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Função de ER na revisão de proteínas mutadas

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Pelo menos no caso da Fibrose Cística, acontece que uma proteína mutante (que poderia realmente funcionar!) É mantida no ER porque o ER a detecta como dobrada incorretamente. Isso acontece em todo tipo de proteína mutante?

Em caso afirmativo, devo concluir que esses distúrbios genéticos são causados ​​por causa da ausência total de uma proteína, e não por causa de uma proteína mal dobrada? Se não, por que o ER ou qualquer outra coisa na célula permitiria que algumas proteínas mutadas fizessem qualquer trabalho (como no caso da anemia falciforme, onde ocorre uma substituição de aminoácidos)?

Como os cientistas concluem que uma proteína mal dobrada poderia ter feito um trabalho bom o suficiente (como no caso da fibrose cística)?


As proteínas da membrana têm que ir para o RE, de onde são transportadas para o aparelho de Golgi. Normalmente, essas proteínas são translocadas para o ER enquanto a tradução ainda está em andamento. Existem chaperones (como a calbindina) no ER que ajudam na translocação e também catalisam as etapas iniciais de dobramento. ER também está envolvido na resposta da proteína desdobrada. A menos que a proteína seja devidamente dobrada, ela não é transportada para Golgi. No entanto, este processo é regulado em várias etapas e não acrescentarei uma explicação detalhada do mecanismo nesta resposta.

Para concluir, ER está envolvido neste caso porque a proteína considerada é uma proteína de membrana.


Retículo endoplasmático

Respostas ao estresse no retículo endoplasmático

Condições que inundam o ER com excesso de proteína ou resultam no acúmulo de proteínas mal dobradas acionam o resposta de proteína desdobrada (UPR Fig. 20.13). Essencialmente, qualquer condição em que a importação de proteína exceda a capacidade de dobramento de proteína do ER desencadeia o UPR: dobramento incorreto de proteínas mutantes, inibição da glicosilação do ER (por exemplo, pela droga tunicamicina), inibição da formação de dissulfeto (por agentes redutores), ou até mesmo a superprodução de proteínas normais. Para compensar esses eventos, essa via de sinalização induzida por estresse regula positivamente os genes que são necessários para sintetizar todo o RE, incluindo seu mecanismo de dobramento. Na levedura, o UPR ativa mais de 300 genes envolvidos com todos os aspectos da função ER, incluindo síntese de lipídios, translocação de proteínas, dobramento de proteínas, glicosilação e degradação, bem como exportação e recuperação do aparelho de Golgi. Programas de desenvolvimento em metazoários podem funcionar por meio dos mesmos controles genéticos para determinar a abundância de ER em células diferenciadas, produzindo, por exemplo, ER extenso em células secretoras, como plasma, fígado e células acinares pancreáticas.

O UPR depende de três proteínas transmembrana ER que detectam e respondem ao estresse no ER: ATF6 (ativando o fator de transcrição 6) IRE1 (inositol exigindo 1) e PERK / PEK (Retículo endoplasmático quinase semelhante a PKR / eIF2a quinase pancreática) (Fig. 20.13). Cada uma dessas proteínas tem um mecanismo diferente, mas todas iniciam vias de sinalização que regulam a produção de proteínas necessárias para a função ER. Isso permite que as células ajustem a capacidade do ER de promover o enovelamento de proteínas, dependendo da demanda. As células de metazoário possuem todas as três vias, mas a levedura possui apenas IRE1.

Em condições normais, a concentração de BiP no lúmen ER excede a concentração de proteínas não dobradas, então BiP livre está disponível para se ligar aos domínios luminais de três proteínas transmembrana ER, ATF6, IRE1 e PERK (retículo endoplasmático quinase semelhante a PKR). Essas interações com BiP retêm ATF6 no ER e evitam a dimerização de IRE1 e PERK, mantendo-os inativos.

Se as proteínas desdobradas no lúmen do ER se ligam a todos os BiP, o IRE1 está livre para se dimerizar. Isso ativa a atividade de endoribonuclease do domínio citoplasmático de IRE1, permitindo a remoção de um pequeno íntron do RNA mensageiro (mRNA) para XBP1, um fator de transcrição contendo o domínio bZIP (zíper de leucina básico) (veja a Fig. 10.14). A remoção deste íntron altera o quadro de leitura da tradução de XBP1, permitindo que o mRNA codifique um potente ativador transcricional de genes para proteínas ER.

Da mesma forma, sem BiP livre no lúmen ER, PERK dimeriza e fosforila fator de iniciação da tradução eucariótica 2 (eIF2). Isso reduz a frequência de reconhecimento do códon AUG e retarda a taxa de iniciação da tradução em muitos mRNAs. No entanto, mRNAs para muitas proteínas envolvidas na sobrevivência celular e funções ER são traduzidos preferencialmente sob essas condições.

Proteínas desdobradas acumuladas liberam BiP de ATF6, fazendo com que a proteína transmembrana ER seja transportada para o aparelho de Golgi, onde é clivada por proteases S1P e S2P para produzir um fragmento solúvel que é liberado no citoplasma. O fragmento segue para o núcleo, onde ativa a transcrição de genes-alvo, incluindo XBP1.

Aspectos da via UPR envolvendo IRE1 e PERK também são importantes para promover a diferenciação em células eucarióticas superiores. Por exemplo, IRE1 é ativado durante a diferenciação de linfócitos B em uma célula plasmática (ver Fig. 28.9), durante a qual o ER se expande cinco vezes para acomodar a síntese e secreção de imunoglobulinas. A ativação da resposta imune inata (ver Fig. 28.6), por exemplo, por tratamento com lipopolissacarídeo, também ativa IRE1. A atividade PERK também é necessária para a diferenciação e / ou sobrevivência das células B.


Retículo endoplasmático

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Retículo endoplasmático (ER), em biologia, um sistema de membrana contínua que forma uma série de sacos achatados dentro do citoplasma de células eucarióticas e tem múltiplas funções, sendo importante particularmente na síntese, dobramento, modificação e transporte de proteínas. Todas as células eucarióticas contêm um retículo endoplasmático (ER). Em células animais, o RE geralmente constitui mais da metade do conteúdo membranoso da célula. As diferenças em certas características físicas e funcionais distinguem os dois tipos de ER, conhecidos como ER rugoso e ER liso.

O que é retículo endoplasmático?

  • O retículo endoplasmático (RE) é um sistema de membrana contínua que forma uma série de sacos achatados dentro do citoplasma das células eucarióticas.
  • Todas as células eucarióticas contêm um ER.
  • Em células animais, o RE geralmente constitui mais da metade do conteúdo membranoso da célula.
  • O RE pode ser classificado em duas formas funcionalmente distintas: o retículo endoplasmático liso (SER) e o retículo endoplasmático rugoso (RER).

Qual é a diferença entre retículo endoplasmático liso e rugoso?

O RE pode ser classificado em duas formas funcionalmente distintas: retículo endoplasmático liso (SER) e retículo endoplasmático rugoso (RER). A distinção morfológica entre os dois é a presença de partículas sintetizadoras de proteínas, chamadas ribossomos, fixadas na superfície externa do RER. As funções do SER, uma rede de finas vesículas de membrana tubular, variam consideravelmente de célula para célula, sendo um papel importante a síntese de fosfolipídios e colesterol, que são os principais componentes do plasma e das membranas internas. O RER é geralmente uma série de sacos achatados conectados. Ele desempenha um papel central na síntese e exportação de proteínas e glicoproteínas e é mais bem estudado em células secretoras especializadas nessas funções. As muitas células secretoras no corpo humano incluem células do fígado que secretam proteínas do soro (por exemplo, albumina), células endócrinas que secretam hormônios peptídicos (por exemplo, insulina), células acinares pancreáticas que secretam enzimas digestivas e células da cartilagem que secretam colágeno.

Qual é a função do retículo endoplasmático?

O retículo endoplasmático (RE) desempenha funções importantes, particularmente na síntese, dobramento, modificação e transporte de proteínas. As diferenças em certas características físicas e funcionais distinguem os dois tipos de ER, conhecidos como ER rugoso (RER) e ER liso (SER). Ribossomos em RER, que dão a RER sua aparência rugosa, se especializam na síntese de proteínas que possuem uma sequência de sinal que as direciona especificamente para o ER para processamento. As proteínas sintetizadas pelo RER têm destinos finais específicos, como a membrana celular, o exterior da célula ou o próprio ER. A SER está envolvida na síntese de lipídios, incluindo colesterol e fosfolipídios, que são usados ​​na produção de novas membranas celulares. Nas células do fígado, a SER contribui para a desintoxicação de drogas e produtos químicos nocivos. O retículo sarcoplasmático é um tipo especializado de SER que regula a concentração de íons cálcio no citoplasma das células musculares estriadas.

Quando foi descoberto o retículo endoplasmático?

