As cianobactérias são microrganismos promissores para biotecnologias sustentáveis, mas desbloquear seu potencial requer uma reengenharia radical e a aplicação de técnicas de biologia sintética de ponta. Nos últimos anos, os dispositivos e estratégias disponíveis para modificar cianobactérias têm aumentado, incluindo avanços no design de promotores genéticos, sítios de ligação de ribossomo, riboswitches, proteínas repórter, sistemas de vetores modulares e sistemas de seleção sem marcadores. Por causa desses novos kits de ferramentas, as cianobactérias foram projetadas com sucesso para expressar vias heterólogas para a produção de uma ampla variedade de compostos valiosos. As cepas de cianobactérias com potencial para serem usadas em aplicações do mundo real exigirão o refinamento dos circuitos genéticos usados ​​para expressar as vias heterólogas e o desenvolvimento de modelos precisos que prevejam como essas vias podem ser melhor integradas na rede metabólica celular maior. Aqui, revisamos os avanços que foram feitos para traduzir ferramentas de biologia sintética em organismos modelo cianobacterianos e resumir experimental e em sílico estratégias que têm sido empregadas para aumentar seu potencial de bioprodução. Apesar dos avanços em biologia sintética e engenharia metabólica durante os últimos anos, está claro que ainda mais melhorias são necessárias para que as cianobactérias sejam competitivas com microrganismos heterotróficos para a bioprodução de compostos de valor agregado.

Palavras-chave: O genoma de cianobactérias modela a biologia sintética da fotossíntese da engenharia metabólica.

Bonecos

Mecanismos reguladores de promotores induzíveis ...

Mecanismos reguladores de promotores induzíveis recentemente introduzidos nas cianobactérias. (UMA) Expressão do gene induzível por arabinose ...

CRISPR- cas tecnologias usadas para ...

CRISPR- cas tecnologias utilizadas para a edição do genoma de cianobactérias. (UMA) CRISPR- cas…

Representação esquemática de estratégias de engenharia ...

Representação esquemática de estratégias de engenharia que aumentam a atividade fotossintética em cianobactérias. Usando ATP ...

Desenvolvimento de GSMs cianobacterianos. Cedo…

Desenvolvimento de GSMs cianobacterianos. Os primeiros GSMs cianobacterianos foram desenvolvidos com base em dados bioquímicos ...


A evolução da engenharia genética

Estrutura de cristal dos desenhos animados da tecnologia de edição de genes TALEN. (Crédito: Gersbach Lab). Crédito: Duke University

Charles Gersbach, Professor Associado da Família Rooney de Engenharia Biomédica na Duke University, lidera um laboratório que se concentra no desenvolvimento e aplicação de ferramentas de engenharia de genoma - principalmente a tecnologia baseada em CRISPR. CRISPR-Cas é um sistema de defesa bacteriana que permite que as bactérias usem moléculas de RNA e proteínas associadas a CRISPR (Cas) para direcionar e destruir o DNA de vírus invasores. A descoberta desta técnica desencadeou uma revolução na edição do genoma à medida que os pesquisadores exploravam como a ferramenta poderia ser usada para direcionar e editar especificamente o DNA em células humanas.Nos anos desde sua descoberta, Gersbach e seu laboratório usaram essa tecnologia para estudar doenças genéticas como a distrofia muscular de Duchenne, controlar com precisão a expressão do gene e até mesmo desenvolver ferramentas que podem tornar o CRISPR mais preciso.

Como a engenharia genética passou a ser sua área de pesquisa?

Eu sabia que queria seguir uma carreira acadêmica em que pudesse ajudar no avanço da medicina regenerativa e das terapias genéticas e celulares. Eu queria trabalhar em algo que pudesse afetar muitas áreas diferentes da bioengenharia e percebi que a expressão gênica era um componente central de uma variedade de pesquisas.

Havia diferentes alas no prédio onde trabalhei na pós-graduação, cada uma voltada para a medicina regenerativa relacionada a um determinado sistema orgânico. Em diferentes partes do prédio, você pode ver pôsteres de pesquisas cardiovasculares ou musculoesqueléticas, ou de assuntos relacionados a diabetes ou trabalho neurológico. Todos esses tópicos envolviam essencialmente tentar fazer com que as células fizessem algo interessante. Como um exemplo muito simplificado, se quisermos que as células se comportem como células da cartilagem, basicamente batemos nelas usando força mecânica e esperamos que ativem os genes da cartilagem e, se quisermos que as células se comportem como neurônios, chocamos eletricamente e esperamos que põe em marcha os genes neuronais. Em todos esses casos, você está aplicando estímulos externos e esperando que internamente os genes certos sejam expressos. Se o objetivo em todas essas áreas é ativar e desativar os genes certos, eu estava curioso para saber se havia uma tecnologia melhor ou mais direta para entrar e programar a expressão gênica.

CRISPR é uma tecnologia relativamente nova. Como isso acabou sendo o foco do trabalho do seu laboratório na Duke?

