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Laboratório 17: Sorologia, testes sorológicos diretos e indiretos - Biologia

Laboratório 17: Sorologia, testes sorológicos diretos e indiretos - Biologia


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DISCUSSÃO

A. INTRODUÇÃO AO TESTE SEROLÓGICO

As respostas imunes adaptativas referem-se ao capacidade do corpo (próprio) de reconhecer antígenos estranhos específicos (não próprio) que ameaçam sua integridade biológica. Existem dois ramos principais das respostas imunes adaptativas:

1. imunidade humoral: a imunidade humoral envolve a produção de moléculas de anticorpos em resposta a um antígeno e é mediada por linfócitos B.

2. imunidade mediada por células: A imunidade mediada por células envolve a produção de linfócitos T citotóxicos, macrófagos ativados, células NK ativadas e citocinas em resposta a um antígeno e é mediada por linfócitos T.

Para entender as respostas imunológicas, devemos primeiro entender o que significa o termo antígeno. Tecnicamente, um antígeno é definido como uma substância que reage com moléculas de anticorpos e receptores de antígenos nos linfócitos. Um imunógeno é um antígeno que é reconhecido pelo corpo como não próprio e estimula uma resposta imune adaptativa. Para simplificar, tanto os antígenos quanto os imunógenos são geralmente chamados de antígenos.

Quimicamente, antígenos são de grande peso molecular proteínas (incluindo proteínas conjugadas, como glicoproteínas, lipoproteínas e nucleoproteínas) e polissacarídeos (incluindo lipopolissacarídeos). Esses antígenos de proteína e polissacarídeo são encontrados na superfície de vírus e células, incluindo células microbianas (bactérias, fungos, protozoários) e células humanas.

Como mencionado acima, os linfócitos B e linfócitos T são as células que realizam respostas imunes adaptativas. O corpo reconhece um antígeno como estranho quando esse antígeno se liga às superfícies dos linfócitos B e linfócitos T por meio de receptores específicos do antígeno com uma forma que corresponde à do antígeno, semelhante a peças interligadas de um quebra-cabeça. Os receptores de antígenos nas superfícies dos linfócitos B são moléculas de anticorpos denominadas receptores de células B ou sIg; os receptores nas superfícies dos linfócitos T são chamados de receptores de células T (TCRs).

o porções ou fragmentos reais de um antígeno que reagem com receptores em linfócitos B e linfócitos T, bem como com moléculas de anticorpos livres, são chamados epítopos. O tamanho de um epítopo é geralmente considerado equivalente a 5-15 aminoácidos ou 3-4 resíduos de açúcar. Alguns antígenos, como polissacarídeos, geralmente têm muitos epítopos, mas todos com a mesma especificidade. Isso ocorre porque os polissacarídeos podem ser compostos de centenas de açúcares com cadeias laterais de açúcar ramificadas, mas geralmente contêm apenas um ou dois açúcares diferentes. Como resultado, a maioria das "formas" ao longo do polissacarídeo são as mesmas (ver Fig. 1). Outros antígenos, como proteínas, geralmente têm muitos epítopos de diferentes especificidades. Isso ocorre porque as proteínas geralmente têm centenas de aminoácidos de comprimento e são compostas por 20 aminoácidos diferentes. Certos aminoácidos são capazes de interagir com outros aminoácidos na cadeia da proteína e isso faz com que a proteína se dobre sobre si mesma e assuma uma forma tridimensional complexa. Como resultado, existem muitas "formas" diferentes na proteína (ver Fig. 2). É por isso que as proteínas são mais imunogênicas do que os polissacarídeos; eles são quimicamente mais complexos.

Um micróbio, como uma única bactéria, tem muitas proteínas diferentes (e polissacarídeos) em sua superfície que formam coletivamente suas várias estruturas, e cada proteína diferente pode ter muitos epítopos diferentes. Portanto, as respostas imunes são dirigidas contra muitas partes ou epítopos diferentes do mesmo micróbio.

Animação em Flash de epítopos reagindo com sIg específico em
Linfócitos B.

Versão html5 da animação para iPad mostrando epítopos reagindo com receptor de célula B específico em linfócitos B.

Em termos de doenças infecciosas, o seguinte pode atuar como antígenos:

1.Mestruturas icrobianas (paredes celulares, cápsulas, flagelos, pili, cápsides virais, glicoproteínas associadas ao envelope, etc.); e

2. Toxinas microbianas

Certo materiais não infecciosos também podem atuar como antígenos se forem reconhecidos como "não-eu" pelo corpo. Esses incluem:

1. Alérgenos (poeira, pólen, cabelo, alimentos, caspa, veneno de abelha, drogas e outros agentes que causam reações alérgicas);

2. Tecidos e células estranhas (de transplantes e transfusões); e

3. As próprias células do corpo que o corpo não consegue reconhecer como "eu normal" (células cancerosas, células infectadas, células envolvidas em doenças autoimunes).

Anticorpos ou imunoglobulinas são configurações específicas de proteínas produzidas por linfócitos B e células plasmáticas em resposta a um antígeno específico e capaz de reagir com esse antígeno. Os anticorpos são produzidos no tecido linfático e uma vez produzidos, são encontrados principalmente no plasma porção do sangue (a fração líquida do sangue antes da coagulação). Sérum é a fração líquida do sangue após a coagulação.

Existem 5 classes de anticorpos humanos: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Os anticorpos mais simples, como IgG, IgD e IgE, são macromoléculas em forma de "Y" chamadas monômeros compostos de quatro cadeias de glicoproteínas. Existem dois idênticos correntes pesadas tendo um alto peso molecular que varia com a classe de anticorpo. Além disso, existem dois idênticos cadeias leves de uma das duas variedades: kappa ou gama. As cadeias leves têm um peso molecular mais baixo. As quatro cadeias de glicoproteínas são conectadas umas às outras por ligações dissulfeto (S-S) e ligações não covalentes (ver Fig. 3A). As ligações S-S adicionais dobram as cadeias de glicoproteínas individuais em vários domínios globulares distintos. A área onde a parte superior do "Y" se junta à parte inferior é chamada de dobradiça. Esta área é flexível para permitir que o anticorpo se ligue a pares de epítopos a várias distâncias em um antígeno.

As duas pontas do monômero "Y" são chamadas de Porções Fab do anticorpo (ver Fig. 3A). Os primeiros 110 aminoácidos ou primeiro domínio de ambas as cadeias pesada e leve da região Fab do anticorpo fornecer especificidade para ligação a um epítopo em um antígeno. As porções Fab fornecer especificidade para a ligação de um epítopo em um antígeno. A parte inferior do "Y" é chamada de Porção Fc e esta parte é responsável pelo Atividade biológica do anticorpo (ver diagrama de IgG; Fig. Dependendo da classe de anticorpo, as atividades biológicas da porção Fc dos anticorpos incluem a capacidade de ativar a via do complemento (IgG e IgM), ligar-se a fagócitos (IgG, IgA) ou ligam-se aos mastócitos e basófilos (IgE).

Duas classes de anticorpos são mais complexas. IgM é um pentâmero (ver Fig. 3B), consistindo em 5 moléculas semelhantes a "Y" conectadas em suas porções Fc, e IgA secretora é um dímero que consiste em 2 moléculas semelhantes a "Y" (ver Fig. 3C).

Para obter mais informações sobre antígenos, anticorpos e produção de anticorpos, consulte os seguintes objetos de aprendizagem em seu guia de aula:

  • Antigens; Unidade 6, Seção IA2
  • Estrutura do anticorpo; Unidade 6 Seção IIA2

Sorologia refere-se ao uso de reações antígeno-anticorpo em laboratório para fins de diagnóstico. Seu nome vem do fato de que soro, a porção líquida do sangue onde os anticorpos são encontrados é usado em testes. Teste sorológico pode ser usado no laboratório clínico de duas maneiras distintas:

uma. Para identificar antígenos desconhecidos (como microrganismos). Isso é chamado teste sorológico direto. Teste sorológico direto usa uma preparação conhecida de anticorpos, chamada anti-soro, para identificar um antígeno desconhecido como um microrganismo.

b. Para detectar anticorpos sendo produzidos contra um antígeno específico no soro do paciente. Isso é chamado teste sorológico indireto. Teste sorológico indireto é o procedimento pelo qual anticorpos no soro de uma pessoa sendo feito por aquele indivíduo contra um antígeno associado a uma doença particular são detectados usando um antígeno conhecido.

UMAAs reações antígeno-anticorpo podem ser detectadas em laboratório por uma variedade de técnicas. Algumas das técnicas comumente usadas para observar as reações antígeno-anticorpo in vitro são brevemente descritas abaixo.

uma. Aglutinação

O anti-soro conhecido faz com que as bactérias ou outros antígenos particulados se aglutinem ou se aglutinem. Os antígenos de tamanho molecular podem ser detectados anexando os anticorpos conhecidos a partículas maiores e insolúveis, como partículas de látex ou glóbulos vermelhos, a fim de tornar a aglutinação visível a olho nu.

b. Precipitação

O anti-soro conhecido é misturado com o antígeno de teste solúvel e um precipitado turvo se forma na zona de proporção ideal antígeno-anticorpo.

c. Complemento-fixação

O anti-soro conhecido é misturado com o antígeno de teste e o complemento é adicionado. Os glóbulos vermelhos de ovelha e as hemolisinas (anticorpos que lisam os glóbulos vermelhos de ovelha na presença de complemento livre) são então adicionados. Se o complemento estiver ligado na primeira reação antígeno-anticorpo, ele não estará disponível para a reação hemolisina de ovelha e não haverá hemólise. Um teste negativo resultaria em hemólise.

d. Ensaio de imunoabsorção enzimática ou ELISA (também conhecido como imunoensaio enzimático ou EIA)

Os antígenos de teste das amostras são passados ​​por um tubo (ou membrana) revestido com os anticorpos específicos conhecidos correspondentes e ficam presos nas paredes do tubo (ou na membrana). Os anticorpos conhecidos aos quais uma enzima foi quimicamente ligada são então passados ​​através do tubo (ou membrana) onde se combinam com os antígenos aprisionados. O substrato para a enzima ligada é então adicionado e a quantidade de complexo antígeno-anticorpo formado é proporcional à quantidade de reação enzima-substrato, conforme indicado por uma mudança de cor.

e. Técnicas de ligação radioativa

Os antígenos de teste das amostras são passados ​​por um tubo revestido com os anticorpos específicos conhecidos correspondentes e ficam presos nas paredes do tubo. Os anticorpos conhecidos aos quais um isótopo radioativo foi quimicamente ligado são então passados ​​através do tubo onde se combinam com os antígenos aprisionados. A quantidade de complexo antígeno-anticorpo formado é proporcional ao grau de radioatividade.

f. Técnica de anticorpo fluorescente

Um corante fluorescente é quimicamente ligado aos anticorpos conhecidos. Quando o anticorpo fluorescente reage com o antígeno, o antígeno fica fluorescente quando visto em um microscópio fluorescente.

B. TESTE SEROLÓGICO DIRETO: USANDO REAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO EM LABORATÓRIO PARA IDENTIFICAR ANTÍGENOS DESCONHECIDOS, TAIS COMO MICROORGANISMOS.

Este tipo de teste sorológico emprega anti-soro conhecido (soro contendo anticorpos específicos conhecidos). A preparação de anticorpos conhecidos é feita de duas maneiras: em animais ou por células de hibridoma.

1. Preparação de anti-soros conhecidos em animais.

A preparação de anti-soro conhecido em animais envolve a inoculação de animais com antígenos específicos conhecidos, como uma cepa específica de uma bactéria. Depois que as respostas imunológicas do animal tiveram tempo para produzir anticorpos contra aquele antígeno, o animal é sangrado e o sangue pode coagular. A porção líquida resultante do sangue é o soro e conterá anticorpos específicos para o antígeno injetado.

No entanto, um dos problemas de usar anticorpos preparados em animais (injetando no animal um antígeno específico e coletando o soro após a produção dos anticorpos) é que até 90% dos anticorpos no soro do animal podem ser anticorpos que o animal fez "por conta própria" contra antígenos ambientais, em vez daqueles feitos contra o antígeno injetado. O desenvolvimento da técnica de anticorpos monoclonais resolveu amplamente esse problema.