A ER foi observada pela primeira vez no final do século 19, quando estudos de células coradas indicaram a presença de algum tipo de estrutura citoplasmática extensa, então conhecida como gastroplasma. O microscópio eletrônico possibilitou o estudo da morfologia do RE na década de 1940, quando recebeu o nome atual.

O ER áspero tem esse nome devido à sua aparência áspera, que se deve aos ribossomos presos à sua superfície externa (citoplasmática). ER áspero fica imediatamente adjacente ao núcleo da célula, e sua membrana é contínua com a membrana externa do envelope nuclear. Os ribossomos no ER bruto se especializam na síntese de proteínas que possuem uma sequência de sinal que os direciona especificamente para o ER para processamento. (Uma série de outras proteínas em uma célula, incluindo aquelas destinadas ao núcleo e mitocôndrias, são direcionadas para a síntese em ribossomos livres, ou aqueles não ligados à membrana ER Vejo o artigo ribossomo.) As proteínas sintetizadas pelo ER bruto têm destinos finais específicos. Algumas proteínas, por exemplo, permanecem dentro do RE, enquanto outras são enviadas para o aparelho de Golgi, que fica próximo ao RE. As proteínas secretadas pelo aparelho de Golgi são direcionadas aos lisossomas ou à membrana celular, outras ainda são destinadas à secreção para o exterior da célula. As proteínas direcionadas para o transporte para o aparelho de Golgi são transferidas dos ribossomos no ER áspero para o lúmen ER áspero, que serve como o local de dobramento, modificação e montagem da proteína.

A proximidade do ER rugoso ao núcleo da célula dá ao ER um controle único sobre o processamento da proteína. O ER bruto é capaz de enviar rapidamente sinais para o núcleo quando ocorrem problemas na síntese e enovelamento de proteínas e, portanto, influencia a taxa geral de tradução da proteína. Quando proteínas mal dobradas ou não dobradas se acumulam no lúmen ER, um mecanismo de sinalização conhecido como resposta da proteína não dobrada (UPR) é ativado. A resposta é adaptativa, de modo que a ativação de UPR desencadeia reduções na síntese de proteínas e aumentos na capacidade de dobramento de proteínas ER e degradação de proteínas associadas a ER. Se a resposta adaptativa falhar, as células são direcionadas a sofrer apoptose (morte celular programada).


A análise de duas proteínas vacuolares mutadas revela uma via de degradação no retículo endoplasmático ou um compartimento relacionado de levedura

O destino de uma forma mutante de cada uma das duas enzimas vacuolares de levedura proteinase yscA (PrA) e carboxipeptidase yscY (CPY) foi investigado. Ambas as proteínas mutantes são rapidamente degradadas após entrar na via secretora. O PrA mutante é deletado em 37 aminoácidos que abrangem a região do local de processamento do pró-peptídeo PrA. A enzima mutante não mostra atividade para a maturação de si mesma ou de outras hidrolases vacuolares, uma função do PrA de tipo selvagem. CPY mutante carrega um Arg em vez de um resíduo Gly em uma região altamente conservada, duas posições distantes do sítio ativo Ser. Em contraste com o CPY de tipo selvagem, a forma mutante foi rapidamente degradada pela tripsina em vitro, indicando uma estrutura alterada. Usando anti-soros específicos para ligações de manose de cadeia externa α-1 → 6 e α-1 → 3, nenhuma modificação de carboidrato específica de Golgi pôde ser detectada em qualquer proteína mutante. Os estudos de fracionamento subcelular localizaram ambas as enzimas mutantes no retículo endoplasmático. A cinética de degradação de ambas as proteínas mostra as mesmas características, indicando vias de degradação semelhantes. O processo de degradação mostrou ser independente de um funcional s 18 produto do gene e ocorre antes que as modificações de carboidratos específicas de Golgi ocorram. O proteassoma, principal atividade proteolítica do citoplasma, não está envolvido neste evento de degradação. Todas as características de degradação das duas proteínas mutantes são consistentes com um processo de degradação dentro do retículo endoplasmático ("degradação do ER").


Interações entre RAD51 e as proteínas BRCA

Apesar da aparente dissimilaridade na sequência e estrutura da proteína, há evidências consideráveis ​​de que BRCA1 e BRCA2 têm funções biológicas comuns. BRCA1 e BRCA2 exibem padrões semelhantes de expressão e localização subcelular. Ambos são expressos em muitos tecidos de uma maneira dependente do ciclo celular (Bertwistle et al., 1997 Blackshear et al., 1998 Connor et al., 1997b Rajan et al., 1996 Sharan e Bradley, 1997), seus níveis são mais elevados durante a fase S, que é sugestiva de funções durante a replicação do DNA. Ambos estão localizados no núcleo das células somáticas, onde coexistem em focos subnucleares característicos que se redistribuem após o dano ao DNA. Em células meióticas, ambas as proteínas co-localizam aos complexos sinaptonemais de filamentos axiais em desenvolvimento (Chen et al., 1998a).

Este padrão de expressão e localização é compartilhado com RAD51, um mamífero homólogo da proteína bacteriana RecA, que é essencial em Escherichia coli para o reparo de quebras de fita dupla de DNA (DSBs) por recombinação genética (Kowalczykowski, 2000). De fato, foi relatado que BRCA1 e BRCA2 se ligam a RAD51. A interação BRCA2-RAD51 é direta, em que pode ser demonstrada in vitro com fragmentos de proteínas recombinantes (Chen et al., 1998b Wong et al., 1997) e no sistema de dois híbridos de levedura, e parece ser relativamente alto estequiometria. Foi demonstrado que um motivo C-terminal abrangendo os resíduos 3196-3232 de BRCA2 murino medeia a ligação da proteína aos primeiros 98 resíduos de RAD51 em ensaios de dois híbridos de levedura (Sharan et al., 1997). No entanto, uma região análoga de BRCA2 humano, que é 95% idêntica à sequência murina, não se liga a RAD51 (Wong et al., 1997 Aihara et al., 1999).

A interação de RAD51 com BRCA2 humano é mediada principalmente, senão exclusivamente, pelas oito repetições de BRC (Wong et al., 1997). Cada repetição, com exceção de BRC5 e BRC6, pode ligar-se individualmente a RAD51 em ensaios de dois híbridos, bem como in vitro quando expressa como uma proteína de fusão GST. Suas capacidades relativas de ligação de RAD51 variam consideravelmente (Chen et al., 1999), sendo BRC4 cerca de quatro vezes mais ativo que BRC1 em ensaios de dois híbridos. A mutagênese por PCR define um consenso de ligação de cerca de 30 resíduos presentes em BRC1 e BRC4. Curiosamente, apesar da conservação deste motivo central, diferentes resíduos parecem ser importantes em BRC1 e BRC4 para a ligação de RAD51. Isso, e a grande diferença na afinidade para RAD51, indica que o modo de interação de BRC1 ou BRC4 com RAD51 pode ser bastante distinto.

Uma região abrangendo os resíduos 758-1064 em BRCA1 foi relatada pela primeira vez como estando envolvida em sua interação com RAD51 (Scully et al., 1997). Ainda não está claro, no entanto, se as duas proteínas podem se ligar diretamente. A co-imunoprecipitação de extratos celulares revela uma interação de baixa estequiometria, que ainda não foi demonstrada em ensaios de dois híbridos em leveduras ou in vitro com proteínas recombinantes.

BRCA1 e BRCA2 co-localizam em células mitóticas e meióticas (Chen et al., 1998a) e associam-se fisicamente um com o outro através de uma região em BRCA1 (resíduos 1314-1863) distinta daquela relatada para se ligar a RAD51. Novamente, a interação pode não ser direta e parece envolver uma pequena fração (talvez 2-5%) do pool celular total de cada proteína. Além disso, esforços recentes para caracterizar o complexo proteico associado a BRCA1 por purificação bioquímica e espectroscopia de massa não relatam a presença de quantidades apreciáveis ​​de RAD51 ou BRCA2 (Wang et al., 2000).

Assim, das interações físicas relatadas entre BRCA1, BRCA2 e RAD51, a interação BRCA2-RAD51 parece ser a mais bem estabelecida. Embora as evidências existentes possam ser tentadoras, ainda não foi demonstrado com firmeza que o BRCA1 funciona junto com o BRCA2 e o RAD51 em um complexo multimolecular, e o significado funcional de suas interações relatadas ainda não foi rigorosamente definido.


Degradação associada a ER: controle de qualidade de proteína e além

A. Ruggiano e O. Foresti contribuíram igualmente para este artigo.

Annamaria Ruggiano, Ombretta Foresti, Pedro Carvalho Degradação associada ao ER: Controle de qualidade de proteínas e além. J Cell Biol 17 de março de 2014 204 (6): 869–879. doi: https://doi.org/10.1083/jcb.201312042

Mesmo com a ajuda de muitos fatores celulares, uma fração significativa das proteínas recém-sintetizadas acaba dobrada incorretamente. As células desenvolveram sistemas de controle de qualidade de proteínas para garantir que essas espécies potencialmente tóxicas sejam detectadas e eliminadas. A mais bem caracterizada dessas vias, a degradação de proteínas associadas ao ER (ERAD), monitora o dobramento da membrana e das proteínas secretoras cuja biogênese ocorre no retículo endoplasmático (ER). Há também evidências crescentes de que o ERAD controla outras funções relacionadas ao ER por meio da degradação regulada de certas proteínas ER dobradas, destacando ainda mais o papel do ERAD na homeostase celular.