O primeiro artigo que descreveu o uso de CRISPR em células humanas foi publicado em 2013, então estávamos trabalhando com tecnologias que o precederam. A primeira foram as proteínas de dedo de zinco projetadas, que poderiam ser usadas para modificar uma região específica do genoma. Na época, as pessoas usavam dedos de zinco para fazer fatores de transcrição que podiam ligar e desligar genes e regular a expressão gênica, mas a tecnologia era realmente difícil de trabalhar, então não havia decolado de verdade e havia apenas alguns laboratórios no mundo que estava trabalhando com isso. Achei que, se treinasse com um deles, o mundo seria minha ostra, então treinei em San Diego por três anos e usei essa experiência como meu argumento de venda para iniciar um laboratório na Duke em 2009.

Dois anos depois que comecei na Duke, uma nova tecnologia foi lançada, chamada TALENs, que era outra ferramenta que podia fazer proteínas para atingir sequências específicas no genoma. Era muito mais fácil de usar do que os dedos de zinco, mas antes que tivesse a chance de decolar, o CRISPR apareceu.

O CRISPR é super fácil de usar, então meu sonho antigo de ser uma das únicas pessoas no mundo que saberia fazer essas coisas saiu pela porta. Na época, eu pensava: "Ótimo, estou totalmente obsoleto há apenas quatro anos em minha carreira acadêmica". Exceto que acumulamos muita experiência e sistemas de modelo para usar essas ferramentas, e tive a sorte de ter alguns alunos e colegas realmente brilhantes e trabalhadores no laboratório, então fomos capazes de pegar rapidamente os reagentes CRISPR e usar para o nosso próprio trabalho. Em 3 de janeiro de 2013, os dois primeiros artigos usando CRISPR em células humanas foram publicados online na Science, e três semanas depois já havíamos obtido os plasmídeos e feito experimentos baseados em CRISPR em nosso próprio laboratório que funcionou. Nosso primeiro artigo CRISPR veio seis meses depois.

Por que você escolheu se concentrar no uso do CRISPR para estudar a distrofia muscular de Duchenne?

O primeiro projeto que meu laboratório iniciou em 2009 foi a edição de genes para distrofia muscular de Duchenne usando a tecnologia de dedo de zinco. A DMD é a doença genética hereditária mais comum, mas em 2009 não havia realmente nenhuma terapia ou opção disponível para ajudar as pessoas com a doença, que causa degeneração progressiva dos músculos. Eu também era um professor assistente novato, então queria fazer algo que estivesse dois passos à frente do que todo mundo estava olhando, mas tinha que ser um objetivo tangível o suficiente para que pudéssemos fazer um progresso claro e edição de genes para músculos distrofia estava de acordo com esses critérios.

Anteriormente, as pessoas procuravam maneiras de modificar as células-tronco e colocá-las de volta nos músculos, mas substituir todas as células musculares do corpo não é realmente viável. Eles também tinham vírus modificados para entregar genes aos músculos, mas o gene que sofre mutação, nesse caso, também é um dos maiores genes do genoma humano, então não se encaixa em vetores típicos de terapia gênica. Em vez disso, a ideia de consertar a cópia do gene que já está no genoma, em vez de tentar entregá-lo, parecia uma oportunidade atraente. Então, trabalhamos nessa abordagem e, na verdade, usamos dedos de zinco e TALENs até que a edição genética baseada em CRISPR foi descoberta e vimos como era fácil de usar.

Nosso trabalho com a distrofia muscular de Duchenne está em andamento. Mais recentemente, publicamos um artigo em Nature Medicine que mostrou que um único tratamento sistêmico poderia corrigir a mutação DMD por mais de um ano em camundongos.

Quais são as coisas que você não pode fazer hoje com o CRISPR e que deseja fazer?

Acho que seria útil fazer a edição de genes sem cortar o genoma. A solução para esse problema pode envolver uma nova versão do CRISPR, ou pode envolver algo totalmente diferente. Mas estamos aprendendo mais sobre esses sistemas a cada dia - dez anos atrás, demorava dois anos para fazer um projeto envolvendo edição de genes, e agora você pode fazer isso em uma ou duas semanas. Existem muitos sabores de CRISPR, onde Cas9 é a proteína mais comumente usada, mas os pesquisadores descobriram dezenas de outros tipos de Cas9s e até mesmo outras proteínas e complexos CRISPR, incluindo Cas12, Cas13, Cas14, Cas3 e até mesmo Cascade, e cada um dos esses sistemas se prestam a um uso único.

Olhando para o futuro com o CRISPR, com o que você está mais animado?

Os primeiros ensaios clínicos de CRISPR em humanos começaram este ano. Estamos vendo os primeiros testes para câncer, doença falciforme e formas raras de cegueira hereditária. E teremos os resultados desses testes nos próximos um ou dois anos, então isso é muito empolgante e definitivamente próximo ao topo da lista.

Também acho que agora estamos em um ponto em que o CRISPR foi totalmente integrado ao processo de desenvolvimento de medicamentos. Não apenas o CRISPR como terapia, mas o CRISPR para fazer sistemas modelo e linhagens celulares para ajudar a projetar medicamentos melhores. Acho que o CRISPR terá um impacto dramático na medicina de uma forma que vai além do uso do CRISPR diretamente como terapia. Na verdade, criamos uma empresa, a Element Genomics, para fazer isso facilitando o desenvolvimento de medicamentos com essas ferramentas, não necessariamente usando CRISPR como terapia. Isso é sutil, então as pessoas não necessariamente entendem que coisas como CRISPR estão trabalhando em segundo plano para tornar a pesquisa biológica mais avançada para ajudar a criar novos medicamentos.


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