2. Preparação de anticorpos conhecidos por monoclonal técnica de anticorpo.

Um dos maiores avanços na imunologia ocorreu quando a técnica do anticorpo monoclonal foi desenvolvida. Anticorpos monoclonais são anticorpos de um único tipo específico. Nesta técnica, um animal é injetado com o antígeno específico (ver Fig. 4, etapa 1) para o anticorpo desejado. Após o tempo apropriado para a produção de anticorpos, o baço do animal é removido. O baço é rico em células plasmáticas e cada célula plasmática produz apenas um tipo específico de anticorpo. No entanto, as células plasmáticas não crescerão artificialmente em cultura de células. Portanto, uma célula de plasma que produz o anticorpo desejado é fundida com uma célula de mieloma, uma célula cancerosa da medula óssea que crescerá rapidamente em cultura de células, para produzir um célula de hibridoma (veja a Fig. 4, etapa 2). A célula de hibridoma possui as características de ambas as células-mãe. Será produzirá os anticorpos específicos como a célula plasmática e também crescerá prontamente em cultura de células como a célula de mieloma. As células de hibridoma são cultivadas artificialmente em enormes tonéis, onde produzem grandes quantidades do anticorpo específico (ver Fig. 4, etapa 3).

Os anticorpos monoclonais agora são usados ​​rotineiramente em pesquisas médicas e sorologia diagnóstica e estão sendo usados ​​experimentalmente no tratamento de certos tipos de câncer e algumas outras doenças.

3. O conceito e procedimento geral para teste sorológico direto.

O conceito e o procedimento geral para o uso de reações antígeno-anticorpo para identificar antígenos desconhecidos são os seguintes:

  • Conceito:

    Este teste é baseado no fato de que reações antígeno-anticorpo são muito específicas. Os anticorpos geralmente reagem apenas com o antígeno que estimulou sua produção em primeiro lugar, e são tão específicos quanto uma reação enzima-substrato. Por causa disso, pode-se usar anti-soro conhecido (preparado por inoculação animal ou técnica de anticorpo monoclonal como discutido acima) para identificar antígenos desconhecidos, como um microrganismo.

  • Procedimento geral:

    Uma suspensão de o antígeno desconhecido ser identificado é misturado com anti-soro conhecido para aquele antígeno. Em seguida, procura-se uma reação antígeno-anticorpo.

Exemplos de testes sorológicos usados ​​para identificar microrganismos desconhecidos incluem a tipagem sorológica de Shigella e Salmonella (Laboratório 13), a tipagem de Lancefield de estreptococos beta (Laboratório 14) e a identificação sorológica de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis (Laboratório 16). Os testes sorológicos usados ​​para identificar antígenos que não são microrganismos incluem tipagem sanguínea, tipagem de tecidos e teste de gravidez.

4. Exemplos de testes sorológicos diretos para identificar antígenos desconhecidos

Como afirmado acima, este tipo de teste sorológico usa anti-soro conhecido (anticorpos) para identificar antígenos desconhecidos. Quatro desses testes serão examinados no laboratório hoje.

uma. Tipagem Sorológica de Shigella

Existem quatro subgrupos sorológicos diferentes de Shigella, cada um correspondendo a uma espécie diferente:

  • subgrupo A = Shigella dysenteriae
  • subgrupo B = Shigella flexneri
  • subgrupo C = Shigella Boydii
  • subgrupo D = Shigella Sonnei

O anti-soro conhecido está disponível para cada um dos 4 subgrupos de Shigella listados acima e contém anticorpos contra a parede celular (antígenos "O") de Shigella. O suspeito Shigella (o antígeno desconhecido) é colocado em cada um dos 4 círculos em uma lâmina e um anti-soro conhecido diferente (A, B, C ou D) é então adicionado a cada círculo. Uma reação antígeno-anticorpo positiva aparece como uma aglutinação ou aglutinação do Shigella (veja a Fig. 5).

b. Tipagem sorológica de estreptococos

o Vareta de medição Clearview® Strep A Exact II é um teste sorológico qualitativo para detectar o antígeno estreptocócico do grupo A (o antígeno desconhecido) diretamente de esfregaços da garganta e é usado como um auxílio em diagnosticar faringite estreptocócica causado por Streptococcus pyogenes (Estreptococos Beta do Grupo A).

O teste consiste em uma tira de membrana que é pré-revestida com conjugado de anticorpo anti-estreptococo A de látex vermelho (anticorpo conhecido com partículas de látex vermelho anexadas) localizado em uma almofada no início da tira. Também é pré-revestido com anticorpo anti-estreptococos A de coelho (anticorpo conhecido sem látex vermelho anexado) que é imobilizado na linha de teste onde os resultados do teste são lidos (ver Fig. 6A). o partículas de látex vermelhas ligado ao anticorpo anti-Strep A de coelho é o que causa a faixa vermelha “positiva”.

Quando a tira de teste é imersa na amostra extraída, o Antígeno estreptocócico do grupo A extraído do Streptococcus pyogenes no cotonete de garganta de uma pessoa com estreptococos começa a se mover cromatograficamente pela membrana e liga-se ao conjugado anticorpo-látex conhecido de cor vermelha na almofada localizado no início da tira, formando um complexo antígeno-anticorpo de Strep A (ver Fig. 6B). Este complexo antígeno-anticorpo Strep A continua a se mover pela membrana até a região da linha de teste onde os anticorpos anti-Strep A de coelho imobilizados estão localizados.

Se o antígeno estreptocócico do Grupo A estiver presente no esfregaço da garganta, um sanduíche de cor vermelha de anticorpo / antígeno de Strep A / anticorpo conjugado de látex vermelho se forma na região da linha de teste da tira (ver Fig. 6C). A cor vermelha na região da linha de controle aparece quando reagente suficiente atingiu a área de controle e indica que o teste foi concluído. Como resultado, um teste positivo para o antígeno Strep do Grupo A aparece como uma faixa vermelha na área de resultado do teste e uma faixa vermelha na área de controle (ver Fig. 6C).

Se não houver antígeno estreptocócico do Grupo A presente no esfregaço da garganta nenhuma faixa vermelha aparece na região de resultado do teste da tira e uma única faixa vermelha aparece na região da linha de controle, indicando um teste negativo para o antígeno Strep do Grupo A (ver Fig. 6D).

Animação em Flash mostrando a identificação sorológica de
Estreptococos do grupo A, parte 1.

versão http5 da animação para iPad mostrando a identificação sorológica de
Estreptococos do grupo A, parte 1.

Animação em Flash mostrando a identificação sorológica de
Estreptococos do grupo A, parte 2.

versão http5 da animação para iPad mostrando a identificação sorológica de
Estreptococos do grupo A, parte 2.

c. Teste sorológico para diagnosticar a gravidez

o Alere® hCG Dipstick é um teste sorológico qualitativo para detectando gravidez precoce. O hormônio gonadotrofina coriônica humana (hCG), produzido pela placenta, aparece no soro e na urina de mulheres grávidas. O hCG é composto por duas subunidades - alfa e beta. O Alere® hCG Dipstick é um teste de gravidez de uma etapa que detecta níveis de hCG tão baixos quanto 25 mlU / ml. Gonadotrofina coriônica humana (hCG), o antígeno desconhecido para o qual se está testando, é identificado na urina usando anticorpos monoclonais de camundongo conhecidos contra a subunidade beta de hCG ligada ao ouro coloidal, que é de cor vermelha. Ele também usa anticorpos policlonais de cabra conhecidos contra a subunidade alfa de hCG que está ligada à região de resultado do teste da vareta..

Como o teste Strep A mencionado acima, este teste usa um ensaio imunocromatográfico de cores para detectar a reação antígeno-anticorpo. O teste consiste em uma tira de membrana que é pré-revestida com conhecido conjugado de anticorpo anti-beta hCG de ouro coloidal (anticorpo conhecido com partículas de ouro coloidal vermelhas anexadas) localizado em uma almofada no início da tira. Também é pré-revestido com conhecido anticorpo anti-alfa hCG de cabra (anticorpo conhecido sem ouro coloidal vermelho anexado) que é imobilizado na linha de teste onde os resultados do teste são lidos (ver Fig. 7B1). As partículas vermelhas de ouro coloidal anexadas ao anticorpo anti-alfa hCG de camundongo são o que em última instância causa a banda vermelha "positiva".

Quando a tira de teste é imersa na amostra de urina, o hCG começa a se mover cromatograficamente pela membrana e liga-se ao conjugado de ouro-anticorpo anti-beta hCG conhecido de cor vermelha na almofada localizado no início da tira, formando um complexo antígeno-anticorpo hCG (ver Fig. 7B2). Este complexo antígeno-anticorpo hCG continua a se mover para cima na membrana para a região da linha de teste onde os anticorpos anti-beta hCG de cabra conhecidos imobilizados estão ligados.

Se o hCG estiver presente na urina, um sanduíche de cor vermelha de anticorpo anti-beta / antígeno hCG / anticorpo anti-alfa conjugado de ouro vermelho se forma na região da linha de teste da tira (ver Fig. 7B3). Como resultado, um teste positivo para o antígeno hCG aparece como uma faixa vermelha na área de resultado do teste e uma faixa vermelha na área de controle (ver Fig. 7B3).

Se houver nenhum antígeno hCG detectável presente na urina nenhuma faixa vermelha aparece na região de resultado do teste da tira e uma única faixa vermelha aparece na região da linha de controle, indicando um teste negativo para o antígeno hCG (ver Fig. 7B4).

Animação em Flash mostrando a identificação sorológica de
hCG, parte-1.

versão http5 da animação para iPad mostrando a identificação sorológica de
hCG, parte-1.

Animação em Flash mostrando a identificação sorológica de
hCG, parte 2.

versão http5 da animação para iPad mostrando a identificação sorológica de
hCG, parte 2.

d. Identificação de microorganismos usando a técnica de anticorpo fluorescente direto

Certo corantes fluorescentes pode ser quimicamente ligado às moléculas de anticorpo conhecidas no anti-soro. O anticorpo fluorescente conhecido é então misturado com o antígeno desconhecido, como um microrganismo, fixado a uma lâmina. Após a lavagem, para remover qualquer anticorpo fluorescente não ligado ao antígeno, a lâmina é visualizada com um microscópio fluorescente.

Se o anticorpo fluorescente reagiu com o antígeno desconhecido, o antígeno brilhará ou ficará fluorescente sob o microscópio fluorescente. Se o anticorpo não reagir com o antígeno, os anticorpos serão removidos da lâmina e o antígeno não ficará fluorescente.

Animação em Flash mostrando um teste de anticorpo fluorescente direto positivo.

versão http5 da animação para iPad mostrando um teste de anticorpo fluorescente direto positivo.

Animação em Flash mostrando um teste de anticorpo fluorescente direto negativo.

versão http5 da animação para iPad mostrando um teste de anticorpo fluorescente direto negativo.

Por exemplo, no fluorescente direto teste de anticorpos para Neisseria gonorrhoeae, mencionado brevemente no laboratório 16, o antígeno desconhecido, suspeito Neisseria gonorrhoeae, é fixado a uma lâmina de microscópio. Anticorpos fluorescentes conhecidos feitos contra N. gonorrhoeae são então adicionados (ver Fig. 8, etapa 1) e a lâmina é então lavada para remover qualquer anticorpo fluorescente não ligado ao antígeno. A lâmina é então visualizada em um microscópio fluorescente.

Se o antígeno desconhecido for Neisseria gonorrhoeae, os anticorpos conhecidos contra N. gonorrhoeae com corante fluorescente anexado irá ligar-se à bactéria e não irá lavar. A bactéria ficará fluorescente quando vista sob um microscópio fluorescente (ver Fig. 8, etapa 2 e Fig. 10). Se o antígeno desconhecido não for N. gonorrhoeae, os anticorpos fluorescentes conhecidos irão sair da lâmina e as bactérias não irão apresentar fluorescência quando vistas em um microscópio fluorescente.

Muitas bactérias, vírus e fungos podem ser identificados usando essa técnica.

C. TESTE SEROLÓGICO INDIRETO: USANDO REAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO NO LABORATÓRIO PARA DIAGNÓSTICO INDIRETAMENTE POR DETECÇÃO DE ANTICORPOS NO SORO DE UMA PESSOA PRODUZIDO CONTRA UM ANTIGÊNIO DE DOENÇA

Teste sorológico indireto é o procedimento pelo qual anticorpos no soro de uma pessoa sendo feito por aquele indivíduo contra um antígeno associado a uma doença particular são detectados usando um antígeno conhecido.