Membrana recentemente sintetizada e proteínas secretadas entram no ER em um estado desdobrado por meio de um canal condutor de proteína denominado translocon (Rapoport, 2007). No ER, uma miríade de chaperones e enzimas modificadoras auxiliam na integração e dobramento da membrana. Em muitos casos, o dobramento envolve modificações pós-tradução, como glicosilação ou formação de ligação dissulfeto (Braakman e Hebert, 2013). Neste estágio, muitas proteínas também são montadas em complexos de várias subunidades com estequiometrias definidas. À medida que as proteínas recém-sintetizadas atingem uma conformação nativa, elas deixam o ER para desempenhar sua função em outro lugar ao longo da via secretora ou fora da célula.

Apesar de todos os recursos dedicados ao dobramento de proteínas, uma fração significativa de polipeptídeos recentemente sintetizados que entram no ER não consegue adquirir uma conformação nativa (Hartl e Hayer-Hartl, 2009). O grau de dobramento incorreto dessas proteínas varia consideravelmente e pode ter várias causas, como mutações, quantidades subestequiométricas de um parceiro de ligação ou simplesmente uma falta de disponibilidade de acompanhantes. Na maioria dos casos, as moléculas mal dobradas são retidas no ER e eventualmente se tornam substratos da degradação da proteína associada ao ER (ERAD), uma coleção de mecanismos de controle de qualidade que limpa o ER dessas espécies potencialmente prejudiciais. A inativação do ERAD resulta no acúmulo de proteínas mal dobradas no lúmen e na membrana do ER, uma condição conhecida como estresse do ER que é comum a várias doenças (Walter e Ron, 2011). Por esta razão, ERAD desempenha um papel fundamental na homeostase do ER em eucariotos. A ablação genética de vários componentes do ERAD leva à letalidade embrionária em camundongos, destacando também a importância desse processo na homeostase celular e do organismo (Yagishita et al., 2005 Francisco et al., 2010 Eura et al., 2012). Se esta função essencial do ERAD durante o desenvolvimento do camundongo é devido ao seu papel na degradação de proteínas mal dobradas, ainda precisa ser determinado.

Certas proteínas dobradas e perfeitamente ativas também são direcionadas pelo ERAD. No entanto, sua degradação é altamente regulada e só ocorre na presença de um sinal específico. O substrato regulado mais bem caracterizado é a 3-hidroxi-3-metilglutaril acetil-coenzima-A redutase (HMGR), uma enzima chave na biossíntese de esterol (Gil et al., 1985 Hampton et al., 1996 Bays et al., 2001a Song et al., 2005). Tanto em leveduras quanto em mamíferos, a degradação de HMGR por ERAD faz parte de um sistema de inibição por feedback crítico para a homeostase de esteróis. Curiosamente, outra enzima da via biossintética do esterol, esqualeno monooxigenase (Erg1 em leveduras e SQLE em mamíferos), foi recentemente identificada como um substrato ERAD regulado (Foresti et al., 2013). A degradação de Erg1 / SQLE por ERAD é novamente parte de um sistema de inibição por feedback para prevenir o acúmulo de metabólitos esteróis intermediários, que são tóxicos para as células (Foresti et al., 2013). Evidências recentes mostram que a regulação da síntese de esteróis e outros metabólitos derivados de esteróis por ERAD também está presente em plantas (Doblas et al., 2013 Pollier et al., 2013). Esse papel evolutivamente conservado do ERAD na regulação do esterol pode ter sido uma de suas funções primordiais.

A maquinaria ERAD também é explorada por certos vírus para degradar as proteínas do hospedeiro, escapando assim da vigilância imunológica. Exemplos bem caracterizados são a degradação do complexo principal de histocompatibilidade de classe I (MHC I) recentemente sintetizado (Wiertz et al., 1996a) ou moléculas CD4 pelo citomegalovírus humano ou o vírus da imunodeficiência (HIV Fujita et al., 1997 Schubert et al., 1997 ., 1998), respectivamente. Além disso, algumas toxinas bacterianas, como a cólera, e vírus, como o vírus símio 40 (SV40), viajam para o ER retrogradamente pela via secretora. No ER, essas toxinas e vírus exploram os componentes do ERAD para chegar ao citosol, onde, em última instância, atuarão (Tsai et al., 2001 Schelhaas et al., 2007 Bernardi et al., 2008).

Finalmente, os componentes ERAD também estão envolvidos no turnover de várias proteínas solúveis no citoplasma e no núcleo das células (Swanson et al., 2001 Ravid et al., 2006 Yamasaki et al., 2007). A maioria desses casos, entretanto, envolve apenas um subconjunto das etapas e componentes do ERAD. Em suma, embora um repertório completo de substratos não esteja disponível, está claro que as proteínas mal dobradas não são clientes exclusivos do ERAD.

ERAD, ligando o controle de qualidade ER à degradação da proteína citoplasmática

A primeira evidência de controle de qualidade de proteína no ER veio de observações de que subunidades não montadas do receptor de células T foram rapidamente degradadas nas células (Lippincott-Schwartz et al., 1988). Essa degradação ocorreu independentemente das proteases lisossomais, levando à proposta de que o próprio ER abrigaria alguma atividade proteolítica não caracterizada para proteínas mal dobradas. Em seguida, um estudo de referência em levedura mostrou que a degradação de uma proteína de membrana ER mal dobrada de vida curta foi bloqueada em células sem Ubc6, um componente da maquinaria de conjugação da ubiquitina (Sommer e Jentsch, 1993). O sistema de ubiquitina medeia a ligação covalente da ubiquitina, uma pequena proteína de 76 aminoácidos, para direcionar proteínas no citoplasma pela ação sequencial de ativação (E1), conjugação (E2) e ligase (E3) das enzimas (Pickart, 2001) . Proteínas modificadas com ubiquitina são então reconhecidas e degradadas pelo proteassoma. O envolvimento do sistema ubiquitina-proteassoma no controle de qualidade da proteína ER foi confirmado por estudos sobre a degradação do regulador de condutância transmembrana da fibrose cística mutante e de tipo selvagem (CFTR), uma grande proteína de membrana com um processo de dobramento complicado (Jensen et al., 1995 Ward et al., 1995). A inibição da função do proteassoma levou ao acúmulo de moléculas de CFTR e, curiosamente, uma fração significativa dessas foi detectada como conjugados de ubiquitina (Jensen et al., 1995 Ward et al., 1995). Logo depois, ficou claro que um mecanismo semelhante também poderia ser responsável pela degradação de proteínas luminais mal dobradas, como CPY *, uma versão mutante da carboxipeptidase Y vacuolar de levedura e um substrato de ERAD protótipo (Hiller et al., 1996). Juntos, esses artigos demonstraram que as proteínas aberrantes no lúmen e na membrana do RE são degradadas no citoplasma onde residem os componentes do sistema ubiquitina-proteassoma.

Complexos de ubiquitina ligase: os hubs em ERAD

Estudos genéticos e bioquímicos subsequentes, principalmente em leveduras em crescimento, mas também em células de mamíferos, identificaram muitos componentes ERAD e levaram a uma compreensão geral da organização da via. Uma constatação importante foi que o modelo "tamanho único" não se aplica ao ERAD e que essa via abrange vários ramos com especificidade distinta para diferentes classes de proteínas mal dobradas (Taxis et al., 2003 Vashist e Ng, 2004 Carvalho et al., 2006 Bernasconi et al., 2010 Christianson et al., 2012). No entanto, independentemente do ramo, a mesma sequência de eventos leva à degradação de todos os substratos ERAD (Fig. 1 A). A primeira etapa é o reconhecimento de um substrato no ambiente lotado de ER. Em seguida, o substrato é transportado através da bicamada lipídica ER de volta ao citoplasma, uma etapa conhecida como retrotranslocação. No lado citosólico da membrana ER, o substrato é ubiquitinado por uma ubiquitina ligase associada à membrana (ou ligase E3). Posteriormente, o substrato ubiquitinado é extraído da membrana de forma dependente de ATP e liberado no citoplasma para degradação pelo proteassoma. A execução dessas etapas é coordenada por um complexo de proteínas embutidas na membrana que leva o nome da ligase E3 em seu núcleo. As ligases E3 canônicas envolvidas no ERAD são, elas próprias, proteínas de membrana multispanning, nas quais o domínio RING (um novo gene realmente interessante) responsável pela atividade da ligase está no citoplasma. Esses complexos de ligase E3 são mais bem caracterizados em leveduras (Fig. 1 B e Tabela 1), onde Doa10 (Swanson et al., 2001) e Hrd1 (Bordallo et al., 1998 Bays et al., 2001a) se reúnem no Doa10 e no Complexos Hrd1, respectivamente, cada um responsável pela degradação de uma classe de substratos ERAD (Carvalho et al., 2006).