1. O conceito e procedimento geral para teste sorológico indireto.

O conceito e o procedimento geral para este tipo de teste sorológico são os seguintes:

  • Conceito:

    Este tipo de teste é baseado no fato de que anticorpos são produzidos apenas em resposta a um antígeno específico. Em outras palavras, uma pessoa não produzirá anticorpos contra um antígeno de doença a menos que esse antígeno esteja no corpo estimulando a produção de anticorpos.

  • Procedimento geral:

    Uma amostra do soro do paciente (a porção líquida do sangue após a coagulação e contendo anticorpos contra o antígeno da doença se a pessoa tem ou teve a doença) é misturada com o antígeno conhecido para essa doença suspeita. Em seguida, procura-se uma reação antígeno-anticorpo.

    Exemplos de testes sorológicos para diagnosticar doenças pela detecção de anticorpos no soro do paciente incluem os vários testes sorológicos para sífilis ou STS (como os testes RPR, VDRL e FTA-ABS), os testes para mononucleose infecciosa, os testes para o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), os testes para lúpus eritematoso sistêmico e testes para várias outras infecções virais.

2. Testes sorológicos qualitativos e quantitativos.

Os testes sorológicos indiretos podem ser qualitativos ou quantitativos. UMA qualitativo O teste detecta apenas a presença ou ausência de anticorpos específicos no soro do paciente e costuma ser usado para fins de triagem. UMA quantitativo teste fornece o título ou a quantidade desse anticorpo no soro. O título indica o quanto você pode diluir o soro do paciente e ainda fazê-lo conter anticorpos suficientes para dar uma reação antígeno-anticorpo detectável. Em outras palavras, quanto mais anticorpos são produzidos pelo corpo, mais você pode diluir o soro da pessoa e ainda ver uma reação. Os testes sorológicos quantitativos costumam ser usados ​​para acompanhar o progresso de uma doença, procurando um aumento e uma queda subsequente no título de anticorpos.

3. Exemplos de testes sorológicos indiretos para detectar anticorpos no soro do paciente

uma. O teste RPR para sífilis

A sífilis é uma doença sexualmente transmissível causada pela espiroqueta Treponema pallidum. o RPR (Rapid Plasma Reagin) O teste Card® é um teste de triagem sorológica presumível para sífilis. O soro de uma pessoa com sífilis contém um anticorpo anti-lipídeo não específico (tradicionalmente denominado Reagin), que não é encontrado no soro normal. A natureza exata do anticorpo anti-lipídico (reagina) não é conhecida, mas acredita-se que uma infecção por sífilis instiga a degradação das células do próprio tecido do paciente. Substâncias gordurosas que são liberadas e se combinam com proteínas de Treponema pallidum para formar um antígeno que estimula o corpo a produzir anticorpos contra ambos os lipídios do tecido do corpo (não específicos ou não treponêmicos), bem como o T. pallidum proteína (específica ou treponêmica). O teste RPR Card® detecta o anticorpo antilipídeo inespecífico e é referido como um teste não treponêmico para sífilis.

- micrografia eletrônica de varredura da espiroqueta Treponema pallidum; cortesia do CDC.

Deve ser lembrado que os testes para a presença desses anticorpos antilipídeos inespecíficos são considerados um teste de triagem presuntivo para sífilis. Anticorpos semelhantes a reagina também podem estar presentes como resultado de outras doenças, como malária, lepra, mononucleose infecciosa, lúpus eritematoso sistêmico, pneumonia viral, sarampo e doenças do colágeno e podem dar resultados biológicos falso-positivos (BFP). Os testes de confirmação devem ser feitos para a presença de anticorpos específicos contra o T. pallidum em si. O teste de confirmação para sífilis é o FTA-ABS teste discutido abaixo. Qualquer teste sorológico para sífilis é comumente referido como um STS (Teste sorológico para sífilis).

o antígeno RPR conhecido consiste em cardiolipina, lecitina e colesterol ligado a partículas de carvão a fim de tornar a reação visível a olho nu. Se o paciente tiver sífilis, os anticorpos antilipídeos em seu soro reagirão de forma cruzada com os antígenos lipídicos RPR conhecidos, resultando em uma aglomeração visível das partículas de carvão (ver Fig. 1).

Vamos fazer um quantitativo Teste RPR Card® hoje em laboratório. Lembre-se de que um teste quantitativo permite determinar o título ou quantidade de um determinado anticorpo no soro. Neste teste, uma quantidade constante de antígeno RPR é adicionada às diluições do soro do paciente. A amostra mais diluída do soro do paciente ainda contendo anticorpos suficientes para dar uma reação antígeno-anticorpo visível é relatada como o título.

b. Testes sorológicos para mononucleose infecciosa

Durante o curso da mononucleose infecciosa, causada pelo vírus Epstein-Barr (EBV), o corpo produz inespecífico anticorpos heterófilos que não são encontrados no soro normal. Acontece que estes anticorpos heterófilos terão reação cruzada com antígenos glicoproteicos encontrados na superfície dos glóbulos vermelhos (RBCs) de vários animais, incluindo cavalos, ovelhas e vacas, fazendo com que os eritrócitos se aglutinem. Esses antígenos de glicoproteína de reação cruzada são freqüentemente chamados de Antígenos Paul-Bunnell após seus descobridores.

O teste sorológico de mononucleose infecciosa demonstrado hoje é um teste rápido qualitativo teste de mononucleose infecciosa que usa Os antígenos de Paul-Bunnell são adsorvidos às partículas microscópicas de látex branco como o "antígeno conhecido". Esses antígenos se ligam especificamente aos anticorpos heterófilos encontrados no soro de pessoas com mononucleose infecciosa fazendo com que as partículas de látex se aglutinem ou aglutinem (ver Fig. Testes quantitativos podem então ser feitos para determinar o título de anticorpos heterófilos e acompanhar o progresso da doença.

c. Testes sorológicos para lúpus eritematoso sistêmico (LES)

O lúpus eritematoso sistêmico ou LES é uma doença autoimune sistêmica. Os imunocomplexos ficam depositados entre a derme e a epiderme, e nas articulações, vasos sanguíneos, glomérulos dos rins e sistema nervoso central. É quatro vezes mais comum em mulheres do que em homens. No LES, os autoanticorpos são produzidos contra componentes do DNA. Este teste é específico para o soro anticorpos anti-desoxirribonucleoproteína associado ao SLE. o antígeno conhecido é desoxirribonucleoproteína adsorvida a partículas de látex para tornar a reação mais visível aos olhos (ver Fig. 3). Isto é um qualitativo teste usado para rastrear a presença da doença e monitorar seu curso.

d. Detecção de anticorpos usando a técnica de anticorpo fluorescente indireto: o teste FTA-ABS para sífilis

o indireto A técnica de anticorpo fluorescente envolve três reagentes diferentes:

uma. o soro do paciente (contendo anticorpos contra o antígeno da doença se a doença estiver presente)

b. Antígeno conhecido para a doença suspeita

c. Anticorpos fluorescentes anti-gama globulina humana (anticorpos feitos em outro animal contra a porção Fc de anticorpos humanos (ver Fig. 9) por injeção de soro humano em um animal. Um corante fluorescente é então quimicamente ligado aos anticorpos anti-gama globulina humana (anti-HGG).

o Teste FTA-ABS (Teste de absorção de anticorpo treponêmico fluorescente) para sífilis é um exemplo de um procedimento de anticorpo fluorescente indireto. Isto é um teste de confirmação para sífilis, uma vez que testa especificamente para anticorpos no soro do paciente produzidos em resposta à espiroqueta da sífilis, Treponema pallidum.

Neste teste, matou T. pallidum,(o antígeno conhecido), é fixado em uma lâmina (ver Fig. 4, etapa 1). O soro do paciente é adicionado à lâmina. Se o paciente tem sífilis, anticorpos contra o T. pallidum irá reagir com o antígeno na lâmina (Fig. A lâmina é então lavada para remover quaisquer anticorpos não ligados à espiroqueta.

Para tornar esta reação visível, um segundo anticorpo de origem animal feito contra anticorpos humanos e marcado com um corante fluorescente (fluorescente anti-gama globulina humana) é adicionado. Esses anticorpos anti-HGG fluorescentes reagem com os anticorpos do paciente que reagiram com o T. pallidum no slide (Fig. 4, passo 3). A lâmina é lavada para remover quaisquer anticorpos anti-HGG fluorescentes não ligados e observada com um microscópio fluorescente. Se as espiroquetas brilharem ou apresentarem fluorescência (ver Fig. 5), o paciente fez anticorpos contra T. pallidum e tem sífilis.

Animação em flash do teste FTA-ABS para sífilis.

versão http5 de animação para iPad mostrando o teste FTA-ABS para sífilis.

Outro exemplo do teste de anticorpo fluorescente indireto é o teste para anticorpos contra o vírus do sarampo. Células infectadas com o vírus do sarampo inativado (o antígeno conhecido) são fixadas em uma lâmina de microscópio. O soro do paciente é então adicionado. Se a pessoa tiver sarampo, anticorpos do isotipo IgG serão produzidos contra o vírus do sarampo e se ligarão a epítopos virais nas células conhecidas infectadas pelo vírus do sarampo. Depois de lavar a lâmina para remover qualquer IgG não ligado, é adicionado IgG anti-humano fluorescente. O IgG anti-humano fluoprescente então se liga ao IgG do paciente que está ligado às células infectadas. Quando vistas com um microscópio fluorescente, as células infectadas ficam verdes fluorescentes.

e. Os testes sorológicos EIA e Western Blot para anticorpos contra o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV)

No caso dos atuais testes de anticorpos HIV, o soro do paciente está misturado com vários antígenos de HIV produzidos por tecnologia de DNA recombinante. Se a pessoa for soropositiva (repetidos testes antígeno-anticorpos positivos), o HIV deve estar no corpo dessa pessoa, estimulando a produção de anticorpos. Em outras palavras, a pessoa deve estar infectada pelo HIV. Os dois testes mais comuns usados ​​atualmente para detectar anticorpos contra o HIV são o imunoensaio enzimático ou EIA (também conhecido como ensaio de imunoabsorção enzimática ou ELISA) e o Western blot ou WB. Uma pessoa é considerada soropositiva para infecção por HIV somente depois que um teste de triagem EIA é repetidamente reativo e outro teste, como o WB, foi realizado para confirmar os resultados.

o EIA é mais barato, rápido e tecnicamente menos complicado do que o WB e é o procedimento feito inicialmente como um teste de triagem para a infecção pelo HIV. Os vários testes EIA fornecem uma leitura espectrofotométrica da quantidade de anticorpos que se ligam a antígenos HIV conhecidos.

O kit de teste EIA contém poços de plástico aos quais vários antígenos de HIV foram adsorvidos (veja a Fig. 6, etapa 1). o soro do paciente é adicionado aos poços e quaisquer anticorpos presentes no soro contra os antígenos do HIV irão se ligar aos antígenos correspondentes nos poços (Fig. 6, etapa 2). Os poços são então lavados para remover todos os anticorpos do soro, exceto aqueles ligados aos antígenos do HIV. Anticorpos anti-gamaglobulina humana ligada a enzima (anti HGG) são então adicionados aos poços. Esses anticorpos, produzidos em outro animal contra a porção Fc dos anticorpos humanos por meio da injeção de soro humano no animal, possuem uma enzima quimicamente ligada. Eles reagem com os anticorpos humanos ligados aos antígenos HIV conhecidos (Fig. 6, etapa 3). Os poços são então lavados para remover qualquer anti-HGG que não se tenha ligado aos anticorpos séricos. UMA substrato específico para a enzima é então adicionado e a reação enzima-substrato resultante causa um mudança de cor nos poços (Fig. 6, etapa 4). Se não houver anticorpos no soro do paciente contra o HIV, não haverá nada para o anti-HGG ligado à enzima se ligar e ele será lavado dos poços. Quando o substrato é adicionado, não haverá enzima presente nos poços para dar uma mudança de cor.

Animação em flash do teste EIA para anticorpos contra o HIV.

Versão http5 da animação para iPad mostrando o teste EIA para anticorpos contra o HIV.

Se o EIA inicial for reativo, é repetido automaticamente para reduzir a possibilidade de que um erro técnico de laboratório tenha causado o resultado reativo. Se o EIA ainda for reativo, é então confirmado pelo teste Western blot.

o Western blot WB é o teste mais comumente usado como teste de confirmação se o EIA for repetidamente positivo. O WB é tecnicamente mais complexo de executar e interpretar, é mais demorado e mais caro do que os EIAs.

Com o WB, os vários antígenos de proteína e glicoproteína do HIV são separados de acordo com seu peso molecular por eletroforese em gel (um procedimento que separa proteínas carregadas em um gel pela aplicação de um campo elétrico). Uma vez separados, os vários antígenos de HIV são transferidos para uma tira de nitrocelulose (ver Fig. 7, etapa 1 e Fig. 7, etapa 2). O soro do paciente é então incubado com a tira e quaisquer anticorpos anti-HIV presentes irão se ligar aos antígenos HIV conhecidos correspondentes na tira (Fig. 7, etapa 3). Anticorpos anti-gamaglobulina humana ligada a enzima (anti HGG) são então adicionados à faixa. 7, etapa 4). A tira é então lavada para remover qualquer anti-HGG que não se tenha ligado aos anticorpos séricos. UMA substrato específico para a enzima é então adicionado e a reação enzima-substrato resultante causa um mudança de cor na tira (Fig. 7, passo 5). Se não houver anticorpos no soro do paciente contra o HIV, não haverá nada para o anti-HGG ligado à enzima se ligar e ele será removido da tira. Quando o substrato é adicionado, não haverá enzima presente na tira para dar uma mudança de cor.

Animação em flash do teste WB para anticorpos contra o HIV.

Versão http5 da animação para iPad mostrando o teste WB para anticorpos contra o HIV.

Deve-se mencionar que todos os testes sorológicos são capazes de dar ocasionais resultados falso-positivos e falso-negativos. A causa mais comum de um teste de anticorpos HIV falso-negativo é quando uma pessoa só recentemente foi infectado com o HIV e seu corpo ainda não produziu quantidades suficientes de anticorpos para dar um teste sorológico positivo visível. Geralmente, leva entre 2 semanas e 3 meses após uma pessoa ser inicialmente infectada pelo HIV para se converter em um teste de anticorpos HIV positivo.

Vários testes comerciais rápidos de HIV também foram aprimorados para detectar anticorpos contra o HIV. Eles incluem:

  • OraQuick Advance HIV1 / 2®: usa um espécime de sangue por punção no dedo ou um espécime oral.
  • Uni-Gold Recombigen®: usa uma picada no dedo ou uma amostra de sangue total.
  • Reveal G2®: Utiliza soro ou plasma.
  • Multispot HIV-1 / HIV-2®: Usa soro ou plasma.

Para obter mais informações sobre HIV e AIDS, consulte os seguintes Objetos de Aprendizagem em seu Guia de Aulas:

  • Unidade 4, Seção IVF3: O ciclo de vida do HIV

PROCEDIMENTO

PROCEDIMENTO PARA TESTE SEROLÓGICO DIRETO PARA DETECTAR ANTÍGENOS DESCONHECIDOS

A. Tipagem Sorológica de Shigella

1. Usando um marcador de cera, desenhe dois círculos (aproximadamente do tamanho de um níquel) em cada uma das duas lâminas de vidro limpas. Identifique os círculos A, B, C e D.

2. Adicionar uma gota do suspeito Shigella(antígeno desconhecido) para cada círculo. (O Shigella foi tratado com formalina para torná-lo não infeccioso, mas ainda antigênico.)

3. Agora adicione uma gota do subgrupo Shigella conhecido UMA anti-soro para o círculo "A", uma gota de conhecido Shigella subgrupo B anti-soro para o círculo "B", uma gota de conhecido Shigella subgrupo C anti-soro para o círculo "C", e uma gota de conhecido Shigella subgrupo D anti-soro ao círculo "D".

4. Girar o slide com cuidado para 30-60 segundos.

Aglutinação da bactéria indica uma reação positiva.

Nenhuma aglutinação é negativa.

5. Descarte todas as pipetas e lâminas no recipiente do desinfetante.

B. Tipagem sorológica de estreptococos: o Teste Clearview® Strep A Exact II Dipstick

1. Adicionar 4 gotas de Reagente de Extração # 1 para o tubo de extração. Este reagente contém nitrito de sódio 2M e deve ser de cor rosa a roxa.

2. Adicionar 4 gotas de reagente de extração # 2 para o tubo de extração. Este reagente contém ácido acético 0,3M. A solução deve ficar amarela.

3. Coloque o esfregaço da garganta no tubo de extração e role-o com um movimento circular dentro do tubo. Deixe repousar pelo menos 1 minuto.

4. Aperte a zaragatoa com firmeza contra o tubo de extração para expelir o máximo de líquido possível da zaragatoa e elimine a zaragatoa do recipiente de resíduos biológicos.

5. Mergulhe a tira de teste no tubo de extração com as setas apontando para a solução da amostra extraída. Deixe a tira no tubo e comece a cronometrar.

6. Leia os resultados em 5 minutos. Uma banda vermelha na região de controle e uma banda vermelha na região de teste indicam um teste positivo (Veja a Fig. Uma única banda vermelha na região de controle indica apenas um teste negativo (Ver Fig. 6D). Nenhuma faixa colorida na região de controle indica um teste inválido.

C. Teste sorológico para detectar gravidez: O Alere hCG-Dipstick®

1. Mergulhe a vareta de medição de hCG na urina até a linha máxima na tira por 5 segundos.

2. Coloque a vareta de teste em uma superfície plana e não absorvente e leia os resultados em 3-4 minutos. Não interprete após o tempo de leitura apropriado.

3. Se o hCG estiver presente na urina em uma concentração de 25mlU / ml ou superior, a teste positivo, uma linha de teste rosa para vermelho aparecerá junto com uma linha de controle vermelha na janela de resultado (ver Fig. Se hCG estiver ausente ou presente em níveis muito baixos, um teste negativo, apenas uma linha de controle vermelha aparece na janela de resultados (ver Fig. 7B4).

D. A técnica de anticorpo fluorescente direto

Observe a demonstração de um teste de anticorpo fluorescente direto positivo para Neisseria gonorrhoeae .

PROCEDIMENTO PARA TESTE SEROLÓGICO INDIRETO PARA DETECTAR ANTICORPOS NO SORO DO PACIENTE

A. O teste de cartão RPR® para sífilis (demonstração)

1. Identifique 6 tubos de ensaio como segue: 1: 1, 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16 e 1:32.

2. Usando uma pipeta de 1,0 ml, adicione 0,5 ml de solução salina a 0,9% em tubos 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16 e 1:32.

3. Adicionar 0,5 ml de soro do paciente ao 1:1 tubo (soro não diluído).

4. Adicione outro 0,5 ml de soro para a solução salina no 1:2 tubo e misture. Retirar 0,5 ml do tubo 1: 2 e adicione-o ao 1:4 tubo e misture. Retirar 0,5 ml do tubo 1: 4, adicione ao 1:8 tubo e misture. Retirar 0,5 ml do tubo 1: 8, adicione ao 1:16 tubo e misture. Retirar 0,5 ml do tubo 1:16, adicione ao 1:32 tubo e misture. Retirar 0,5 ml do tubo 1:32 e descartar. A diluição do soro está resumida na Fig. 8.

5. Usando as pipetas capilares fornecidas com o kit, adicione uma gota de cada diluição de soro para separar círculos do cartão RPR. Espalhe o soro em toda a superfície interna do círculo com a ponta da pipeta, usando uma nova pipeta para cada diluição de soro.

6. Usando o dispensador de antígeno RPR, adicione uma gota de antígeno RPR conhecido para cada círculo. Não deixe a agulha do dispensador tocar no soro. Usando agitadores descartáveis, misture o antígeno RPR conhecido com o soro em cada círculo.

7. Coloque a lâmina em um agitador e girar por no máximo 4 minutos.

8. Leia os resultados da seguinte forma:

  • Uma aglomeração definitiva das partículas de carvão é relatada como reativo (R).
  • Nenhuma aglomeração é relatada como não reativo (N).

A maior diluição de soro que produz um reativo resultado é o título. Por exemplo, se as diluições resultassem como segue, o título seria relatado como 1: 4 ou 4 dils.

1:11:21:41:81:161:32

R

R

R

N

N

N

B. Os testes sorológicos para mononucleose infecciosa (demonstração)

1. Lugar uma gota de cada soro do paciente em círculos no slide de teste.

2. Adicionar uma gota das partículas de látex tratadas contendo antígenos Paul-Bunnell em sua superfície (o antígeno conhecido) para cada círculo e misture com aplicadores descartáveis.

3. Balance o cartão suavemente por 3 minutose observe a aglutinação das partículas de látex. Aglutinação indica a presença de anticorpos heterófilos (veja a Fig. 2).

C. Os testes sorológicos para lúpus eritematoso sistêmico (LES) (demonstração)

1. Adicionar uma gota de cada soro do paciente para separar círculos no slide de teste.

2. Adicionar uma gota do reagente de látex-desoxirribonucleoproteína (o antígeno conhecido, desoxirribonucleoproteína adsorvida às partículas de látex) para cada amostra de soro e misture com aplicadores descartáveis.

3. Balance o slide suavemente por 3 minutos e procure aglutinação das partículas de látex. Aglutinação indica a presença de anticorpos antinucleares associado ao SLE (ver Fig. 3).

D. O teste FTA-ABS para sífilis (técnica de anticorpo fluorescente indireto

Observe o slide de 35 mm de um teste FTA-ABS positivo (consulte a Fig. 5).

E. Os testes EIA e WB para anticorpos anti-HIV

Observe as ilustrações dos testes EIA e WB para anticorpos contra o HIV.

RESULTADOS

RESULTADOS DE TESTES SEROLÓGICOS DIRETOS PARA DETECTAR ANTÍGENOS DESCONHECIDOS

A. Tipagem Sorológica de Shigella

Faça um desenho de seus resultados.

  • A aglutinação de bactérias é positiva.
  • Nenhuma aglutinação de bactérias é negativa.

Shigella slide de digitação

B. Tipagem sorológica de estreptococos: Vareta de medição Clearview® Strep A Exact II

Faça um desenho de seus resultados.

C. Teste sorológico para diagnosticar a gravidez: Alere® hCG Dipstick

Faça um desenho de um teste positivo para gravidez.

D. A Técnica de Anticorpo Fluorescente Direto

Faça um desenho e descreva um teste de anticorpo fluorescente direto positivo.

Teste de anticorpo fluorescente direto positivo
para Neisseria gonorrhoeae

RESULTADOS DO TESTE SEROLÓGICO INDIRETO PARA DETECTAR ANTICORPOS NO SORO DO PACIENTE

A. Teste RPR Card® para sífilis (quantitativo)

Detecta anticorpos antilipídios não treponêmicos (reagina)

Registre seus resultados na tabela.

DiluiçãoResultado
1:1
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
Titer

R = reativo (aglomerados distintos)
N = não reativo (sem aglomerados)

B. MONO-TESTE para mononucleose infecciosa (qualitativo)

Detecta anticorpos heterófilos.

Desenhe os resultados de um teste positivo e um negativo.

Lâmina de teste de mononucleose infecciosa
+ = Aglutinação de partículas de látex
- = Sem aglutinação de partículas de látex

C. Teste sorológico para LES (qualitativo)

Detecta anticorpos anti-desoxirribonucleoproteína.

Desenhe os resultados de um teste positivo e um negativo.

Lâmina de teste SLE
+ = Aglutinação
- = Sem aglutinação

D. Teste FTA-ABS para sífilis (confirmação)

Detecta anticorpos contra Treponema pallidum

Desenhe os resultados de um teste FTA-ABS positivo.

Teste FTA-ABS positivo para sífilis
(espiroquetas fluorescentes)


Laboratório 17: Sorologia, testes sorológicos diretos e indiretos - Biologia

Nos últimos anos, a IgG intravenosa (IVIgG) adquiriu grande importância no tratamento dos estados de imunodeficiência e distúrbios autoimunes, na profilaxia da isoimunização Rh e na profilaxia de pacientes com transplante de medula óssea para redução de infecções (1-3). É importante perceber, porém, que existem problemas de testes de laboratório clínico associados ao uso de IVIgG. Esses problemas incluem aqueles causados ​​por contaminação viral e de aloanticorpos de hemácias (RBC) de preparações de IVIgG (Tabela 1).