Com base na análise de alguns substratos modelo, a especificidade do complexo E3 ligase parece ser determinada pela localização da lesão mal dobrada em um substrato em relação à membrana ER: proteínas com domínios mal dobrados no lado citoplasmático da membrana (ERAD-C substratos) são degradados através das proteínas do complexo Doa10 com domínios luminais (substratos ERAD-L) ou intramembrana (substratos ERAD-M) dobrados incorretamente são direcionados para o complexo Hrd1 (Fig. 1 B e Tabela 1 Táxis et al., 2003 Vashist e Ng , 2004 Carvalho et al., 2006). Os fatores envolvidos no reconhecimento do substrato são exclusivos do complexo E3 ligase e provavelmente determinam a especificidade do substrato de cada ramo ERAD. Por outro lado, os componentes que atuam nas etapas tardias do ERAD, como o complexo Cdc48 ATPase (p97 em mamíferos) necessários para a extração da membrana de substratos ubiquitinados (Bays et al., 2001b Ye et al., 2001 Jarosch et al. , 2002 Rabinovich et al., 2002), são comuns a ambos os complexos de ligase E3.

Em células de mamíferos, as ligases E3 mais bem estudadas são Hrd1 e Gp78 (Tabela 1). Ambos são homólogos à levedura Hrd1, mas montam complexos de ligase E3 distintos que preferencialmente têm como alvo diferentes substratos (Schulze et al., 2005 Mueller et al., 2008 Bernasconi et al., 2010 Christianson et al., 2012 Burr et al., 2013) . Várias outras ligases E3 foram implicadas em ERAD em células de mamíferos (como Rma1 / Rnf5, Trc8, Rfp2, Rnf170 e Rnf185), mas estes ainda estão mal caracterizados. Apenas alguns substratos são conhecidos para cada ligase e uma preferência por classes específicas de substratos ERAD tem sido difícil de inferir (Claessen et al., 2012).

Como os substratos ERAD são reconhecidos?

Reconhecimento de proteínas mal dobradas.

O compromisso com a degradação por ERAD ocorre no nível de reconhecimento do substrato, portanto, esta etapa precisa ser rigidamente controlada. A detecção ineficiente de proteínas mal dobradas leva ao seu acúmulo, afetando em última análise a função celular (Travers et al., 2000 Jonikas et al., 2009). Por outro lado, ERAD hiperativo provavelmente teria seu custo, com a degradação de quantidades significativas de intermediários de dobramento. Por esse motivo, o reconhecimento de substrato por ERAD deve ser equilibrado com precisão. Esta é uma tarefa complexa considerando o ambiente ER, no qual um espectro completo de espécies de proteínas coexiste, de moléculas desdobradas recém-sintetizadas a proteínas totalmente dobradas.

Os intermediários de dobramento e as proteínas mal dobradas terminalmente compartilham semelhanças estruturais, por exemplo, a exposição de manchas hidrofóbicas que são normalmente escondidas uma vez que as proteínas adquirem a estrutura nativa. Essas moléculas são mantidas em um estado solúvel por ligação a chaperones como o ER Hsp70 (Kar2 em levedura e BiP em mamíferos), que são essenciais para o dobramento de polipeptídeos recentemente sintetizados, bem como para o descarte de proteínas mal dobradas. No entanto, os acompanhantes sozinhos não parecem determinar o destino de seus clientes. Em vez disso, os fatores de reconhecimento que fazem parte dos complexos de ligase E3 desempenham um papel importante na seleção do substrato ERAD. Por exemplo, o reconhecimento de substratos ERAD-L requer os componentes luminais do complexo Hrd1 Hrd3, Kar2 e, no caso de substratos glicosilados, a lectina Yos9 (Plemper et al., 1997, 1999 Bhamidipati et al., 2005 Kim et al., 2005 Szathmary et al., 2005 Carvalho et al., 2006 Denic et al., 2006 Gauss et al., 2006a). A levedura derlin Der1, uma proteína de membrana do complexo Hrd1, também pode estar envolvida no reconhecimento do substrato ERAD-L (Gauss et al., 2006b Stanley et al., 2011). Além disso, certos substratos ERAD-M parecem ser reconhecidos diretamente pela ligase E3 Hrd1 (Sato et al., 2009). No entanto, as características reconhecidas nas proteínas mal dobradas por esses fatores ERAD são amplamente desconhecidas.

Uma exceção informativa é o reconhecimento de glicoproteínas ligadas a N mal dobradas luminais em Saccharomyces cerevisiae (Fig. 2 A). À medida que entram no lúmen ER, as proteínas são frequentemente modificadas em resíduos de asparagina (no contexto da sequência N-X-S / T) com uma fração de glicano ramificada e bem definida composta por três glicose, nove manose e dois Nresíduos de -acetilglucosamina, Glc3 – Man9 – GlcNAc2 (Fig. 2 A Braakman e Hebert, 2013). Este glicano N-ligado é subsequentemente cortado por várias enzimas. As primeiras enzimas de processamento de glicano, como as glicosidases, levam à ligação de lectinas que facilitam o enovelamento das proteínas recém-sintetizadas. Em contraste, enzimas de ação tardia, como a manosidase Htm1, desencadeiam a ligação de uma lectina diferente que envolve a proteína em ERAD (Jakob et al., 2001 Quan et al., 2008 Clerc et al., 2009). Esta diferença na cinética das enzimas de corte de glicano fornece uma oportunidade para proteínas recém-sintetizadas adquirirem a conformação nativa e o tráfego além do ER (Fig. 2 A). Uma longa residência no ER, indicativa de problemas de dobramento, resulta no processamento das glicoproteínas mal dobradas por Htm1, que gera uma marca bioquímica (manose ligada a α1,6) decodificada pela lectina Yos9, um fator de reconhecimento de substrato ERAD (Quan et al. , 2008 Clerc et al., 2009).

Tanto o Htm1 de levedura quanto sua contraparte de mamífero EDEM estão em complexo com oxidorredutases (Pdi1 em levedura, Erdj5 em mamíferos), necessários para a estabilidade de Htm1 e também para reduzir as ligações dissulfeto em proteínas mal dobradas, o que pode afetar as etapas ERAD subsequentes (Ushioda et al. , 2008 Clerc et al., 2009). The binding of Yos9 to the α1,6-linked mannose is not sufficient to trigger the degradation of the misfolded protein. This processed glycan must be located in an unstructured polypeptide segment that is bound by Hrd3 (Xie et al., 2009). The delivery of substrates to Hrd3 might be facilitated by the luminal chaperone Kar2 that is essential for ERAD (Plemper et al., 1997 Denic et al., 2006 Xie et al., 2009). The dual recognition of a specific N-linked glycan by Yos9 and an unstructured segment by Hrd3 likely enhances the stringency of ERAD substrate recognition, perhaps by a kinetic proofreading mechanism (Fig. 2 A Denic et al., 2006).

The recognition mechanism of misfolded luminal N-linked glycoproteins is likely similar in mammalian cells because the yeast components are largely conserved in higher eukaryotes (Table 1). However, the situation might be more complicated. For example, OS-9 and XTP3-B, the mammalian homologues of Yos9, use their glycan-binding domain not only to interact with glycans in the misfolded protein but also with Sel1, the mammalian version of Hrd3, which is itself a glycoprotein (Christianson et al., 2008). Whether the interactions with Sel1 and the substrates occur sequentially or correspond to different pools of OS-9/XTP3-B is unclear. In either case, using the same domain to interact with a component and a substrate offers OS-9/XTP3-B an additional mechanism to regulate recognition of N-glycosylated ERAD substrates.

Recent work in yeast suggests that a different type of glycosylation, O-mannosylation, plays an important role in removing certain luminal proteins from futile folding cycles and thus favoring their degradation by ERAD after prolonged residency in the ER (Goder and Melero, 2011 Xu et al., 2013). The enzymes involved in protein O-mannosylation physically associate with ERAD machinery, but how O-mannosylated proteins are captured by the ERAD components is still unclear (Goder and Melero, 2011). Therefore, O-mannosylation is another appealing mechanism for generating an irreversible biochemical mark on proteins displaying folding problems.

A common feature between ERAD substrate recognition by N-glycan trimming and O-mannosylating enzymes is that both appear to be slow processes, requiring substrates to stay for relatively prolonged periods in the ER. Whether other mechanisms involved in recognition of misfolded proteins by ERAD also require a lag period in the ER is not known. Nevertheless, it is curious that newly synthesized proteins were shown to be protected from degradation for a period of time, even under conditions that favor their misfolding (Vabulas and Hartl, 2005). Therefore, recognition of misfolded proteins might have evolved as an intrinsically slow process, perhaps to spare some folding intermediates from prematurely engaging in ERAD.

Adaptor-mediated substrate recognition.

The degradation of specific folded proteins by ERAD is mediated by the same general machinery, but the recognition of these substrates involves distinct factors. A simple mechanism to target a native protein to ERAD is by a substrate-specific adaptor. For example, the human cytomegalovirus encodes ER membrane adaptor proteins, US2 and US11, which bind independently to newly synthesized MHC I molecules and deliver them to ERAD components for degradation. As a consequence, infected cells display less MHC I complex at their surface and escape detection by the immune system (Wiertz et al., 1996a). Despite this common outcome, the two viral proteins interact differently with ERAD components. US11 uses its transmembrane domain to recruit MHC I into a complex which contains Derlin-1 as well as Sel1L, the p97 ATPase complex and its membrane adaptor UBXD8 (Lilley and Ploegh, 2004 Ye et al., 2004 Mueller et al., 2008). Intriguingly, the E3 ligase required for US11-mediated MHC I degradation is not known and both Hrd1 and Gp78 E3 ligases, which are found in complex with Derlin-1, appear to be dispensable. US2, on the other hand, delivers its substrate to the ERAD ligase complex containing the E3 Trc8 and SPP, the signal peptide peptidase (Fig. 2 B Loureiro et al., 2006 Stagg et al., 2009). The precise function of SPP in ERAD is not known and it is not even clear whether it involves its proteolytic activity. Despite these differences, both US2 and US11 act as adaptors to deliver a specific ERAD substrate, MHC I heavy chain, to the E3 ligase complexes that promote its degradation.

A similar mechanism targets CD4 for degradation in cells expressing the HIV-encoded ER membrane protein Vpu. In this case, Vpu works not only as the substrate adaptor for CD4 but also as a scaffold to recruit a cytosolic E3 ligase complex, SCF βTrCP , required for CD4 ubiquitination (Fujita et al., 1997 Schubert et al., 1998). In vitro reconstitution of Vpu-mediated CD4 ubiquitination revealed that the specificity of adaptor-mediated substrate selection can be further increased at the level of substrate ubiquitination, which can be counteracted by the activity of de-ubiquitinating enzymes (Zhang et al., 2013). The balance between these activities helps discriminating small differences in adaptor–substrate affinity. Whether this mechanism aids the selection of other ERAD substrates is not known yet.

The strategy of using a substrate-specific adaptor is not exclusive to viral encoded proteins. Both in Drosófila and in mammalian cells, the derlin-related iRhom proteins function as adaptors in the ERAD-mediated degradation of EGFR ligands as they traffic through the ER (Zettl et al., 2011). Elegant genetic experiments in flies showed that this mode of regulated ERAD was important to control sleeping behavior that requires EGFR signaling (Zettl et al., 2011). It is likely that more substrate-specific adaptors will be identified as our knowledge of the mechanisms of regulated ERAD expands.

Signal-mediated substrate recognition.

A substrate-specific adaptor also functions in the regulated ERAD of HMGR, a key enzyme of the sterol biosynthetic pathway. In this case the adaptor, either Insig-1 or Insig-2, does not bind constitutively to HMGR (Song et al., 2005). Instead, the interaction only occurs in the presence of 24,25-dihydrolanosterol, an intermediate metabolite in sterol biosynthesis. Under low sterols levels HMGR is a stable protein, actively producing sterol precursors (Fig. 2 C). On the other hand, high sterol synthesis leads to a rise in 24,25-dihydrolanosterol concentration, which favors the binding of HMGR to one of the Insig proteins, its delivery to an E3 ligase complex, and consequently its degradation by the proteasome (Fig. 2 C). Whereas Gp78 and the Trc8 were originally implicated in HMGR regulated ERAD, recent data suggest that additional E3 ligases might also be involved (Song et al., 2005 Lee et al., 2010 Jo et al., 2011 Tsai et al., 2012). Degradation of HMGR by ERAD results in reduced flux through the sterol biosynthetic pathway and reestablishment of membrane lipid homeostasis.

Interestingly, Insig-1 (but not Insig-2) is itself subjected to reciprocal sterol-regulated ERAD (Lee et al., 2006). Depletion of cellular sterols stimulates Insig-1 ubiquitination by the E3 Gp78 ligase complex. Conversely, if sterol levels are high Insig-1 binds to SCAP, another key ER membrane protein required for sterol homeostasis, leading to a much longer Insig-1 half-life. These data illustrate the complex interplay between the opposing effects of sterols on the stability of the HMGR enzyme and one of its adaptors for regulated degradation by ERAD.

In yeast, sterol homeostasis also involves negative feedback of an HMGR homologue, Hmg2 (Hampton et al., 1996). Like in mammals, degradation of yeast Hmg2 is controlled by the Insig-like proteins Nsg1 and Nsg2 and requires the E3 ligase Hrd1 (Bays et al., 2001a Gardner et al., 2001 Flury et al., 2005). In fact, Hrd1 was originally identified in a genetic screen for mutants defective in HMGR degradation (HRD genes Hampton et al., 1996). The binding of Hmg2 to Nsg1 is also modulated by sterol levels (Theesfeld and Hampton, 2013). However, in contrast to mammalian cells, the binding of Nsg1 promotes Hmg2 stability, indicating that the recognition of this substrate is mechanistically different in the two systems (Flury et al., 2005 Theesfeld and Hampton, 2013). Based on limited proteolysis experiments, it has been proposed that Nsg1 and Nsg2 work as Hmg2-specific chaperones and that in their absence Hmg2 presents sufficient conformation instability to engage in ERAD as a misfolded protein (Flury et al., 2005 Shearer and Hampton, 2005). This degradation is further accelerated by high concentrations of an early sterol-intermediate metabolite, geranylgeranyl pyrophosphate (Theesfeld and Hampton, 2013). Therefore, a change in the affinity to a binding partner is another strategy to target a protein for ERAD in a signal-dependent manner.

Squalene monooxygenase (SQLE), another enzyme of the sterol biosynthetic pathway, is also targeted by regulated ERAD both in yeast and in mammals (Foresti et al., 2013). SQLE degradation requires the yeast Doa10 E3 ligase complex or its mammalian homologue Teb4, indicating that two independent branches of ERAD control distinct steps in sterol biosynthesis (Foresti et al., 2013). Although the mechanism for the recognition of SQLE by ERAD machinery is still not known, it is clear that Insigs are dispensable for this recognition, both in mammals and in yeast (Gill et al., 2011 Foresti et al., 2013). In mammals, the N-terminal domain of SQLE is necessary and sufficient for cholesterol-dependent degradation (Gill et al., 2011). Whether this domain binds directly to cholesterol or interacts with an ERAD-specific adaptor is not known. The mechanism for SQLE recognition by ERAD in yeast is likely to be different because this N-terminal domain is only conserved among certain animals.

Based on these few examples, it is clear that signal-mediated ERAD depends on the ability of cells to sense the concentration of some lipids in their membranes and on specific adaptors to selectively degrade key enzymes. Our knowledge on the mechanisms by which other classes of regulated ERAD substrates are recognized will grow as more of these are identified.

Shipping out the trash: Substrate retrotranslocation and cytoplasmic events in ERAD

After being selected, ERAD substrates are retrotranslocated across the ER membrane back into the cytoplasm. In the case of misfolded luminal proteins the complete polypeptide needs to be retrotranslocated, whereas for membrane substrates this step requires the transport of only certain domains. As a consequence, ubiquitination of luminal substrates only occurs at late stages of retrotranslocation, once a portion of the substrate has been exposed to the cytoplasm. In contrast, ubiquitination of most, but not all (Burr et al., 2013), membrane substrates is coupled to their retrotranslocation.

In analogy to the transport of newly synthesized proteins into the ER or mitochondria, it has been postulated that retrotranslocation occurs through a protein-conducting channel. However, the identity of the retrotranslocation channel has been at the center of an intense debate that is almost as old as the research in this field. Over the years, several channel candidates have been proposed but it has been difficult to gather definitive evidence in support of any of them. The Sec61 translocon used for protein import into the ER was the first proposed retrotranslocation channel (Wiertz et al., 1996b). Sec61 was found to interact with ERAD substrates both in yeast and in mammalian cells as well as with the yeast proteasome (Wiertz et al., 1996b Kalies et al., 2005 Scott and Schekman, 2008). However, the significance of these associations is not clear. Recent work showed that proteins engaging the Sec61 translocon aberrantly or persistently in their way into the ER become substrates of the Hrd1 ligase complex, which might explain the interaction between Sec61 and some ERAD substrates (Rubenstein et al., 2012). In addition, certain yeast sec61 mutants displayed defects in degrading model ERAD substrates, even under conditions in which general “forward” translocation appeared not to be dramatically affected (Pilon et al., 1997 Plemper et al., 1997 Willer et al., 2008). It remains to be determined whether this phenotype is caused by a specific impairment in retrotranslocation.