Tabela 1. Anticorpos que podem estar presentes nas preparações IVIgG
TétanoAnti-A e anti-B
SarampoAnti-A
Hepatite BAnti-B
CitomegalovírusAnti-D
Hepatite AAnti-K
Antígeno de superfície da hepatite BAnticorpo (anticorpos) que reagem com todos os RBC testados
Hepatite CAnticorpos plaquetários (?)
Muitos outros anticorpos para bactérias, vírus, etc.Anticorpos linfocitotóxicos (?)

As preparações de IVIgG são extraídas de grandes pools de doadores de plasma voluntários (mais de 10.000 doadores / pool) sob estritos regulamentos da Food and Drug Administration (FDA) dos EUA e padrões e diretrizes da Organização Mundial da Saúde (OMS). IVIgG é extraído por um processo de fracionamento com álcool frio, o produto final tem 96-98% das características eletroforéticas da gamaglobulina. Os fabricantes adicionam várias quantidades de compostos bioquímicos para alcançar a isotonicidade, faixas de pH específicas, estabilidade e solubilidade (4-16). IVIgG também contém quantidades variáveis ​​de IgA (de 0,4 a 720 mg / mL, dependendo do fabricante). É importante ter isso em mente ao tratar pacientes que podem ser deficientes em IgA (3).

Após a infusão, o IVIgG fica disponível na circulação quase imediatamente. Estima-se que após 6 d, as concentrações de IVIgG nos compartimentos extravascular e intravascular sejam equalizadas. Embora a meia-vida fisiológica do IVIgG seja de aproximadamente 22 dias, observou-se que ela se estende a mais de 30 dias em pacientes imunodeficientes (13). Novamente, o IVIgG preparado por diferentes fabricantes deve cumprir as diretrizes estritas da OMS e FDA, padrões de produção e controles de qualidade, que incluem níveis mínimos esperados de anticorpos para o antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg) e vírus da hepatite A (4).

As preparações de IVIgG contêm as várias subclasses de IgG em proporções semelhantes às do plasma normal. A importância das subclasses de IgG na terapia de reposição é significativa, pois muitos processos de doenças e infecções parecem estar associados a deficiências em subclasses de IgG específicas (17-23). No entanto, as preparações de IVIgG derivadas dos grandes conjuntos de doadores de plasma descritos acima também contêm um amplo espectro de anticorpos para microrganismos virais, bacterianos e outros. Além disso, eles inevitavelmente contêm anticorpos contra antígenos de hemácias, que podem produzir resultados falso-positivos durante a investigação de pacientes dependentes de transfusão (24) (Tabela 1).

Consequentemente, a presença de aloanticorpos em preparações de IVIgG é uma preocupação, devido aos estragos que pode causar nos resultados dos testes sorológicos e de compatibilidade. Uma das preocupações mais óbvias é a contaminação com anticorpos contra o vírus da imunodeficiência humana (HIV) e o vírus da hepatite C. Nós aqui do Serviço de Transfusão do M. D. Anderson Cancer Center estudamos recentemente as preparações IVIgG usadas por nosso serviço. Em um estudo relatado em 1991, testamos 165 lotes de IVIgG de diferentes fabricantes (24) (Tabela 2). Em um estudo mais recente, analisamos 51 lotes de IVIgG (dados não publicados). Diminuições definitivas nos níveis de contaminação podem ser vistas ao comparar nossos dois conjuntos de dados. Por exemplo, ao contrário dos lotes anteriores, nenhum dos lotes atuais foi reativo ao vírus da imunodeficiência humana 1/2 (HIV-1/2) ou à reagina plasmática rápida. Quarenta e sete dos lotes no estudo mais recente foram reativos para anticorpos da hepatite C, mas no futuro esperamos ver menos reatividade da hepatite C à luz de uma nova exigência da FDA para triagem de doadores e processamento de plasma. Portanto, é importante não ignorar nem reagir exageradamente à reatividade do anticorpo da hepatite C em um paciente recebendo IVIgG. Obviamente, o teste de hepatite e citomegalovírus (CMV) também pode produzir resultados não interpretáveis.

Tabela 2. Lista parcial de anticorpos para marcadores de doenças infecciosas testados e identificados em vários lotes de IVIgG
Não. Muitos positivos
1986-1990
(n = 165)
1991-1992
(n = 51)
Superfície de hepatite B165100%51100%
Núcleo de hepatite B16097%2141%
Citomegalovírus15896%51100%
Hepatite A total165100%Não testado
HIV-16439%Não testado
HIV-1/2Não testado00%
Reagina de plasma rápido4820%00%
Hepatite CNão testado4792%

Outra preocupação, especialmente em pacientes com transplante de medula óssea, é a presença de aloanticorpos de hemácias (Tabelas 3 e 4). Desde a recente introdução do IVIgG para a profilaxia do CMV em receptores de transplante de medula óssea, uma série de relatórios descreveu aumento na incidência de testes positivos diretos e indiretos de antiglobulina, resultados sorológicos confusos em testes de pré-transfusão e casos raros de hemólise (25-29). Em um estudo de Robertson et al. Dos achados sorológicos em 47 pacientes com transplante de medula óssea que receberam altas doses de IVIgG (25), a frequência de resultados positivos de antiglobulina direta foi de 48,9% (P menor que 0,001) versus 12,8% para um grupo controle que não recebeu IVIgG. A frequência de resultados positivos do teste de antiglobulina indireta foi de 25,5% (P menor que 0,001) no grupo IVIgG versus 4,3% no grupo não IVIgG. As especificidades de anticorpos mais frequentemente identificadas no soro e no eluato foram anti-A ou anti-B, seguidas de anti-D e anti-K. Em um teste de 46 lotes de IVIgG para anticorpos contra antígenos de grupos sanguíneos por Garcia et al. (26), anti-A ou anti-B foi detectado em 88% dos lotes, e globulina anti-humana indireta foi detectada em 63% dos lotes. Como as preparações de IVIgG, como apontamos, são fabricadas a partir de grandes pools de plasma de doadores, elas podem conter quantidades variáveis ​​de isoaglutininas e outros aloanticorpos comuns, como anti-D e anti-K (5,30). Os títulos relatados de isoaglutininas ou anti-D em preparações de IVIgG variam de 0 a 128 (5,31,32) (Tabela 5).

Tabela 3. Isohemagglutininas em lotes de IVIgG
Não. Muitos positivos
1986-1990
(n = 165)
1991-1992
(n = 49) *
Anti-A e anti-B11771%2959%
Anti-A2012%1327%
Anti-B85%48%
Sem isohemaglutinina2012%36%

* Dois lotes de 51 não testados.

Tabela 4. Aloanticorpos RBC em lotes de IVIgG
No. lotes
1986-1990
(n = 165)
1991-1992
(n = 47) *
Nenhuma evidência de aloanticorpos RBC8451%817%
Aloanticorpos RBC presentes8149%3983%

* Quatro lotes de 51 não testados.

Tabela 5. Aloanticorpos RBC testados e identificados em lotes IVIgG, 1986-1990 e 1991-1992
Não. Muitos positivos
1986-1990
(n = 81)
1991-1992
(n = 39)
Anti-D3847%923%
Anti-K22%13%
Anti-CSem dados13%
Anti-K, anti-D e anti-LebSem dados13%
Anti-K, anti-D, anti-Leb e anti-CSem dados13%
Anti-C e anti-DSem dados13%
Não identificávelSem dados718%
Anti-K e não identificávelSem dados25%
Anti-D e anti-K22%615%
Anti-D e não identificável1215%821%
Anti-D, anti-K e não identificávelSem dados1231%
Com aloanticorpos específicos de RBC4859%Sem dados
Reage com todas as células testadas2835%Sem dados
Aloanticorpos RBC não identificáveis1316%Sem dados

Além do IVIgG, outros agentes imunossupressores terapêuticos que têm efeitos semelhantes aos do IVIgG e são usados ​​em pacientes com transplante de medula óssea, como globulina anti-linfócito e globulina anti-timócito, podem criar problemas durante os testes de compatibilidade. Por exemplo, em uma série de 37 pacientes estudados por Swanson et al., 8 tiveram testes de antiglobulina diretos positivos e triagens de anticorpos eritrócitos positivos, 15 desenvolveram anticorpos eritrocitários detectáveis ​​à temperatura ambiente, 4 desenvolveram anticorpos eritrocitários detectáveis ​​a 37 graus Celsisus na albumina, e 33 desenvolveram anticorpos anti-hemácias detectáveis ​​na fase de globulina anti-humana (33). Os problemas de compatibilidade foram resolvidos pela adsorção da globulina anti-humana com eritrócitos revestidos com globulina anti-linfócito, o que permitiu a remoção da substância na globulina anti-linfócito que reage com a globulina anti-humana.

Episódios hemolíticos resultantes de anticorpos IgG adquiridos passivamente são outro problema na administração de IVIgG, embora tais episódios sejam geralmente leves e autolimitados. Por exemplo, Robertson et al., Em seu estudo de 47 receptores de transplante de medula óssea após terapia com IVIgG, não observaram hemólise significativa associada à transferência passiva de anticorpos (25). Por outro lado, um relatório recente de Copelan et al. descreveram dois pacientes que tiveram hemólise clinicamente significativa após receber grandes doses de IVIgG (27). Um desses dois pacientes teve um episódio agudo de hemólise após receber dois lotes de IVIgG. Anti-A e anti-D foram encontrados no eluato de hemácias do paciente e títulos de anti-A e anti-D de 32 e 2, respectivamente, foram demonstrados nos lotes de IVIgG. Embora os baixos títulos de anticorpos em preparações de IVIgG não tenham sido considerados como causadores de hemólise clinicamente significativa em pacientes (32), os dois relatos de caso de Copelan et al. ilustram raras exceções (27).

As isohemaglutininas representam outro problema. Nós e outros relatamos anteriormente sobre a presença inesperada de isohemagglutininas em preparações de IVIgG (24,34). A presença desses anticorpos, no entanto, representa uma grande carga para a logística do suprimento de sangue, especialmente no caso de pacientes dependentes de IVIgG. Se esses pacientes também forem dependentes de transfusão, então, na maioria dos casos, eles devem receber sangue O, Rh-. Nesse sentido, então, seria muito útil e lógico para os fabricantes de preparações de IVIgG adsorver esses anticorpos. No entanto, embora a tecnologia para fazer isso esteja disponível, tal remoção de anticorpos aparentemente não é exigida pelo FDA, de acordo com os representantes dos fabricantes.

É interessante notar que em nosso estudo de 1991, cerca de 50% das preparações de IVIgG não mostraram evidências de aloanticorpos de hemácias (24). No entanto, em nossa revisão mais recente, apenas 17% das preparações de IVIgG estavam livres de tais anticorpos. A razão para isso ainda não está clara para nós.

A lista de aloanticorpos RBC discutida aqui não é exaustiva e representa apenas a extensão de nossos testes. Ainda assim, todos os aloanticorpos que discutimos obscurecem o quadro imunohematológico e sobrecarregam ainda mais o processo de garantir um suprimento seguro de hemocomponentes para pacientes dependentes de transfusão (Tabelas 4-6).

Tabela 6. Impacto do IVIgG no Laboratório Clínico e no Serviço de Transfusão
Pacientes em IVIgG podem testar falso-positivo em testes baseados em IgG.
O serviço de transfusão é forçado a usar métodos elaborados para identificar aloanticorpos de RBC.
Pacientes dependentes de transfusão em IVIgG esgotam o inventário de sangue O, Rh negativo.

Nossa análise mais recente de lotes de IVIgG mostrou que outros anticorpos, como anti-C, anti-c e anti-Leb, também complicam ainda mais a investigação e o suporte de pacientes dependentes simultaneamente de terapia de IVIgG e transfusões. Para lidar com tal situação de forma eficaz, o serviço de transfusão de um hospital deve estar ciente dos pacientes que recebem IVIgG.Em hospitais onde a farmácia dispensa IVIgG, isso não é tão fácil links de informações devem ser estabelecidos entre a farmácia e o serviço de transfusão para fornecer os nomes de cada paciente que recebe IVIgG, a dosagem de IVIgG, o número do lote e a data da infusão. No entanto, em outros ambientes em que o próprio serviço de transfusão dispensa IVIgG, é muito fácil e conveniente para o serviço acompanhar quem o recebe.