The E3 ligase complexes interact with ERAD substrates immediately before and after their retrotranslocation, indicating this step occurs in their immediate vicinity. Therefore, multispanning membrane proteins within the E3 ligase complexes have also been seen as good candidates to mediate retrotranslocation (Ye et al., 2001 Lilley and Ploegh, 2004 Kreft et al., 2006 Horn et al., 2009 Carvalho et al., 2010 Mehnert et al., 2014). These include the E3 ligases themselves as well as proteins of the Derlin family (Der1 in yeast), which are essential for the degradation of all luminal ERAD substrates but whose function has remained elusive. In vitro experiments using mammalian-derived microsomes loaded with the yeast ERAD substrate mutant pro-α-factor indicate that Derlin might be involved in retrotranslocation (Wahlman et al., 2007). In this simplified system, in which synthesis and retrotranslocation were uncoupled, the substrate cross-linked to Derlin but not to Sec61. Moreover, its retrotranslocation was blocked by anti-Derlin antibodies whereas antibodies directed to Sec61 had no effect (Wahlman et al., 2007). It should be noted that mutant pro-α-factor is a noncanonical substrate because its retrotranslocation does not require ubiquitination. Interactions between the yeast Der1 and the prototype ERAD-L substrate CPY* were also detected by site-specific photocrosslinking in yeast (Carvalho et al., 2010 Stanley et al., 2011 Mehnert et al., 2014). These cross-links were seen even in cells lacking the substrate recognition factors Hrd3 and Yos9, and were increased if conserved polar residues in the membrane domain of Der1 were mutated. An interpretation of these results is that Der1 mediates the transfer of substrates from the recognition factors Hrd3/Yos9 to the Hrd1 ligase inside the membrane (Mehnert et al., 2014).

A compelling piece of evidence for a function during substrate retrotranslocation was reported for the E3 ligase Hrd1 (Fig. 3 Carvalho et al., 2010). Although commonly working in the context of the Hrd1 complex, overexpressed Hrd1 can mediate the degradation of ERAD-L substrates even in the absence of its membrane partners Hrd3, Der1, and Usa1 (Plemper et al., 1999 Denic et al., 2006 Carvalho et al., 2010). Under these conditions Hrd1 selectivity for misfolded proteins is lost, suggesting that the other subunits of the complex are critical to control Hrd1 activity and substrate specificity (Denic et al., 2006). Hrd1 interacts with a sizeable region of a modified version of CPY* during the early stages of retrotranslocation, as assayed by site-specific photocrosslinking (Carvalho et al., 2010). Importantly, the interaction likely occurs inside of the ER bilayer because it is lost if substrate recognition is blocked or if the transmembrane segments of Hrd1 are mutated. Hrd1 contains only six transmembrane segments therefore, ERAD-L substrate retrotranslocation requires Hrd1 oligomerization, which normally is facilitated by Usa1 but can occur spontaneously upon Hrd1 overexpression (Horn et al., 2009 Carvalho et al., 2010). All these data make a strong case for a direct role of Hrd1 in the retrotranslocation of ERAD-L substrates, but the possibility that it works with some partner(s), such as Der1, Sec61, or other unknown factors cannot be excluded at this point. Moreover, it is not known whether this is a unique feature of Hrd1 or whether the membrane domains of other E3 ligases also participate in the retrotranslocation of other classes of ERAD substrates.

In most of these cross-linking experiments the retrotranslocation of CPY* was dampened by fusing it to a very tightly folded domain, indicating that ERAD-L substrates need to be unfolded before this step (Bhamidipati et al., 2005 Carvalho et al., 2010). Whether unfolding is also a prerequisite for the retrotranslocation of other classes of ERAD substrates is not settled yet (Fiebiger et al., 2002 Tirosh et al., 2003).

At the cytoplasmic side of the ER membrane, substrates are ubiquitinated, a modification that allows their recognition by the Cdc48/p97 ATPase complex composed of a homohexamer of Cdc48/p97 and by the cofactors Ufd1 and Npl4 (Bays et al., 2001b Ye et al., 2001, 2003 Jarosch et al., 2002 Rabinovich et al., 2002). The recruitment of this ATPase complex to the ER membrane is facilitated by ubiquitin regulatory X (UBX) domain–containing proteins, Ubx2 in yeast and UBXD8 in mammals (Neuber et al., 2005 Schuberth and Buchberger, 2005 Mueller et al., 2008). The ATPase activity of the Cdc48/p97 complex provides the driving force to move ubiquitinated substrates out of the membrane into the cytosol (Ye et al., 2003). Although the role of Cdc48/p97 in this process is well established, the mechanism that couples ATP hydrolysis to membrane extraction of the substrate is still not understood. In addition to the Cdc48/p97 complex, the ATPase subunits of the proteasome regulatory particle were also shown to play a role in retrotranslocation of some ERAD substrates (Lipson et al., 2008). The driving force for the retrotranslocation of the few non-ubiquitinated substrates, like the cholera toxin or pro-α-factor, is not known (Kothe et al., 2005 Moore et al., 2013).

The Cdc48/p97 complex also serves as a platform for other ubiquitin-modifying enzymes such as de-ubiquitinating enzymes (DUBs Rumpf and Jentsch, 2006 Jentsch and Rumpf, 2007 Ernst et al., 2009). Although the role of some of these Cdc48/p97-binding factors is not clear yet, it was shown that interfering with the DUBs YOD1 and ataxin-3 affected substrate retrotranslocation (Wang et al., 2006 Ernst et al., 2009). The requirement for DUB activity during retrotranslocation suggests that the process involves cycles of ubiquitination and de-ubiquitination. In some cases these cycles might be important to increase the specificity of substrate recognition, as was shown for the Vpu-mediated degradation of CD4 (Zhang et al., 2013). Interestingly, the retrotranslocation of some noncanonical substrates like cholera toxin, which are not ubiquitinated, is also affected by manipulation of both E3 ligase and DUB activities (Hassink et al., 2006 Bernardi et al., 2013). These results suggest that retrotranslocation requires the ubiquitination of some factors other than the substrates. Future studies should test some obvious candidates such as the components of the E3 ligase complexes themselves.

There is some recent evidence that the yeast Cdc48 complex might be acting also much earlier, during the initial stages of retrotranslocation of an ERAD-L substrate, before it is exposed to the cytoplasm (Fig. 3). Using a cross-linking strategy, it was shown that the interaction between Hrd1 and an early retrotranslocation intermediate was lost in mutants of the Cdc48 complex (Carvalho et al., 2010). Interestingly, a similar defect was detected in Hrd1 mutants impaired for E3 ligase activity (Carvalho et al., 2010). Based on these observations it was proposed that in early stages of ERAD-L substrate retrotranslocation, Hrd1 induces the ubiquitination of an ERAD component, perhaps Hrd1 itself. This ubiquitination signals the recruitment of the Cdc48 complex, which upon ATP hydrolysis would induce changes in the conformation or in the oligomeric status of Hrd1, resulting in substrate retrotranslocation. This model is consistent with the well-established role of Cdc48/p97 in the disassembly and remodeling of protein complexes (Jentsch and Rumpf, 2007). Once the substrate emerges on the cytosolic side and is ubiquitinated by Hrd1, the ATPase complex binds to it and promotes the final stages of its retrotranslocation. Although many aspects of this model still wait for experimental support, it would provide a unifying role for the Cdc48/p97 ATPase as the driving force for substrate retrotranslocation in ERAD (Fig. 3).

After being released from the membrane, substrates are kept soluble and transferred to the proteasome by cytosolic chaperones such as the BAG6 complex (Claessen and Ploegh, 2011 Wang et al., 2011 Xu et al., 2012) or shuttle factors like Rad23 and Dsk2 (Medicherla et al., 2004). The long journey of ERAD substrates ends with their degradation by the proteasome.

Conclusions and future perspectives

In recent years there has been tremendous progress in understanding ERAD. The identification of most of the components involved in this process and how these are pieced together and organized in the different ERAD branches were important achievements. A major challenge for the future is to reveal the mechanistic aspects of the pathway. Such developments should, for example, help in discerning the basis by which misfolded proteins are recognized in each of the different ERAD branches.

The mechanisms of substrate retrotranslocation and the roles played by the different components, such as the E3 ligases and the Cdc48/p97 complex, will certainly be another interesting area to follow. However, progress on these topics might require the development of new approaches, such as in vitro systems with purified components recapitulating individual ERAD steps.