Em nossa instituição, os frascos de IVIgG vazios são guardados pela farmácia e entregues imediatamente ao serviço de transfusão sempre que um paciente recebe uma infusão de IVIgG. Nosso serviço de transfusão então registra o número do lote e a data da infusão de IVIgG no prontuário do paciente. O serviço de transfusão também é geralmente capaz de recuperar IVIgG suficiente dos frascos vazios para rastrear os lotes quanto à presença de aloanticorpos de hemácias. Subseqüentemente, quando uma solicitação de transfusão para qualquer paciente registrado é recebida, uma verificação cruzada rápida do arquivo de transfusão pela equipe do serviço de transfusão pode alertá-los sobre potenciais problemas sorológicos. Freqüentemente, os perfis de anticorpos detectados nos lotes de IVIgG se assemelham aos encontrados no soro e no eluato de pacientes que recebem IVIgG. Portanto, o serviço de transfusão deve investigar exaustivamente os perfis de anticorpos do soro sanguíneo de todos os pacientes transplantados para determinar que tipo de solução de IVIgG deve ser administrada. Essas etapas são valiosas na resolução de problemas sorológicos complexos.

Inevitavelmente, o laboratório clínico deve estabelecer métodos e procedimentos para evitar armadilhas falso-positivas desencadeadas por infusões de IVIgG. Por outro lado, o serviço de transfusão deve buscar informações sobre os pacientes em terapia com IVIgG para que os esquemas hemoterápicos adequados sejam fornecidos em tempo hábil. Consequentemente, o laboratório clínico e o serviço de transfusão devem estar no circuito de informações sobre os pacientes que recebem IVIgG. Além disso, cada lote de IVIgG usado deve ser analisado para determinar quais anticorpos contaminantes podem estar presentes e podem produzir resultados de testes laboratoriais espúrios, resultados que podem, por sua vez, desencadear especulações clínicas injustificadas e a solicitação de procedimentos terapêuticos e diagnósticos adicionais, mas desnecessários.

Ao lidar com o IVIgG, o laboratório clínico, a farmácia, o serviço de transfusão, o médico assistente e a equipe de enfermagem devem ter canais abertos de comunicação e informação para evitar exames e exames desnecessários nesses pacientes. Como afirmado acima, os profissionais clínicos e de transfusão que lidam com pacientes com deficiência de IgA devem estar particularmente alertas ao usar preparações de IVIgG, uma vez que tais preparações podem conter várias quantidades de IgA e uma vez que a infusão de IVIgG em um paciente com deficiência de IgA com anticorpos IgA pode desencadear uma reação anafilática severa.

Outra nota de cautela refere-se às reações alérgicas transfusionais que podem ocorrer durante ou após uma infusão IVIgG pós-transfusão. Pode acontecer que uma equipe de enfermagem ignore a infusão de IVIgG nesses casos e relate apenas que o paciente em questão recebeu algum tipo de transfusão. Embora a reação transfusional não deva ser negligenciada, saber que IVIgG foi infundido ajudaria claramente no entendimento da reação alérgica.

Sem dúvida, a terapia IVIgG é uma modalidade em constante expansão. Os pacientes que o recebem experimentam efeitos benéficos, e a lista de entidades patológicas nas quais o IVIgG pode ser testado e administrado é atualmente ilimitada. Diante disso, o laboratório clínico e o serviço de transfusão devem desenvolver uma estratégia proativa para lidar com as interferências dos testes induzidas pelas infusões de IVIgG.

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PROBLEMAS ATUAIS NA MEDICINA DE TRANSFUSÃO
Volume 3, Número 2
Copyright 1995 Centro do Câncer M. D. Anderson da Universidade do Texas, Houston, Texas


HISTÓRIA

Teste de Wassermann ou reação de Wassermann

Foi o primeiro teste de sangue para sífilis e o primeiro teste na categoria de testes não treponêmicos (NTT) desenvolvido por Wassermann, Julius Citron e Albert Neisser em 1906

É baseado no princípio de fixação do complemento no qual uma amostra de sangue ou LCR foi retirada e introduzida no antígeno que foi a cardiolipina extraída do músculo ou coração bovino. Anticorpos não específicos treponêmicos reagem com o lipídio & # x02013 a reação de Wassermann (WR) de anticorpos antifosfolipídios (APAs)

A intensidade da reação (classe 1, 2, 3 ou 4) indica a gravidade da condição

Os NTTs mais recentes, como os testes de reagina plasmática rápida (RPR) e VDRL, geralmente os substituíram.


Resumo Executivo e Histórico

Sumário executivo

Os testes sorológicos para a síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) estão agora amplamente disponíveis. Ao contrário dos testes de amplificação de ácido nucléico (NAAT), que detectam o RNA viral, os ensaios baseados em anticorpos medem a resposta imune humoral do hospedeiro à infecção atual ou passada. Os anticorpos anti-SARS-CoV-2 geralmente se tornam detectáveis ​​mais de duas semanas após o início dos sintomas (Figura 1). Como resultado, a sorologia SARS-CoV-2 carece de sensibilidade suficiente para excluir com segurança o diagnóstico de doença coronavírus 2019 (COVID-19) quando os anticorpos não são detectados na fase aguda da doença. NAAT continua a ser a modalidade diagnóstica de escolha para infecção aguda. O teste de anticorpos, no entanto, pode ser útil como um complemento ao NAAT em momentos posteriores após a infecção. Em geral, os testes de IgM tendem a ter menor sensibilidade para detectar infecções anteriores do que os testes de IgG ou anticorpos totais. Ensaios projetados para detectar e diferenciar IgM e IgG em combinação, onde a detecção de IgM ou IgG é usada para definir um resultado de teste positivo, e os testes de IgA tendem a ter menor especificidade para detectar infecção passada em comparação com apenas IgG ou testes de anticorpos totais. A especificidade do teste é especialmente importante para grandes estudos de sorovigilância, quando se espera que a prevalência de infecção anterior na comunidade seja baixa. Para ter valor, os testes de anticorpos anti-SARS-CoV-2 devem ter alta sensibilidade e especificidade clínica (ou seja, & gt 99,5%).

Além do uso em estudos epidemiológicos, o painel identificou dois cenários clínicos em que o teste de anticorpos foi considerado como tendo utilidade potencial para o diagnóstico. O teste sorológico pode ser útil na avaliação de pacientes individuais com alta suspeita clínica de COVID-19 quando os resultados do teste de diagnóstico molecular são repetidamente negativos ou esse teste não foi realizado. A sensibilidade e especificidade de IgG e anticorpos totais são ideais três a quatro semanas após o início dos sintomas. No momento, existem poucos dados na quinta semana após o início dos sintomas para julgar o desempenho do teste sorológico em períodos posteriores após a infecção. A detecção de anticorpos anti-SARS-CoV-2 também é útil para avaliações de suspeita de síndrome inflamatória multissistêmica em crianças. Para pacientes sintomáticos, a interpretação ideal do resultado da sorologia requer a determinação cuidadosa do momento do teste em relação ao início dos sintomas, combinada com avaliações da gravidade da doença. Com base nas evidências disponíveis no momento, os testes sorológicos não devem ser usados ​​para determinar a imunidade ou o risco de reinfecção. Portanto, a detecção de anticorpos anti-SARS-CoV-2 não pode informar decisões para interromper o distanciamento físico ou diminuir o uso de equipamento de proteção individual.

A seguir, são resumidas recomendações e comentários específicos relacionados ao uso do teste sorológico SARS-CoV-2 na prática clínica e na saúde pública. Uma descrição detalhada dos antecedentes, métodos, resumo das evidências e fundamentos que apóiam cada recomendação pode ser encontrada online no texto completo.

Recomendações

  • Recomendação 1:O painel da IDSA sugere contra o uso de testes sorológicos para diagnosticar a infecção por SARS-CoV-2 durante as primeiras duas semanas (14 dias) após o início dos sintomas (recomendação condicional, certeza de evidência muito baixa).
  • Recomendação 2:Quando a infecção por SARS-CoV-2 requer confirmação laboratorial para fins clínicos ou epidemiológicos, to painel IDSAsugere tteste de SARS-CoV-2 IgG ou anticorpo total três a quatro semanas após o início dos sintomas para detectar evidências de infecção anterior por SARS-CoV-2 (recomendação condicional, certeza de evidência muito baixa).
    • Comentário & ndash Quando a sorologia está sendo considerada como um complemento do NAAT para diagnóstico, o teste de três a quatro semanas após o início dos sintomas maximiza a sensibilidade e especificidade para detectar infecção passada.
    • Comentário & ndash Os estudos de sorovigilância devem usar ensaios com alta especificidade (ou seja, & gt 99,5%), especialmente quando se espera que a prevalência de SARS-CoV-2 na comunidade seja baixa.
    • Comentário & ndash Os testes de combinação de IgM ou IgG são aqueles em que a detecção de qualquer uma das classes de anticorpos é usada para definir um resultado positivo.
    • Comentário & ndash Quando a sorologia está sendo considerada como um complemento do NAAT para diagnóstico, o teste de três a quatro semanas após o início dos sintomas maximiza a sensibilidade e especificidade para detectar infecção passada.

    Fundo

    Desde o seu surgimento em dezembro de 2019, a síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) causou mais de 21 milhões de infecções conhecidas e quase 770.000 mortes em todo o mundo [1]. O diagnóstico definitivo da doença coronavírus 19 (COVID-19), a doença causada pela infecção por SARS-CoV-2, depende da detecção direta de RNA específico do vírus ou antígenos glicoproteicos específicos do vírus em amostras do trato respiratório. Os testes sorológicos que detectam a resposta do anticorpo do hospedeiro ao SARS-CoV-2 também podem ajudar a confirmar a presença de infecção atual ou passada usando amostras de sangue.

    Os genomas do coronavírus codificam quatro proteínas estruturais principais, incluindo pico (S), envelope (E), membrana (M) e nucleocapsídeo (N). As proteínas S e N do SARS-CoV-2 demonstraram ser imunogênicas em humanos e os testes sorológicos atuais têm como alvo os anticorpos direcionados contra esses antígenos [2]. A proteína S é a proteína viral mais exposta e é responsável pela adesão viral e entrada na célula hospedeira através da ligação ao receptor da enzima conversora de angiotensina 2 (ACE-2) [3]. A proteína S é composta por uma subunidade S1 do terminal N, envolvida na ligação do receptor do vírus, e uma subunidade S2 do terminal C que está envolvida na fusão com a membrana da célula hospedeira. A subunidade S1 é ainda dividida no domínio do terminal N (NTD) e um domínio de ligação ao receptor (RBD). Tem havido um foco particular no SARS-CoV-2 RBD para o desenvolvimento de vacinas e terapias com anticorpos direcionados porque os anticorpos neutralizantes contra esta região bloqueiam efetivamente a entrada viral [4, 5]. A proteína N é uma proteína de ligação ao RNA que é abundantemente expressa durante a infecção e desempenha um papel importante na transcrição e replicação do RNA [6].

    Existem dois tipos gerais de anticorpos, anticorpos neutralizantes (nAbs) e não neutralizantes (também conhecidos como anticorpos de ligação) [7]. A neutralização é definida como a perda de infectividade que ocorre quando um nAb se liga a uma partícula viral. Os nAbs específicos de vírus ou induzidos por vacina podem desempenhar um papel crucial no controle da infecção viral, mas faltam dados definitivos para saber se os indivíduos com nAbs anti-SARS-CoV-2 detectáveis ​​estão protegidos contra a reinfecção. Em comparação, os anticorpos de ligação são caracterizados por sua incapacidade de prevenir a infecção viral de células permissivas. Independentemente de sua função, os dois tipos de anticorpos específicos para vírus são potencialmente úteis como indicadores de diagnóstico de infecção atual ou passada.

    Os testes de anticorpos anti-SARS-CoV-2 comercialmente disponíveis usam tecnologias diferentes para medir qualitativamente as classes de imunoglobulinas únicas (IgM, IgG ou IgA) ou anticorpos totais, mas não diferenciam nAbs de anticorpos de ligação. Os anticorpos IgM dirigidos contra microrganismos são normalmente produzidos primeiro após a infecção e são usados ​​como uma medida de infecção recente. Os anticorpos IgG geralmente se desenvolvem mais tarde após a IgM e permanecem elevados por meses a anos após a infecção. Embora os anticorpos IgM possam ser detectados nas primeiras duas semanas de sintomas em alguns pacientes, a infecção por SARS-CoV-2 parece incomum, pois IgM e IgG mais comumente aumentam juntos, mais de duas semanas após o início dos sintomas [8]. A IgA secretora é importante para a imunidade da mucosa. IgA também pode ser detectada sistemicamente em certos tipos de infecção, incluindo SARS-CoV-2, mas comparativamente pouco se sabe sobre a cinética de IgA no sangue. Os componentes do & ldquototal anticorpo & rdquo presumivelmente incluem IgM e IgG e, teoricamente, outras imunoglobulinas específicas do antígeno também.

    Dado que a maioria da população foi previamente exposta a coronavírus humanos sazonais (HCoV), e esses vírus podem compartilhar uma estrutura semelhante com o SARS-CoV-2, uma parte essencial do desenvolvimento e validação do teste sorológico é garantir que o anti-SARS Os anticorpos -CoV-2 detectados por um determinado ensaio não apresentam reação cruzada com outros coronavírus (por exemplo, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43 ou HCoV-HKU1). Os estudos de especificidade normalmente envolvem a análise de soros arquivados obtidos antes da identificação de COVID-19 como uma entidade clínica, bem como a avaliação de potenciais substâncias interferentes, como autoanticorpos ou anticorpos heterófilos.

    As plataformas de diagnóstico clínico mais comuns utilizadas para SARS-CoV-2 incluem dispositivos de fluxo lateral (LF), ensaios imunoenzimáticos (ELISA) e imunoensaios quimioluminescentes (CIA). Os ensaios de fluxo lateral normalmente requerem uma gota de sangue (ou soro ou plasma) aplicada a uma tira de teste, com resultados lidos em aproximadamente 15-30 minutos. Esses dispositivos são adequados para testes de ponto de atendimento e têm potencial para serem implantados no campo como parte de grandes levantamentos sorológicos. O ELISA vem em uma variedade de formatos diferentes.Normalmente, um complexo antígeno-anticorpo ligado é detectado usando um anticorpo secundário específico do tipo ligado a um substrato que gera um sinal colorimétrico ou fluorescente. Os métodos CIA são semelhantes ao ELISA, mas usam sondas químicas que emitem luz em vez de substratos enzimáticos. Tanto o ELISA quanto o CIA são métodos baseados em laboratório clínico que podem ser corrigidos para testes de alto rendimento usando soro, plasma ou manchas de sangue potencialmente secas. No momento, os ensaios de neutralização são usados ​​principalmente em ambientes de pesquisa ou oferecidos como testes desenvolvidos em laboratório por laboratórios de referência.

    Nos Estados Unidos, a Food and Drug Administration (FDA) atualmente exige a Emergency Use Authorization (EUA) para comercializar um teste de anticorpos SARS-CoV-2. Isso significa que os fabricantes comerciais e laboratórios clínicos com testes desenvolvidos em laboratório devem enviar os dados de desempenho ao FDA para revisão. No início da pandemia, no entanto, a revisão oficial da EUA foi voluntária. Esperava-se apenas que os desenvolvedores de teste validassem internamente seus testes e notificassem o FDA sobre sua intenção de comercializar. Como resultado, o mercado foi inundado com ensaios de baixo desempenho. Em resposta, o FDA posteriormente emitiu uma lista de testes & ldquoremoved & rdquo que inclui testes onde foram identificados problemas significativos de desempenho, testes para os quais a revisão oficial da EUA não foi submetida de forma apropriada ou testes retirados voluntariamente pelo desenvolvedor.

    Muitos testes sorológicos diferentes para SARS-CoV-2 tornaram-se comercialmente disponíveis em um curto espaço de tempo. A incrível velocidade de desenvolvimento ultrapassou significativamente as avaliações rigorosas de desempenho de teste. Portanto, IDSA convocou um painel de especialistas para revisar sistematicamente a literatura sorológica disponível, comparar estimativas agrupadas de precisão de teste e fazer recomendações baseadas em evidências para uso informado na prática clínica.


    Conclusões

    O rápido desenvolvimento e implementação de uma variedade de ensaios diagnósticos é, sem dúvida, uma parte essencial da resposta coordenada a um novo patógeno. No entanto, as limitações de novos ensaios e da compreensão dos médicos sobre eles devem ser consideradas. 4,5 Até onde sabemos, este é o primeiro estudo a investigar a resposta interpretativa dos médicos à nova sorologia para SARS-CoV-2. Existem limitações significativas no desenho de nosso estudo, tanto em nosso modesto número de respostas à pesquisa quanto na necessidade de desenho e implementação rápidos devido à natureza em evolução da pandemia. Como os comentários em texto livre eram opcionais, sua análise também é limitada. No entanto, destacamos que é provável que haja uma variação acentuada na interpretação clínica dos resultados da sorologia SARS-CoV-2 à medida que se tornam disponíveis. Mais pesquisas nesta área são necessárias com urgência, pois isso pode ter sérias implicações para os esforços contínuos de saúde pública para manter as medidas de distanciamento social e o isolamento dos pacientes afetados pelo COVID-19. O suporte interpretativo proativo, que inclui "comentários narrativos" de especialistas em doenças infecciosas e de laboratório, é fortemente recomendado (Quadro 1).

    Exemplos de comentários interpretativos que podem ser úteis para relatar a sorologia SARS-CoV-2


    Desenvolvimento e validação de um painel de teste sorológico para detecção de infecção pelo vírus de Powassan em pacientes norte-americanos residentes em regiões onde a doença de Lyme é endêmica

    FIG 1 Titulação de amostras de doença transmitida por carrapatos de fase aguda (TBD) em ensaio de imunofluorescência indireta (IFA) para determinar diluições de triagem ideais. (a) Diluições em série de 2 vezes de amostra de TBD de fase aguda com teste de neutralização por redução de placa (PRNT) do vírus de Powassan (POWV) título de 1: 320 para determinar a diluição de triagem ideal para IFA IgM. (b) Diluições em série de 2 vezes da amostra TBD de fase aguda com título POWV PRNT de 1: 160 para determinar a diluição de triagem ideal para IgG IFA.
    Amostra
    não.
    Resultado para o ensaio:
    TBE-C EIA
    IgM
    POWV IFA
    IgM
    TBE-C EIA
    IgG
    POWV IFA
    IgG
    POWV PRNT90
    título
    1+ND b WL≥1:401:5,120
    2+WL+≥1:401:640
    3+WL+≥1:401:2,560
    4WL≥1:20+≥1:401:320
    5+≥1:20WL≥1:401:5,120
    6WL≥1:20+≥1:1001:10,240
    7+WL+≥1:1001:40,960
    8WLWLWLWL1:20
    9+≥1:20WL≥1:401:20

    Especificidade analítica.

    FIG 2 Amostras de plasma receptor da vacina contra o vírus da febre amarela (YFV) no ensaio de imunofluorescência indireta (IFA) do vírus de Powassan (POWV) para determinar diluições de triagem ideais para eliminar a reatividade cruzada. (Topo) Amostra YFV IgG-positiva 7 anos após a vacinação testada em diluições 1:20 (esquerda) e 1:40 (direita) em IFA IgG. (Embaixo) Amostra YFV IgM-positiva 4 semanas após a vacina testada em diluições 1:10 (esquerda) e 1:20 (direita) em POWV IgM IFA.

    Teste sorológico

    Nossos editores irão revisar o que você enviou e determinar se o artigo deve ser revisado.

    Teste sorológico, também chamado teste de sorologia ou teste de anticorpos, qualquer um dos vários procedimentos laboratoriais realizados numa amostra de soro sanguíneo (o líquido límpido que se separa do sangue quando se permite a coagulação) com o objetivo de detectar anticorpos ou substâncias semelhantes a anticorpos que surgem especificamente em associação com determinadas doenças. Existem diferentes tipos de testes sorológicos - por exemplo, testes de floculação, testes de neutralização, testes de inibição da hemaglutinina, testes de imunoabsorção enzimática (ELISAs) e imunoensaios de quimioluminescência.

    Entre os testes de floculação, os testes de fixação de complemento são os mais comuns. Eles se baseiam na precipitação, ou floculação, que ocorre quando um anticorpo e antígenos especialmente preparados (substâncias que provocam a produção de anticorpos no corpo) são misturados. Os testes de neutralização dependem da capacidade de um anticorpo neutralizar as propriedades infecciosas dos organismos infecciosos. Os testes de inibição da hemaglutinina são baseados na capacidade dos vírus de fazer com que os glóbulos vermelhos de certas espécies animais se aglutinem (congele ou se agrupem), essa aglutinação será evitada pelo anticorpo. ELISAs fazem uso de fluorescência, luz (quimioluminescente) ou detecção de sinal colorimétrico - os sinais são produzidos por reações enzimáticas que ocorrem durante a detecção e quantificação de um antígeno ou anticorpo específico em uma solução. Os imunoensaios de quimioluminescência são baseados na detecção de sinais luminosos emitidos por reações químicas entre enzimas ou sondas químicas que se ligam a anticorpos.

    O teste sorológico é particularmente útil no diagnóstico de certas doenças bacterianas, parasitárias e virais, incluindo febre maculosa, gripe, sarampo, poliomielite, febre amarela e mononucleose infecciosa. Também é útil na detecção de autoanticorpos (anticorpos prejudiciais que atacam componentes do corpo) que estão envolvidos em doenças autoimunes, como a artrite reumatóide. Como uma ferramenta prática de triagem em massa, o teste sorológico provou ser valioso na detecção de doenças como sífilis, HIV / AIDS e doenças infecciosas epidêmicas e pandêmicas (por exemplo, influenza e doença coronavírus). Veja também análise de sangue.

    The Editors of Encyclopaedia Britannica Este artigo foi revisado e atualizado mais recentemente por Kara Rogers, Editora Sênior.


    Fundo

    A infecção com coronavírus 2 de síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) inicia uma resposta imune humoral que produz anticorpos contra antígenos virais específicos, como a proteína nucleocapsídeo (N) e a proteína spike (S), que incluem anticorpos anti-proteína S específicos que têm como alvo a subunidade da proteína S1 spike & rsquos e os domínios de ligação ao receptor (RBD). Os testes sorológicos podem detectar a presença desses anticorpos no soro dentro de alguns dias a semanas após a infecção aguda. No entanto, o teste sorológico não deve ser usado para diagnosticar a infecção aguda por SARS-CoV-2. Os testes sorológicos podem identificar pessoas com infecção por SARS-CoV-2 em resolução ou passada e, assim, ajudar os cientistas e especialistas em saúde pública a entender melhor a epidemiologia de indivíduos com SARS-CoV-2 e populações com maior risco de infecção. Embora os correlatos imunológicos de proteção não sejam totalmente compreendidos, as evidências indicam que o desenvolvimento de anticorpos após a infecção provavelmente confere algum grau de imunidade à infecção subsequente por pelo menos 6 meses. No entanto, não se sabe até que ponto as variantes virais emergentes podem afetar a imunidade de infecções subsequentes.


    Roadblocks para o sucesso

    Preocupações com a precisão e dúvidas sobre as diretrizes de autorização geraram hesitação entre os laboratórios clínicos que realizam testes de sorologia. Grande parte dessa incerteza é baseada em dados limitados. Ironicamente, as aplicações diretas dos testes de sorologia criam obstáculos inerentes para responder a essas perguntas. Quando os laboratórios estão tomando decisões em tempo real sobre a alocação de recursos, tempo e experiência, o fato de o teste serológico não se destinar ao uso diagnóstico é impactante. Os laboratórios dos hospitais devem priorizar a identificação de casos agudos de doenças, a fim de conter a disseminação da doença e fornecer tratamento eficaz para pacientes em estado crítico. Em suma, os estudos de vigilância são úteis para fins epidemiológicos, mas não a primeira prioridade em situações de triagem. É por isso que os testes de sorologia estão sendo realizados predominantemente em grandes laboratórios clínicos e instalações de pesquisa no momento.

    É, portanto, valioso concluir com um resumo dos atuais usos recomendados para o teste de sorologia.

    Quando o teste de sorologia COVID-19 deve ser usado

    • A principal aplicação do teste sorológico é a identificação de indivíduos que foram previamente infectados com SARS-CoV-2. Esse conhecimento pode ser usado para orientar estudos de epidemiologia e soroprevalência, bem como facilitar o rastreamento de contatos.
    • Os testes de sorologia também podem ser usados ​​para identificar potenciais doadores de plasma convalescentes e para avaliar a resposta imune a vacinas candidatas.
    • Finalmente, existe potencial para testes de sorologia para auxiliar no diagnóstico de COVID-19 em pacientes RT-PCR negativos que se apresentam posteriormente durante o curso da doença.