In early days, ERAD was perceived as a process mainly dedicated to ER protein quality control. The picture now emerging places ERAD closer to other ubiquitination systems in the cytoplasm and nucleus, which control the turnover of specific proteins to achieve a certain physiological state. Therefore, another major challenge for the coming years is the detailed characterization of the roles of ERAD beyond quality control. Although the central role of ERAD in sterol homeostasis is unequivocal, it will be important to clarify whether ERAD has a more general role in the regulated degradation of folded ER proteins and in that way modulates other ER-related functions. A systematic and rigorous identification of regulated ERAD substrates should help in addressing these issues. Uncovering the intersections of ERAD with other cellular pathways will provide important insights into the mechanisms of ER and cellular homeostasis.


Resumo

Hepatitis C virus plays a significant role in the development of hepatocellular carcinoma (HCC) globally. The pathogenic mechanisms of hepatocellular carcinoma with HCV infection are generally linked with inflammation, cytokines, fibrosis, cellular signaling pathways, and liver cell proliferation modulating pathways. HCV encoded proteins (Core, NS3, NS4, NS5A) interact with a broad range of hepatocytes derived factors to modulate an array of activities such as cell signaling, DNA repair, transcription and translational regulation, cell propagation, apoptosis, membrane topology. These four viral proteins are also implicated to show a strong conversion potential in tissue culture. Furthermore, Core and NS5A also trigger the accretion of the β-catenin pathway as a common target to contribute viral induced transformation. There is a strong association between HCV variants within Core, NS4, and NS5A and host single nucleotide polymorphisms (SNPs) with the HCC pathogenesis. Identification of such viral mutants and host SNPs is very critical to determine the risk of HCC and response to antiviral therapy. In this review, we highlight the association of key variants, mutated proteins, and host SNPs in development of HCV induced HCC. How such viral mutants may modulate the interaction with cellular host machinery is also discussed.


Recursos estruturais característicos

The RHD consists of two hydrophobic regions, each 28-36 amino acids long, which are thought to be membrane-embedded regions, separated by a hydrophilic loop of 60-70 amino acids, and followed by a carboxy-terminal tail about 50 amino acids long (Figure 2a). Although much amino-acid identity has been lost over the course of evolution, the overall structure of the RHD has been preserved from plants to yeasts to humans. This suggests that three-dimensional protein structure is of greater importance than individual residues for RHD function. The RHD hydrophobic regions are unusually long for transmembrane domains: each spans approximately 30-35 amino acids, whereas most transmembrane domains are about 20 amino acids in length. This raises the interesting question of whether this longer length has significance for reticulon function. The topology of these hydrophobic regions within membranes is so far only partially defined.

The structure and membrane topology of reticulons. (uma) Structure of reticulon proteins. Numbers refer to the exons that encode the protein regions. Black ovals represent hydrophobic regions. GenBank accession numbers are as in Figure 1. (b) Possible topologies of reticulon proteins in membranes. Although eight or more conformations are possible, only those for which evidence exists are depicted. Different topologies in different cell types and different membranes may enable reticulons to carry out diverse roles in the cell.

Reticulon topology

The RHD loop region has been detected both on the surface of cells and intracellularly, and it has been suggested that the RHD hydrophobic regions might either span the ER membrane or plasma membrane completely or might double back on themselves to form a hairpin (Figure 2b). Antibodies against the amino-terminal domain of RTN4 bind to the surface of chick oligodendrocytes in live spinal cord explants [8] and cultured oligodendrocytes interact specifically with both amino-terminal domain-specific antibodies and antibodies directed against the RTN4 66-amino-acid loop (66-loop) [16]. These findings suggest that the amino terminus and the 66-loop project into extracellular space, and therefore that the first RHD hydrophobic region must double back on itself in the membrane. However, other data suggest that the amino-terminal domain is intracellular. Antibodies against the 66-loop region of RTN4 detect small amounts of this epitope on the surface of live COS-7 cells, but antibodies against c-Myc tags fused to either the amino or the carboxy terminus do not bind to live cells [8].

More recent data from non-neuronal cells in which RTN4 is overexpressed strongly support a third model, in which most of both the amino-terminal domain and the 66-loop are cytoplasmic. In COS cells treated with maleimide polyethylene glycol, cysteines in the amino-terminal domain and the loop regions of ER-associated RTN4 were found to be modified by the reagent after detergent disruption of the plasma membrane but not the ER membrane [6]. Cysteines in the carboxy-terminal region were only partially modified. All these results suggest that mammalian reticulons might have different topologies in the ER and plasma membranes such multiple conformations may enable them to carry out multiple roles in the cell. Another protein with multiple membrane topologies is the mammalian prion protein (PrP) overexpression of a certain transmembrane form of the prion protein, Ctm PrP, causes neurodegenerative disease distinct from that caused by the natural pathogenic prion form PrP Sc [19, 20]. Another possibility is that reticulons assume different topologies in different cell types: the reticulon amino-terminal region has been detected only in the cytoplasm in COS-7 cells, but has been found on both the surface and in the cytoplasm of oligodendrocytes. Again, this may reflect the diverse roles of reticulon proteins in different cell types.

Reticulon tertiary structure

The solution structure of the RHD loop of RTN4, known as Nogo66, has recently been probed by circular dichroism (CD) and nuclear magnetic resonance (NMR). Nogo66 is soluble in pure water and consists of three alpha helices, two short flanking one long, spanning residues 6-15, 21-40 and 45-53, followed by the unstructured residues 55-60 [21, 22]. The Nogo66 loop is involved in several RTN4-specific signaling cascades, including interaction with the Nogo receptor (NogoR) to inhibit neurite outgrowth [23], and with the cell adhesion molecule contactin-associated protein (Caspr) [24] to mediate the localization of potassium channels at axonal paranodes. The human RTN1 and RTN3 66-loops share 71% and 63% identity with the RTN4 loop mouse RTN1 and RTN3 identity with human RTN4 is 67% and 59%. Despite this high degree of identity, the RTN1 66-loop does not bind to NogoR, and the function of the 66-loops in RTN1 and RTN3 is unknown in both mammals and lower organisms.

As mentioned above, the amino-terminal regions of different reticulons are highly divergent in sequence. The amino-terminal domains of the human RTN4 isoforms appear to be highly unstructured, even under physiological conditions. Em sílico analysis and measurements by CD and NMR of the human isoforms RTN4A and RTN4B reveal a high degree of disorganization, with only short alpha helices and beta sheets that exist transiently [25]. Recent studies have shown that intrinsically unstructured proteins (IUPs) are more likely to form multiprotein complexes than are proteins with stable tertiary structure [26], are better able to 'moonlight' - carry out alternative functions [25] - and may fold upon binding to their partners [27]. It has been shown that up to 33% of eukaryotic proteins contain long disordered regions, compared with 2% of archeal proteins [25]. The characterization of RTN4 as an intrinsically unstructured/disordered protein may explain its involvement in many physiological processes, as explained below.


VII. Peroxisomal solute transporters

A number of metabolic pathways span peroxisomes and other subcellular compartments metabolites and cofactors must therefore move across the peroxisomal membrane, and at least some of these movements should rely on membrane transporters. To date, several peroxisomal membrane proteins have been identified to specifically transport β-oxidation substrates (i.e. fatty acids, OPDA, CA and IBA) and large cofactors (i.e. ATP, NAD + and CoA (Charton et al., 2019 )).

The Arabidopsis full-size ABC transporter PXA1/CTS/PED3 can cleave acyl-CoA and import free FAs into the peroxisomal matrix. PXA1 also interacts with long-chain acyl-CoA synthetases LACS6 and LACS7, which reactivate free FA to acyl-CoA to feed into β-oxidation (De Marcos Lousa et al., 2013 ). In addition, PXA1 transports precursors for the biosynthesis of IAA, JA, BA and the benzenoid moiety of ubiquinone (Figs 5 & 6, 5 & 6) (Block et al., 2014 Li et al., 2016). PXA1 is also important in acetate metabolism, as a loss-of-function PXA1 mutant named acn2 (acetate non-utilizing 2) is compromised in metabolizing acetate in seedlings (Hooks et al., 2007). PXA1 interacts with CGI-58, a regulator of lipid metabolism and signaling (Park et al., 2013 ). Consistent with its broad function, PXA1 knockout mutants have defects in lateral root development, seed dormancy and germination, fertilization and leaf necrosis (Li et al., 2016 ).

Besides transporters, Acyl-CoA-binding proteins (ACBPs) can also mediate lipid transfer across membranes (Xiao & Chye, 2011 ). Arabidopsis ACBPs have not been found in the peroxisome, but rice ACBP6 is peroxisomal and its overexpression partially recovers the β-oxidation defects of pxa1, suggesting that rice ACBP6 can contribute to the import of FA into peroxisomes for degradation (Meng et al., 2014). Whether this divergence in ACBP function between Arabidopsis and rice is due to different metabolic features of monocot and dicot species remains to be determined.