    Quando o teste de sorologia COVID-19 NÃO deve ser usado

    • O teste sorológico não deve ser usado para diagnosticar casos agudos ou recentes de COVID-19.
    • No momento, os testes de sorologia não podem ser usados ​​para determinar definitivamente se um paciente desenvolveu imunidade protetora.
    • Devido às limitações acima, o teste de sorologia SARS-CoV-2 não deve ser usado para orientar o uso de equipamento de proteção individual (EPI) ou a adesão a práticas de distanciamento social.

    “Na ausência de terapias aprovadas e comprovadas, o diagnóstico torna-se particularmente importante”, disse o Dr. Bertuzzi. & ldquo70% das decisões dos médicos & rsquo são baseadas em testes realizados no laboratório. & rdquo Mas precisamos continuar a ser cautelosos.

    “Precisamos ser claros sobre para que servem os testes e precisamos fazer ciência cuidadosa para não desperdiçar desnecessariamente os recursos que desenvolvemos”, acrescentou o Dr. Gerberding. & ldquoNós & rsquimos nada perto da imunidade de rebanho, então precisamos encontrar outras soluções para reiniciar nossa economia. & rdquo A Sociedade Americana de Microbiologia desenvolveu procedimentos passo a passo para ajudar os laboratórios a desenvolver protocolos de verificação eficientes e eficazes para os ensaios sorológicos COVID-19.


    Laboratório 17: Sorologia, testes sorológicos diretos e indiretos - Biologia

    Examinamos prospectivamente a eficácia dos testes de diagnóstico para anaplasmose em pacientes com suspeita de diagnóstico na França. PCR (sensibilidade 0,74, especificidade 1) foi o teste mais adequado. A sorologia teve uma especificidade mais baixa, mas uma sensibilidade mais alta ao testar amostras agudas e convalescentes. PCR e sorologia devem ser usados ​​em combinação para o diagnóstico de anaplasmose.

    A anaplasmose granulocítica humana (HGA) é uma infecção bacteriana intracelular transmitida por carrapato causada por Anaplasma phagocytophilum. A doença está presente na América do Norte, Europa e norte da Ásia, áreas com Ixodes ricinus carrapatos, o principal vetor de transmissão aos humanos (1,2) As manifestações clínicas da doença incluem febre aguda, cefaleia e mialgia que ocorrem 2–3 semanas após a picada do carrapato. O diagnóstico requer o isolamento de A. phagocytophilum em hemocultura, a presença de mórulas em células polimorfonucleares após coloração de May Grünwald-Giemsa de esfregaços de sangue periférico, resultados sorológicos positivos (soroconversão ou alto título de anticorpos específicos) ou um resultado positivo A. phagocytophilum Resultado de PCR. O teste de coloração May Grünwald-Giemsa tem uma sensibilidade baixa (3) A PCR e a sorologia estão mais amplamente disponíveis, mas seu valor diagnóstico não está bem estabelecido. O objetivo do nosso estudo foi comparar os valores diagnósticos dos testes microbiológicos disponíveis em uma série de pacientes selecionados prospectivamente com sinais e sintomas clínicos consistentes com um diagnóstico de HGA.

    O estudo

    Neste estudo prospectivo e multicêntrico, recrutamos pacientes sintomáticos que vivem na Alsácia, uma região do nordeste da França onde as doenças transmitidas por carrapatos são altamente endêmicas. Os pacientes forneceram consentimento informado por escrito para participar de nosso estudo, que foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital Universitário de Estrasburgo (Estrasburgo, França).

    Incluímos pacientes se eles tivessem uma das seguintes combinações de sinais e sintomas ocorrendo no máximo 4 semanas após uma picada de carrapato: 1) febre ou outro sintoma presumivelmente relacionado a uma picada de carrapato, 2) febre mais trombocitopenia com ou sem leucopenia ou elevação níveis de enzimas hepáticas, 3) trombocitopenia com ou sem leucopenia, ou 4) níveis elevados de enzimas hepáticas sem febre. A primeira visita incluiu avaliações clínicas e epidemiológicas e a coleta de amostras de sangue para A. phagocytophilum sorologia, coloração de May Grünwald-Giemsa e A. phagocytophilum– PCR específico. Nós não cultivamos para A. phagocytophilum. Também foi realizada investigação etiológica para obtenção do diagnóstico diferencial. Após & gt 4 semanas, uma segunda visita foi agendada para obter uma avaliação clínica, A. phagocytophilum serologia e (se necessário) um diagnóstico diferencial completo.

    Nós estratificamos os pacientes em 3 grupos com base em seus diagnósticos. Um grupo incluiu controles, que eram pacientes com diagnóstico de não-anaplasmose confirmado clínica e microbiologicamente. O segundo grupo incluiu pacientes com anaplasmose definidos por & gt 1 dos seguintes critérios: mórulas intraleucocitárias em esfregaços de sangue, um resultado de PCR positivo para Anaplasma, um título de anticorpo aumentado em 4 vezes para A. phagocytophilum na amostra de acompanhamento ou uma soroconversão (isto é, mudança no título de anticorpo de negativo na primeira amostra para & gt 1:64 na segunda amostra), ou um alto título de anticorpo para Anaplasma (& gt 1: 256) por ensaio de anticorpo de imunofluorescência indireta. O terceiro grupo era de pacientes sem nenhum diagnóstico.

    Realizamos extração de DNA, PCR e testes sorológicos cegos para a identificação da amostra, conforme descrito anteriormente (4) O PCR direcionou o A. phagocytophilum msp2 / p44 gene. Realizamos testes sorológicos usando o Anaplasma phagocytophilum Ensaio IFA IgG (Focus Diagnostics, http://www.focusdx.com) (4) Uma equipe treinada examinou preparações de esfregaço corado com May Grünwald-Giemsa de amostras de sangue total para mórulas intracelulares. Coletamos os dados usando o EpiData versão 3.1.2701.2008 (http://epidata.dk) e extraímos os dados para planilhas do Excel (Microsoft, https://www.microsoft.com) para análise. Após a estratificação do paciente, estimamos a sensibilidade e especificidade dos diferentes testes diagnósticos.

    Figura. Distribuição de resultados de testes diagnósticos positivos para pacientes com anaplasmose granulocítica humana confirmada, França, maio de 2010 a julho de 2012.

    Durante maio de 2010 a julho de 2012, inscrevemos 155 pacientes no estudo, 25 dos quais não concluíram a segunda visita. Nenhum desses 25 pacientes teve um resultado de PCR positivo ou um título de anticorpo & gt 1: 256 na primeira visita. Os 130 pacientes restantes completaram ambas as visitas do estudo e, portanto, foram incluídos na avaliação do estudo. Destes 130 pacientes, 19 tiveram diagnósticos de anaplasmose confirmados e 36 eram controles com diagnósticos de não-anaplasmose confirmados (infecções com Borrelia burgdorferi, Vírus Epstein-Barr, citomegalovírus, HIV, vírus da encefalite transmitida por carrapatos, Leptospira spp., Babesia spp., parvovírus B19, hantavírus, Francisella tularensis, Plasmodium spp., e Aeromonas spp.). Dos pacientes com HGA, 84,2% (16/19) preencheram os critérios sorológicos e 73,7% (14/19) preencheram os critérios da PCR (Tabela Figura). Febre, o sintoma mais frequente (89%), esteve associado a dores articulares e musculares. Citopenia de plaquetas, neutrófilos ou ambos (74%) e níveis elevados de enzimas hepáticas (63%) estavam freqüentemente presentes.

    Os cálculos do valor diagnóstico de cada método de teste mostraram que a PCR teve uma sensibilidade de 0,74 e uma especificidade de 1 e a coloração por esfregaço de sangue teve uma sensibilidade de 0,21 e uma especificidade de 1. A soroconversão ou um aumento de 4 vezes do título de anticorpos teve uma sensibilidade de 0,32 e especificidade de 0,97, um título de anticorpo & gt 1: 256 teve uma sensibilidade de 0,58 e especificidade de 0,97, e a sorologia geral teve uma sensibilidade de 0,84 e especificidade de 0,97.

    O intervalo entre o primeiro e o segundo teste sorológico para a maioria dos pacientes no grupo de anaplasmose foi de 4-8 semanas (média de 49,8 dias). Cinco pacientes realizaram o segundo teste & gt8 semanas após o primeiro. Destes pacientes, 2 soroconvertidos, 1 experimentou uma diminuição substancial no título de anticorpos, 1 experimentou um aumento substancial na semana 12 e 1 teve um título de anticorpos estável.

    Nosso estudo confirma a PCR como o padrão ouro para o diagnóstico de HGA, este teste permitiu um diagnóstico rápido durante a fase aguda da infecção, com boa sensibilidade e excelente especificidade. No entanto, a ausência de um teste diagnóstico padrão ouro para comparar nossos resultados é uma limitação do nosso estudo. A. phagocytophilum a cultura é o teste de referência para o diagnóstico de HGA (5,6), mas não é adequado para uso rotineiro porque a cultura é demorada e não é amplamente realizada. O diagnóstico de anaplasmose frequentemente envolve a avaliação da presença de mórulas, mas este teste tem baixa sensibilidade (3) Em nosso estudo, esse teste foi de valor limitado para o diagnóstico de HGA porque sempre que foram detectadas mórulas em esfregaços de sangue & gt 1, os outros testes de diagnóstico foram positivos. No entanto, a coloração de May Grünwald-Giemsa é o teste mais rápido a fazer e, quando realizado por uma equipe treinada, os resultados positivos são úteis para os médicos.

    Na prática clínica, o diagnóstico de HGA muitas vezes depende da sorologia (79), mas 2 limitações estão associadas a este método: um risco de resultados falso-negativos durante o estágio agudo da infecção porque A. phagocytophilum os anticorpos são detectados em média 11,5 dias após o início dos sintomas e um risco de resultados falso-positivos porque Anaplasma os anticorpos são detectáveis ​​em 86,4% dos pacientes por 6 a 10 meses e em 40% dos pacientes até 2 anos após a infecção inicial (10) Os critérios sorológicos positivos são soroconversão, um aumento de 4 vezes no título de anticorpos ou um título de anticorpos estável e alto (11,12) Em nosso estudo, observamos que cada um desses critérios pode levar a erros de diagnóstico no início da infecção, conforme relatado anteriormente (13).

    PCR é considerado o método de diagnóstico mais eficaz durante o estágio inicial A. phagocytophilum infecção (14,15) Nossos resultados confirmam essa crença, apesar de nossa limitação de uma pequena população de estudo. No entanto, se o PCR for usado sozinho, o HGA pode ser subdiagnosticado.

    Conclusões

    A apresentação de febre em um paciente com história de picada de carrapato não se qualifica para um diagnóstico de anaplasmose. É necessário realizar exames microbiológicos. Para anaplasmose, o teste de PCR parece ser a ferramenta de diagnóstico mais eficaz. No entanto, a sensibilidade da PCR é & lt100%, e a combinação da PCR com o teste sorológico na primeira visita parece ser a melhor estratégia para o diagnóstico precoce de anaplasmose aguda. Em casos de alta suspeita de HGA em pacientes sem qualquer diagnóstico na primeira visita, um segundo teste sorológico & gt 4 semanas depois pode ser útil. Uma abordagem multiplex também pode ser usada em tais casos para procurar diagnósticos diferenciais.

    O Dr. Hansmann é chefe do Departamento de Doenças Infecciosas do Hospital Universitário de Estrasburgo, Estrasburgo, França, membro do grupo Borreliose da Sociedade Europeia de Microbiologia Clínica e Doenças Infecciosas e está envolvido na concepção do diagnóstico nacional de doenças transmitidas por carrapatos e plano de saúde para a França. Seus interesses de pesquisa são doenças transmitidas por carrapatos e diagnóstico.

    Reconhecimento

    Este estudo foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Clínica do Hospital Francês (PHRC HUS 2007–3960).


    Assista o vídeo: MÉTODOS DIAGNÓSTICOS IMUNOLÓGICOS- Teste de Elisa e PCR (Dezembro 2022).