Arabidopsis PNC (PNC1 and PNC2) and PXN proteins are peroxisomal ATP and NAD + carriers, respectively. PNC1 and PNC2 can catalyze the counter-exchange of ATP with ADP or AMP and complement yeast mutants deficient in peroxisomal ATP import. o pnc mutants are impaired in β–oxidation, suggesting that the proteins are essential for supplying peroxisomes with ATP (Linka et al., 2008). PXN can transport many substrates em vitro, including NAD + , NADH, AMP, ADP, CoA and acetyl-CoA (Agrimi et al., 2012 Bernhardt et al., 2012 ), and contributes to optimal fatty acid degradation during seedling establishment, and photorespiration under fluctuating and high light conditions (Bernhardt et al., 2012 J. Li et al., 2019a ). However, exogenously expressed AtPXN in yeast strains can import NAD + into peroxisomes in exchange for AMP but cannot transport CoA or mediate NAD + /NADH exchange (van Roermund et al., 2016 ).

Non-selective peroxisomal membrane channels may allow the passage of small solutes, such as organic acids. Yeast Pex11 has a pore-forming function, but whether plant PEX11s also possess this function has not been reported (Mindthoff et al., 2016). Several additional peroxisomal membrane proteins, such as PMP22 (peroxisomal membrane protein of 22 kDa), CDC (Ca 2+ -dependent carrier) and SMP2 (short membrane protein 2), also have potential pore-forming activities (summarized in Pan & Hu, 2018a ).


Function of ER in reviewing mutated proteins - Biology

Cells: The Basic Unit of Life

Cell Theory: All known living things are made up of cells. All cells come from preexisting cells by division. The cell is structural and functional unit of all living things.

Cell Structural Overview: The major parts of a cell are the nucleus, cytoplasm, and cell membrane.

  • The nucleus contains a nucleolus and is separated from the cytoplasm by the nuclear envelope.
  • The nucleus contains the cell’s DNA, a type of nucleic acid.
  • The nucleolus is like a “tiny nucleus” inside the actual nucleus. It contains RNA, a type of nucleic acid.
  • The nucleus communicates through holes in the envelope called nuclear pores.
  • The nucleus decides what the cell needs and uses DNA to print out instructions for the rest of the cell to produce that need.

Chromosomes:

  • Hold the cell’s DNA in the nucleus.
  • The nucleus contains genetic information in the form of DNA (the universal genetic code).
  • The DNA does not hang around loosely in the nucleus. The DNA is packaged with proteins and wound up.
  • Recall that the role of nucleic acids is to carry genetic information, which is inherited by an organism’s offspring.
  • These wound up DNAprotein structures are called chromosomes.


Cytoplasmic Organelles: Are compartmentalized structures that perform a specialized function within a cell.

Golgi apparatus: ships packages around the cell.

  • The golgi is made up of flattened, folded sacs.
  • Packages (e.g. containing proteins) are carried to the golgi in vesicles.
  • The golgi receives an incoming vesicle, tags the package, and sends the vesicle to its final destination.
  • Lysosomes contain an environment made to destroy waste.
  • Vesicles carry the waste (bacteria, old organelles, etc.) into the lysosome.
    Once inside, the waste is destroyed and its parts recycled.
  • Smooth ER is NOT attached to the nucleus and DOES NOT have attached ribosomes (thus smooth).
  • Smooth ER synthesizes carbohydrates (sugars) and lipids (fats).

Mitochondria: produce energy to power the cell.

  • The mitochondria convert carbohydrates (sugar) taken from food into ATP.
  • The mitochondria are unique in that it has two protective shells.
  • The ribosome reads the DNA strand instructions to make proteins for the cell to use in its normal activities.
  • The units clasp around a strand of nucleic acid instructions from the nucleus.
    Each ribosome is made of two protein subunits.

Rough endoplasmic reticulum: The two types of ER make different building blocks for the cell.

  • Rough ER is found attached to the outside of the nucleus. It appears rough because of the ribosomes on its surface.
  • Rough ER helps the attached ribosomes in finishing protein synthesis.
  • Plasma Membrane, the cell’s membrane is made of phospholipids, which have carbohydrate heads and lipid tails.
  • Embedded proteins are anchored to the cell membrane.
  • Exterior of the plasma membrane touches water polar heads touch water on the inside of the cell and water on the outside of the cell.
  • Interior Blocks Passage However, water and other molecules cannot pass through to either side because of the nonpolar tails.
  • Provides a stabilized environment, which protects and maintains the cell’s internal environment, separate from the environment outside.
  • Proteins embedded into the membrane send and receive signals to communicate with other cells.

Three types of passive transport are osmosis, diffusion, and facilitated diffusion. Osmosis is the natural movement of water from a high concentration of water to a lower concentration of water. Diffusion is the natural movement of molecules from a higher concentration to a lower concentration. Facilitated Diffusion is the natural movement of molecules from a higher concentration to a lower concentration with the help of a transporter protein embedded on the cell membrane.

Active transport requires energy to occur. Active transport is “forced” movement of molecules from a lower concentration to a higher concentration. The most common type of active transport is a pump. Pumps are proteins embedded in the cell membrane, which use ATP energy to work.

Different Cell Types: Prokaryote and Eukaryote.

  • Prokaryotic: Bacteria and other microscopic organisms are made up of prokaryotic cells. Prokaryotic cells do not have any complex organelles (not even a nucleus). However, prokaryotes do have ribosomes.
  • Eukaryotic: Two types of eukaryotic cells are plant and animal cells.

The cell contains a nucleus, which contains the genetic material necessary for reproduction. Within the cytoplasm of the cell are the organelles the cell requires to reproduce, energy production, and removal of waste.

Key concepts about how cells obtain and import the necessary nutrients for survival along with the energy requirements of these processes will be presented.

Recursos específicos do tutorial:

  • Detailed description of the function of each organelle within cells is discussed.
  • The role of the nucleus as a command center will be covered along with the location of the cellular DNA within chromosomes.
  • Mapa conceitual mostrando interconexões de novos conceitos neste tutorial e aqueles introduzidos anteriormente.
  • Os slides de definição apresentam os termos conforme são necessários.
  • Visual representation of concepts.
  • Exemplos fornecidos ao longo para ilustrar como os conceitos se aplicam.
  • Um resumo conciso é fornecido na conclusão do tutorial.

The definition of a cell: The smallest unit of an organism that can live independently.
The nucleus of the cell:

  • Núcleo
  • Nucleolus
  • Nuclear envelope
  • Chromsomes
  • Aparelho de Golgi
  • Lisossoma
  • Smooth endoplasmic reticulum
  • Mitochondria
  • Núcleo
  • Ribossomos
  • Rough endoplasmic reticulum
  • Provides a stable internal cell
  • Transport across the cell
  • Prokaryotic vs. Eukaryotic
  • Cell Levels of Organization.

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Kinase

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Kinase, an enzyme that adds phosphate groups (PO4 3− ) to other molecules. A large number of kinases exist—the human genome contains at least 500 kinase-encoding genes. Included among these enzymes’ targets for phosphate group addition ( phosphorylation) are proteins, lipids, and nucleic acids.

For protein targets, kinases can phosphorylate the amino acids serine, threonine, and tyrosine. The reversible phosphorylation of proteins, by the antagonistic (opposing) action of kinases and phosphatases, is an important component of cell signaling because the phosphorylated and unphosphorylated states of the target protein can have different levels of activity. Edwin Gerhard Krebs and Edmond H. Fischer received the Nobel Prize for Physiology or Medicine in 1992 for their work in establishing this paradigm.

Phosphorylation of lipid molecules by kinases is important for controlling the molecular composition of membranes in cells, which helps to specify the physical and chemical properties of the different membranes. Inositol, a compound similar in structure to a carbohydrate, is phosphorylated by kinases to create a diverse array of phosphoinositol and phosphoinositide lipids. These molecules then function as second messengers to propagate signaling information throughout the cell.

Nucleotides, the fundamental units of RNA (ribonucleic acid) and DNA (deoxyribonucleic acid), contain a phosphate molecule attached to a nucleoside, a compound made up of a ribose moiety and a purine or pyrimidine base. In polymers of RNA and DNA, the backbone is composed of repeating phospho-ribose units. Kinases attach the phosphate to the nucleoside, creating a nucleotide monophosphate. For example, an enzyme called nucleoside phosphorylase serves this role when cells switch to synthesizing nucleotides from recycled purines instead of from new starting materials. Mutations in the gene encoding nucleoside phosphorylase can cause a severe form of immune deficiency.

Metabolism of dietary sugars ( glycolysis) involves several different steps of phosphorylation by distinct kinases. These phosphate groups are ultimately used to form the high-energy compound known as ATP (adenosine triphosphate).

Inhibitors of kinases can be important treatments for human diseases in which hyperactive processes need to be dampened. For example, one form of human leukemia, CML ( chronic myelogenous leukemia), is caused by excess activity of the Abelson tyrosine kinase. Imatinib (Gleevec) is a chemical that binds to the active site of this kinase, thereby blocking the enzyme’s ability to phosphorylate targets. Imatinib has been useful in the initial treatment of CML however, in many cases the kinase enzyme mutates, rendering the drug ineffective.